盐碱胁迫对尼罗罗非鱼鳃Na+/HCO3-共转运子、碳酸酐酶基因表达的影响

为了探讨盐碱胁迫条件下鱼类渗透生理调节机制,以尼罗罗非鱼(Oreochromis niloticus)为实验材料, PCR扩增得到了Na+/3HCO-共转运子(NBCe1)基因cDNA部分序列,比较了单盐(盐度10、盐度15)、单碱(1.5 g/L、3 g/L NaHCO3)、盐碱混合(盐度10,碱度1.5 g/L;盐度15,碱度3 g/L)胁迫后不同时间(0 h、6 h、12 h、24 h、48 h、72 h、96 h)血清渗透压、离子浓度(Na+、K+、Cl–、Ca2+)以及鳃碳酸酐酶(CA)活性、CA与NBCe1基因mRNA表达变化。结果显示,不同胁迫条件下,血清渗透压、离子浓度、鳃组织 CA 酶活、CA 与 NBCe1基因 mRNA 表达变化均与胁迫强度呈正相关。随时间推移,血清渗透压、离子浓度呈现先上升后下降的变化趋势,单盐、盐碱混合组血清渗透压值较单碱组高。单盐、单碱、盐碱混合组中, NBCe1基因mRNA在鳃中均呈略微上调,但不显著(P>0.05)。单碱组和盐碱混合组鳃CA活性较单盐组高,低盐碱胁迫(盐度10,碱度1.5 g/L)下CA活性较晚达最高值;不同胁迫条件下, CA基因mRNA表达均表现上调,单碱、盐碱混合组更为显著(P<0.05),推测CA较NBCe1对体内3HCO-转运作用更为显著。研究结果为尼罗罗非鱼盐碱适应生理调节提供了基础资料。     

不同尼罗罗非鱼尧奥利亚罗非鱼亲本群体的遗传特征分析

从86对尼罗罗非鱼遗传图谱标记中筛出17对种间差异性微卫星引物,分别对杂交亲本尼罗罗非鱼苏丹群体、新吉富群体、奥利亚罗非鱼以色列群体、茂名群体的遗传特征进行分析。结果表明,4个罗非鱼群体有效等位基因数：新吉富（2.8）>苏丹（2.72）、以色列（2.96）>茂名（2.6）;遗传杂合度：苏丹（0.73)>新吉富(0.68),以色列(0.89)>茂名(0.56);多态性含量：苏丹（0.58）>新吉富（0.51）,以色列（0.56）>茂名（0.52）,尼罗罗非鱼、奥利亚罗非鱼分别以新吉富、茂名群体遗传多样性较低。尼罗罗非鱼与奥利亚罗非鱼群体间平均遗传距离为0.3057。尼罗罗非鱼苏丹群体与新吉富群体间的遗传距离为0.107。奥利亚罗非鱼以色列群体与茂名群体间的遗传距离为0.1268。尼罗罗非鱼苏丹群体与奥利亚罗非鱼茂名群体间的遗传距离最大。     

3种鳜鱼生长与摄食量、胃蛋白酶活性和胃蛋白酶原基因表达相关分析

为了解不同种类鳜鱼生长差异的生理基础与机制,比较研究了鳜(Siniperca chuatsi)、斑鳜(Siniperca.scherzeri)和杂交鳜(斑鳜♀×鳜♂)幼鱼30 d内的生长速率与日摄食量、胃蛋白酶活性和胃蛋白酶原(PGA1、PGA2、PGC)基因相对表达量间的关系。结果表明,鳜、杂交鳜和斑鳜日增重率分别为(1.171±0.180)g/d、(1.019±0.104)g/d和(0.433±0.078)g/d,生长速率快慢次序是鳜杂交鳜斑鳜。鳜、杂交鳜和斑鳜平均日摄食量分别为(6.1±0.31)g/d、(5.26±0.33)g/d、(4.24±0.23)g/d。胃蛋白酶比活力最高部位是胃,实验前期,3种鳜鱼胃蛋白酶比活力差异不显著;后期,鳜、杂交鳜和斑鳜胃蛋白酶比活力分别为(347.8±13.3)U/g、(303.4±12.1)U/g和(272.1±10.9)U/g。胃蛋白酶原基因表达量随生长阶段缓慢增加,PGC∶PGA1∶PGA2基因相对表达量比例是1.1∶1.0∶0.7;鳜胃蛋白酶原基因的相对表达量均为最高,杂交鳜相对表达量略高于斑鳜(P0.05)。结果表明,3种鳜鱼的生长速率快慢与它们的摄食量大小之间呈正相关,摄食量大小与其消化能力间也具有相对应的关系。     

