猪精液冷冻与常温保存技术的研究

为研究冷冻保存和常温((17±0.5)℃)保存后猪精子活率、活力和顶体完整率,比较了猪精液冷冻稀释液中2种甘油含量细管法的快速冷冻效果,以及不同解冻温度对冷冻精液的影响,采用细胞计数法、FDA-PI双重染色法与Giemsa染色方法检测精子的活率、活力和顶体完整率。结果显示:3%(体积分数,下同)甘油冷冻解冻后精液的活率、活力(38.54%、52.24%)显著(P<0.05)高于2%甘油组(15.63%、28.22%),但3%甘油组顶体完整率(11.55%)显著(P<0.05)低于2%甘油组(21.71%)。38℃水浴解冻后的精子在39℃培养箱中4 h内活率高于0.3,而50℃水浴解冻后1 h后的活率低于0.3。精液稀释液Anderohep和BTS在常温((17±0.5)℃)保存新鲜猪精子的活率与顶体完整率上效果相似,保存3 d内精子活率达0.6以上,保存6 d内精子活率为0.3以上。结果表明,使用3%甘油冷冻保存及2种常温保存稀释液均可以较好地保存精子。     

猪鲜精17℃保存剂效果对比试验

选择2种著名品牌猪精液常温保存稀释剂为对照组(对照一、对照二),试验组为本课题组经大量试验开发的猪精液常温保存稀释剂,旨在探讨研发的稀释剂对猪鲜精保存效果。试验结果表明,课题组研发的猪精液17℃常温保存稀释剂在有效保存时间和精子总存活时间方面均显著高于对照一组,而相对于对照二组,显著提高了大白种猪精液有效保存时间和精子总存活时间(P<0.05),其余各组差异均不显著(P>0.05)。试验中的3种不同稀释剂在前3d对精子质膜完整性均有较好保护作用, 3组间差异不显著(P>0.05);保存到第5天,试验组和对照二组中精子质膜完整性显著高于对照一组(P<0.05),但前2组之间质膜完整性无显著性差异(P>0.05);保存至第7天,对照一组、对照二组和试验组中精子质膜完整性分别为49.94±3.08, 58.83±2.22, 72.86±2.62,精子质膜完整性在该3组之间均存在差异显著性(P<0.05)。结果显示,在相同储存条件下,本课题组研制的精液常温保存剂对精液保存时间,质膜完整率等指标优于国内市场上著名品牌,且保存效果稳定。     

牛血清白蛋白对猪精液常温保存效果的影响

在猪人工授精技术中,良好的稀释液是提高精子活率的关键因素之一。为了研究牛血清白蛋白（BSA）对猪精液常温保存的影响,在基础液Modena中分别添加1、2、3、4、5和6 g/L 的BSA,检测精子活率、质膜完整率、顶体完整率以及总抗氧化能力（T AOC）和丙二醛（MDA）浓度,分析BSA对猪精液常温保存效果的影响。结果表明,Modena中添加3～5 g/L的BSA能显著延长猪精子有效保存时间、提高精子活率和质膜完整率、降低MDA的浓度（P<0.05）,但对顶体完整率和T AOC影响不大（P>0.05）,其中添加4 g/L的BSA效果最好,有效保存时间为7.5 d,经过7 d保存后精子活率、质膜完整率、顶体完整率分别为54%、49%和78%,T AOC和MDA的浓度分别为1.03 U/mL和17.51 μmol/L。研究结果说明,Modena中添加BSA能够提高常温保存精子的品质,其适宜添加量为4 g/L。     

6种鸡精液冷冻稀释液以及冻后保存条件比较

为探究不同稀释液对鸡精液冷冻保存效果的影响,选择LR、Lake’s、BPSE、Modified Sasaki、Beltsville和Nabi共6种稀释液对霞烟鸡精液进行冷冻,解冻后分别在37或4 ℃条件下短时间保存,分析不同冷冻稀释液和保存条件对精子活率、活力、功能完整性和抗氧化指标的影响。结果表明,6种稀释液中Lake’s稀释液的冻后活率、活力和顶体完整性最高,分别为48.20%、45.70%和45.26%;LR稀释液虽然获得了48.16%的冻后活率,但其活力显著低于Lake’s稀释液。解冻后4 ℃保存更适合鸡精子的短时间保存,Lake’s和Nabi稀释液在4 ℃条件下保存45 min后活力仍达30 %以上。虽然Nabi稀释液解冻初始时的精子活率和活力低于LR和Lake’s稀释液,但随着保存时间的延长,其冻后精子存活能力表现最佳。随着冻后保存时间的延长,LR、Lake’s和Nabi稀释液冻后精子的线粒体活性、质膜完整性和抗氧化能力均呈现下降趋势,且37 ℃保存时下降更为明显,同时LR稀释液在这些指标上表现出较差的耐受性。综上所述,Lake’s和Nabi冷冻稀释液对鸡精子冷冻保存的效果最佳;解冻后4 ℃保存可延长冻精的体外存活时间;LR稀释液虽获得了较高的冻后活率,但其活力和冻后耐保存性能较差。     

褐牙鲆精子生理特性及超低温冷冻保存

对褐牙鲆精子部分生理特性进行了研究,结果表明,褐牙鲆精浆pH值为(7.90±0.26),精子密度为(1.03×1010)/mL,精浆渗透压为(308.50±7.85) m Osm/kg,K+在精浆中的浓度为 (27±3) mmol/L,Na+在精浆中的浓度为(71±5) mmol/L.对不同盐度和pH与褐牙鲆精子活力和寿命的关系进行了研究,结果表明,在盐度为35,pH为8.0时,精子的活力最高,分别达到(93.33±5.67)%和(89±3.33)%,与其生活环境相适应;褐牙鲆精子寿命为(23±2) min,与已报道其它海水鱼精子寿命相近.分别采用室温(25 ℃)和低温(4 ℃)保存精子,发现精子在室温条件下,可存活4 d,在低温条件下可以存活7 d,证明低温可有效延长精子存活时间.另外,分别采用4种不同稀释液(S1、S2、S3、S4)与4种不同抗冻剂(DMSO、EG、Gly、PG)配制成冷冻保存液对褐牙鲆精子进行超低温冷冻保存研究.结果表明,以S3液作为稀释液,16%的DMSO作为抗冻剂,利用快速降温法对精子进行超低温冷冻保存,38 ℃水浴快速解冻,解冻后的精子获得最高的活力为(84±3.67)%,此方法可用于褐牙鲆精子的长期保存.     

高体革鯻精子超低温保存方法研究

[目的]对高体革鯻（Scortum barcoo）精子的超低温保存技术进行研究。[方法]首先,用精子活力为标准确定稀释液中NaCl和KCl的最佳浓度;然后,使用二甲亚砜和甘油分别作为抗冻剂,进行超低温保存试验,测定高体革鯻精子复活率和活力。[结果]稀释液中含0.750%NaCl和0.025%KCl时,效果最佳。当二甲亚砜浓度为10%,葡萄糖为5%时,精子复活率和活力分别达到了68.2%和60.7%,保存效果最佳。[结论]稀释液中NaCl和KCl的浓度,对精子活力有明显影响;使用二甲亚砜作为抗冻剂进行低温保存的效果优于甘油;在抗冻保护剂中加入适量葡萄糖会提高保存效果。     

不同浓度二甲双胍对猪精液液态保存效果的影响

[目的]研究不同浓度二甲双胍对猪精液液态保存效果的影响。[方法]在猪精液液态保存液中分别添加不同浓度(0.5、1.0、2.0、4.0 mmol/L)的二甲双胍,测定不同保存时间精子的活力、活率、质膜完整率、顶体完整率等指标。[结果]猪精液液态保存第3天,在不同浓度二甲双胍作用下各组间精子活力出现差异。第5天,添加1.0 mmol/L二甲双胍的保存液保存的精子活力达到38.03%,精子活率为49.03%,质膜完整率为43.91%,顶体完整率为50.88%,均高于对照组。[结论]添加二甲双胍有助于提高液态保存猪精液的质量,延长保存时间。     