pH、盐度及K+、Ca2+和葡萄糖对萨罗罗非鱼精子活力的影响

[目的]确定萨罗罗非鱼精子活力最高时各因子的最佳参数,进一步提高尼罗罗非鱼♀×萨罗罗非鱼♂的受精率.[方法]利用显微镜观察对比不同梯度pH、盐度、离子及葡萄糖溶液中萨罗罗非鱼精子的活力状况,考察指标包括精子快速运动时间、寿命及激活率.[结果]pH 7.5～8.0时,萨罗罗非鱼精子激活率最高,达90％;在pH 7.5的条件下,精子快速运动时间和寿命最长,为66.33±2.25和933.17±25.79 s.在25‰～32‰的盐度范围内,萨罗罗非鱼精子活力较强,其中以30‰的精子活力最高,快速运动时间和寿命分别为63.50±2.35和402.50±7.31 s,激活率达90％.随K+浓度的增加,萨罗罗非鱼精子的快速运动时间、寿命及激活率均呈先升高后降低的变化趋势,其中以75mmol/L的精子活力最高,精子寿命为500.33±8.69 s,激活率为90％.Ca2+对萨罗罗非鱼精子活力有明显抑制作用,其浓度为37.8 mmol/L时精子快速运动时间和寿命最长,分别为38.50±2.43和117.50±3.21 s,精子激活率为80％;而后随Ca2+浓度的增加,精子开始出现聚集现象,活力明显下降,Ca2+浓度增至151.2mmol/L时,精子已完全失活.相对于K+和Ca2+,葡萄糖可适当延长萨罗罗非鱼精子寿命,其浓度为150mmol/L时,精子寿命最长,为281.00±5.90 s,激活率达90％.[结论]针对尼罗罗非鱼♀×萨罗罗非鱼♂人工繁殖中受精率低的问题,生产上除了选择优质尼罗罗非鱼卵细胞、优化孵化环境及人工繁殖技术外,还可通过适宜游动介质参数(pH 7.5～8.0、盐度30‰～32‰、75～100mmol/LK+、37.8 mmol/L Ca2+、100～125mmol/L葡萄糖)激活萨罗罗非鱼精子活力,进而提高其杂交受精率.     

3种鳜鱼消化道结构与胃中泌酸胃酶细胞分布比较

利用石蜡切片技术比较了鳜鱼、斑鳜和杂交鳜(斑鳜♀×鳜鱼♂)胃、幽门盲囊、肠道结构特征。3种鳜鱼胃壁均由黏膜层、黏膜下层、肌层组成,黏膜层内能看到固有层;其中,鳜鱼、杂交鳜胃黏膜层相对厚度0.30±0.09、0.30±0.11,斑鳜胃黏膜层相对厚度较薄,约0.21±0.13。肠道由黏膜层、黏膜下层和肌层组成,黏膜层表面含有绒毛,绒毛层含有杯状细胞;鳜鱼与杂交鳜褶皱数、杯状细胞密度间差异不显著(P0.05),但显著大于斑鳜(P0.05)。鳜鱼、斑鳜和杂交鳜幽门盲囊平均数目分别为(2.138±0.173)个/μm2、(0.793±0.132)个/μm2和(1.098±0.218)个/μm2。幽门盲囊结构与肠道相似,3种鳜鱼的褶皱数目差异不显著(P0.05),但斑鳜杯状细胞密度显著小于鳜鱼和杂交鳜(P0.05)。同时,利用原位杂交技术比较了3种鳜鱼胃中泌酸胃酶细胞的分布特征,3个胃蛋白酶原基因探针均出现紫色杂交信号,且均位于胃黏膜层。同种鱼中,不同基因探针杂交信号细胞密度差异不显著(P0.05);不同种类间,相同基因探针杂交信号细胞密度大小顺序均为鳜鱼=杂交鳜斑鳜,且相互间差异显著(P0.05)。消化道结构与泌酸胃酶细胞分布差异为鳜鱼消化生理学比较研究提供了基础资料。     