不同稀释液对猪精液4℃保存效果的影响研究

[目的]利用改进的BF-5稀释液（命名为naBF5）,开发一种4℃液态保存猪精子的方法。[方法]把猪精子在LEN、BF5和mBF5这3种稀释液中4℃条件下保存5d,按照保存天数分别检测精子的活力、顶体形态、活率和ATP浓度并进行比较。[结果]在4℃条件下保存的1～2d,精子的活率在3种稀释液中没有显著的差异;但是第3天开始,3种稀释液中的精子活率有显著差异,在mBF5中保存的精子活率显著地高于在LEN和BF5中保存的精子。第1～5天,在mBF5和B巧稀释液中保存的精子正常顶体的百分率高于LEN稀释液中保存的精予;并且,在4℃保存5d后,在mBF5稀释液中保存的精子正常顶体的百分率要高于在BF5中保存的精子。在4℃条件下保存的第1～5天,mBF5稀释液中的精子活力百分率高于LEN和BF5稀释液保存的精子活力。在3种稀释液中,保存的第1～5天,精子活力的百分率都持续地降低。保存的第1～5天,mBF5稀释液中保存的精子ATP浓度比LEN和BF5稀释液中保存的高。保存5d之后3种稀释液中精子ATP浓度都迅速下降。[结论]在4℃条件下保存5d,与LEN和BF5稀释液相比,保存在mBF5稀释液中的精子表现出较高的活力、正常的顶体百分率、活率和ATP浓度。     

茶多酚对猪精液常温保存效果的影响

【目的】研究茶多酚(TPP)对猪精液常温保存效果的影响。【方法】手握法采集20月龄健康杜洛克种公猪精液,在基础稀释液中添加不同质量浓度的TPP(0(CK),0.01,0.02,0.04,0.08,0.16g/L)作为稀释液进行常温(17℃)保存,每隔24h检查精子活率、质膜完整率和顶体完整率,分别在精液保存0,2,4,6d时检测精液中的细菌含量,并在3d和6d时检测精液中的丙二醛含量(MDA)和总抗氧化(T-AOC)活性。【结果】添加0.02,0.04,0.08g/L TPP可明显提高猪精子活率、质膜完整率、顶体完整率和T-AOC活性,降低精液的MDA含量和细菌含量。且以0.04g/L TPP效果最佳,精液有效保存时间为6d。6d时0.04g/L TPP组猪精子活率、质膜完整率、顶体完整率、丙二醛(MDA)含量、总抗氧化(T-AOC)活性和细菌含量分别为60.02%,46.40%,75.25%,2.39nmol/L,2.31U/mL和2.19×106 CFU/mL。【结论】茶多酚能有效提高猪精液常温保存效果,最适添加量为0.04g/L。     

过滤方式及不同稀释液对驴精子低温保存活率的影响

为筛选合适的驴精子低温保存的条件和稀释液配方,本研究就稀释液过滤方式及添加不同浓度Vitamin C(VC)、Vitamin E(VE)和氧化石墨烯对驴精子低温保存的效果进行了研究。结果显示,以基础液过滤后再添加15%卵黄的过滤方式对驴精子的低温保存效果较好,在保存5 d后精子的活率仍然高于0.30,与基础液添加15%卵黄后过滤的稀释液和卵黄过滤后再按15%的体积百分比添加到基础液中的稀释液相比,差异均极显著(P0.01);添加200和300μg/100 mL VC的稀释液在保存8 d后,精子的活率仍然高于0.30,且显著高于添加100μg/100 mL VC的稀释液(P0.05);添加5%VE的稀释液对驴精子的低温保存效果较好,在保存10 d时,精子的活率仍接近0.30,且显著高于添加10%和15%VE的稀释液(P0.05);添加30%氧化石墨烯的稀释液对驴精子的低温保存效果较好,在保存8 d时,精子的活率仍然接近0.30,且显著高于添加20%和25%氧化石墨烯的稀释液(P0.05)。结果表明,基础液过滤后再添加卵黄的过滤方式、添加200μg/100 mL VC的稀释液或300μg/100 mL VC的稀释液、添加5%VE的稀释液、添加30%氧化石墨烯的稀释液对驴精子的低温保存效果较好。     

pH值及不同百分浓度NaCl溶液对齐口裂腹鱼精子活力的影响

为研究齐口裂腹鱼的精子活力,在显微镜下观察了不同pH值及不同浓度NaCl溶液中精子的运动时间和寿命.结果表明:齐口裂腹鱼精子对pH值的适应范围在5~9之间,pH值为7时精子的活力较好,快速运动时间为(42.56±1.81)s,精子寿命为(84.33±4.77)s;齐口裂腹鱼精子最适的NaCl溶液百分浓度为0.5%,其快速运动时间为(42.78±3.03)s,寿命为(119.89±11.75)s.在较低百分浓度的NaCl溶液中,精子寿命较长,但是快速运动时间较短,当NaCl百分浓度大于0.7%时,精子基本上会被抑制,加水稀释后精子被激活且不影响其活力.pH值过低或过高都会破坏精子的生理结构,使其死亡,0.8%~0.9%NaCl溶液可用作齐口裂腹鱼精液稀释剂室温暂时保存,且短时间内不会影响其活力.     

6种进口猪精液常温保存稀释粉的效果比较

为了解进口猪精液常温保存稀释粉的实际应用效果,选购市场上常见的6种进口稀释粉进行比较试验。结果表明:随着常温保存时间的延长,不同稀释粉组间,活力下降速度存在差异,其中DILTEC和CXM下降最快,PRIMXCELL组下降最慢。精子有效存活时间差异很大,由长到短的顺序为PRIMXCELLACTIYEXINZUANSpermProCXMDILTEC;总存活时间也是PRIMXCELL最长,达到384 h以上;保存120 h顶体完整率存在显著差异,从高到低顺序为PRIMXCELLSpermProXINZUANACTIYECXMDILTEC。说明法国的PRIMXCELL稀释粉最好,有效存活时间242 h,总存活时间384 408 h,保存120 h顶体完整率79.6%。     

金属离子及低温对中华倒刺鲃精子活力的影响

对中华倒刺鱼巴（Ｓｐｉｎｉｂａｒｂｕｓｓｉｎｅｎｓｉｓ）精子在金属离子处理和低温保存下精子活力的影响研究表明,在ＮａＣｌ和ＫＣｌ溶液的渗透压约为３０８Ｋｐａ时,精子的活力最强;当高于６８０．１Ｋｐａ后,精子活动完全被抑制。Ｃａ,Ｍｇ浓度较高对精子有一定的损伤作用。精液稀释比为１∶１或３∶１时,在０～２℃保存的效果较好。稀释液中添加２．６４％的甘油,能延长精子的寿命,添加３％的葡萄糖对保存也有利。     

牛磺酸与抗生素复合剂对猪精液常温保存效果的影响

牛磺酸(Tau)具有良好的抗氧化性,为研究Tau与抗生素联合使用对猪精液常温保存效果的影响,以不含抗生素Modena稀释液为对照基础液设计3组试验,设Modena稀释液+庆大霉素(2×10~5 IU)+复方新诺明(2.5×10~4 IU)为处理1,Modena基础液上分别添加0.5、1、5和10mmol/L的Tau为处理2,处理1配伍处理2则为处理3,每24h检测精子活率、顶体完整率、丙二醛(MDA)浓度以及总抗氧化能力(TAOC),分析Tau与抗生素复合剂对猪精液常温保存效果的影响。结果表明,处理3效果最好,处理2次之,处理1最差,各处理间差异显著,当处理3中Tau的添加量为5mmol/L时,猪精液保存5d后,精子活率为64.11%,顶体完整率为72.10%,T-AOC活性和MDA浓度分别为4.76U/mL和1.42nmol/mL。因此,Tau与抗生素复合剂可以提高猪精液的常温保存效果,最适添加浓度为5mmol/L。     

大豆卵磷脂替代卵黄的稀释液低温保存绵羊精液效果

为研究大豆卵磷脂稀释液对绵羊精液低温保存效果,用5个浓度的大豆卵磷脂(A1,1. 25%; A2,2. 5%; A3,5%;A4,7. 5%; A5,10%)替代TRIS专利稀释液(C组)中的卵黄进行绵羊精液低温保存试验,在保存第0 d、1 d、3 d、6 d、9 d、12 d对精子活率和顶体完整率进行检测,大豆卵磷脂稀释液效果最优组和C组的保存第9 d的精液进行人工授精试验。结果表明:A1组精液保存效果自保存第6 d起显著高于其他添加组(P 0. 05),且在保存第9 d精子活率为0. 53±0. 06,符合鲜精输精国家标准; A1组与C组在各时间点精子活率、顶体完整率差异均不显著(P 0. 05),且A1组与C组精子在第9 d活率都高于0. 5,顶体完整率高于60%; A1组与C组的受胎率64. 3%(72/112)、65. 6%(80/122)差异不显著(P 0. 05)。证明添加1. 25%浓度大豆卵磷脂的稀释液能够进行绵羊精液低温长时间有效保存。     

pH、盐度及K+、Ca2+和葡萄糖对萨罗罗非鱼精子活力的影响

[目的]确定萨罗罗非鱼精子活力最高时各因子的最佳参数,进一步提高尼罗罗非鱼♀×萨罗罗非鱼♂的受精率.[方法]利用显微镜观察对比不同梯度pH、盐度、离子及葡萄糖溶液中萨罗罗非鱼精子的活力状况,考察指标包括精子快速运动时间、寿命及激活率.[结果]pH 7.5～8.0时,萨罗罗非鱼精子激活率最高,达90％;在pH 7.5的条件下,精子快速运动时间和寿命最长,为66.33±2.25和933.17±25.79 s.在25‰～32‰的盐度范围内,萨罗罗非鱼精子活力较强,其中以30‰的精子活力最高,快速运动时间和寿命分别为63.50±2.35和402.50±7.31 s,激活率达90％.随K+浓度的增加,萨罗罗非鱼精子的快速运动时间、寿命及激活率均呈先升高后降低的变化趋势,其中以75mmol/L的精子活力最高,精子寿命为500.33±8.69 s,激活率为90％.Ca2+对萨罗罗非鱼精子活力有明显抑制作用,其浓度为37.8 mmol/L时精子快速运动时间和寿命最长,分别为38.50±2.43和117.50±3.21 s,精子激活率为80％;而后随Ca2+浓度的增加,精子开始出现聚集现象,活力明显下降,Ca2+浓度增至151.2mmol/L时,精子已完全失活.相对于K+和Ca2+,葡萄糖可适当延长萨罗罗非鱼精子寿命,其浓度为150mmol/L时,精子寿命最长,为281.00±5.90 s,激活率达90％.[结论]针对尼罗罗非鱼♀×萨罗罗非鱼♂人工繁殖中受精率低的问题,生产上除了选择优质尼罗罗非鱼卵细胞、优化孵化环境及人工繁殖技术外,还可通过适宜游动介质参数(pH 7.5～8.0、盐度30‰～32‰、75～100mmol/LK+、37.8 mmol/L Ca2+、100～125mmol/L葡萄糖)激活萨罗罗非鱼精子活力,进而提高其杂交受精率.     

夏季山羊精液不同保存方法研究

假阴道法采集重庆市大足黑山羊精液,分析鲜精精液品质,采取随机单位组两因素三水平无重复观察值方差分析试验设计,应用常温保存(20℃)、低温冷藏(4℃)和精液冷冻3种方式进行精液保存效果及对精液品质影响的研究.两因素分别为稀释液和精子密度,每个因素选择3个水平,以生存指数作为评价精液保存效果的指标.新鲜精液采集后检测发现品质良好,活力均值为0.87,畸形率为9.45%,符合GB20557-2006做山羊冻精标准.与去年同期比较,发现高温可造成精液品质下降.稀释液对3种保存效果影响差异均不显著(p0.05),精子密度对常温保存和低温冷藏影响差异极显著(p0.01),对冷冻影响差异不显著(p0.05).不同处理均造成精液品质下降,其中冷冻造成影响极显著.常温和冷藏下以稀释液A1、精子密度1×109个/mL保存较好,冷冻保存以稀释液A2、精子密度2×108个/mL较好.     

夏季山羊精液不同保存方法研究

假阴道法采集重庆市大足黑山羊精液,分析鲜精精液品质,采取随机单位组两因素三水平无重复观察值方差分析试验设计,应用常温保存(20℃)、低温冷藏(4℃)和精波冷冻3种方式进行精液保存效果及对精液品质影响的研究.两因素分别为稀释液和精子密度,每个因素选择3个水平,以生存指数作为评价精液保存效果的指标.新鲜精液采集后检测发现品质良好,活力均值为0.87,畸形率为9.45%,符合GB20557-2006做山羊冻精标准.与去年同期比较,发现高温可造成精液品质下降.稀释液对3种保存效果影响差异均不显著(p>0.05),精子密度对常温保存和低温冷藏影响差异极显著(p<0.01),对冷冻影响差异不显著(p>0.05).不同处理均造成精液品质下降,其中冷冻造成影响极显著.常温和冷藏下以稀释液At、精子密度1×109个/mL保存较好,冷冻保存以稀释液A2、精子密度2×108个/mL较好.     

胭脂鱼精子低温保存及其在人工授精中的应用

[目的]研究胭脂鱼精子的低温保存方法,为胭脂鱼的人工繁殖和人工授精提供基础依据。[方法]试验配制了A、B、C、D4种精子保存液,以0．7％的NaCl溶液作为对照,以精子被激活后的活率为指标,对4种精子保存液保存成熟的胭脂鱼精子的效果进行评价。[结果]在低温（0～4℃）条件下,4种精子保存液之间及其与对照溶液之间的差异比较明显。其中保存效果最好的是B液,能在120h内使精子的活率保持为80％;D液次之,能在84h内使精子的活率保持为80％。胭脂鱼在淡水中快速运动时间为（24．0±3．5）s,寿命为（128．0±9．5）s。2007～2008年精子保存B液在胭脂鱼的人工授精中进行应用,受精率为53％～85％。[结论]用精子保存液低温保存胭脂鱼精子的方法是切实可行的。     

大鳞大马哈鱼精子活力的观察

采集成熟的大鳞大马哈鱼精子,在不同的激活介质、人工精浆(ASP)、pH和温度条件下进行活力观察。结果表明:用生理盐水(BSS)激活的精子活力高于用水激活(P<0.05),单尾鱼的精子活力高于多尾混精(P<0.05);在ASP A,B和C液中,用ASP C液保存精子的效果最好(P<0.05);保持大鳞大马哈鱼精子活力较强的适宜pH值为8.19-8.40,而活力最强时pH值为8.40;在4℃下保存的大鳞大马哈鱼精子活力最高;大鳞大马哈鱼受精率最高时的温度和pH值分别为4℃和8.40,这与大鳞大马哈鱼精子活力最强时的温度和pH条件高度相关。