尼罗罗非鱼卵巢发育过程中性类固醇激素与卵黄蛋白原含量变化及Vtg mRNA 表达特征

通过组织切片、酶联免疫吸附及荧光定量PCR等方法,研究了尼罗罗非鱼(Oreochromis niloticus)卵巢发育过程中性类固醇激素(雌二醇E2、孕酮P)、卵黄蛋白原(Vtg)含量及Vtg mRNA相对表达水平变化规律。结果表明,尼罗罗非鱼性腺指数(GSI)与卵巢成熟发育间呈同步性变化,Ⅴ期达到峰值。血清中E2含量自卵巢Ⅱ期开始显著升高,Ⅳ期达到峰值,Ⅴ期后显著下降;血清P含量自卵巢Ⅱ期开始不断升高,Ⅴ期达到峰值,Ⅵ期显著下降;E2、P分别在卵巢成熟发育前期与后期发挥作用。肝中Vtg含量先升、后降,Ⅳ期达峰值;血清、卵巢中Vtg含量均自Ⅱ期开始增加,Ⅴ期达峰值,Ⅵ期显著降低;不同组织中Vtg含量变化与卵巢成熟发育间存在密切关联。肝中Vtg mRNA表达水平在Ⅲ期达到峰值,Ⅳ期后持续下调;卵巢中Vtg mRNA表达水平相对较低,Ⅴ期达到峰值;初步推测肝、卵巢同是尼罗罗非鱼Vtg合成部位,肝是Vtg合成的主要器官,在卵黄积累阶段最为活跃,而卵巢Vtg合成水平相对较低。     

冷休克诱导尼罗罗非鱼♀×萨罗罗非鱼♂三倍体研究

为了提高尼罗罗非鱼和萨罗罗非鱼人工杂交种的制种效率,以尼罗罗非鱼为母本,萨罗罗非鱼为父本进行人工授精,用冷休克抑制第二极体释放的方法诱导异源三倍体。实验对人工授精后处理起始时间(timing after-fertilization,TA)、处理温度(temperature,T)、处理持续时间(duration,D)这3个参数分别进行单因素实验,并设立尼罗罗非鱼♀×尼罗罗非鱼、尼罗罗非鱼♀×萨罗罗非鱼两个对照组。在T=♂♂9℃、D=30 min下,受精后10 min处理组检测不到三倍体;在TA=7min、D=30 min下,T=5~9℃能得到97.2%~100%的三倍体诱导率;在TA=7 min、T=9℃下,D超过60 min,孵化率为0。因此,尼罗罗非鱼♀×萨罗罗非鱼异源三倍体的最适宜诱导条件为:受精后7 min,♂处理温度9℃,处理持续时间30 min,诱导率为98.3%~100%,相应的孵化率为17.5%~19.1%。在获得100%三倍体的处理组中(除去TA=7min、T=9℃、D=50 min处理组),孵化率为9.6%~19.1%,高于相应杂交二倍体组的孵化率(7.6%~8.5%)。     

pH、盐度及K+、Ca2+和葡萄糖对萨罗罗非鱼精子活力的影响

【目的】确定萨罗罗非鱼精子活力最高时各因子的最佳参数,进一步提高尼罗罗非鱼♀×萨罗罗非鱼♂的受精率。【方法】利用显微镜观察对比不同梯度pH、盐度、离子及葡萄糖溶液中萨罗罗非鱼精子的活力状况,考察指标包括精子快速运动时间、寿命及激活率。【结果】pH 7.5~8.0时,萨罗罗非鱼精子激活率最高,达90%;在pH 7.5的条件下,精子快速运动时间和寿命最长,为66.33±2.25和933.17±25.79 s。在25‰~32‰的盐度范围内,萨罗罗非鱼精子活力较强,其中以30‰的精子活力最高,快速运动时间和寿命分别为63.50±2.35和402.50±7.31 s,激活率达90%。随K+浓度的增加,萨罗罗非鱼精子的快速运动时间、寿命及激活率均呈先升高后降低的变化趋势,其中以75 mmol/L的精子活力最高,精子寿命为500.33±8.69 s,激活率为90%。Ca2+对萨罗罗非鱼精子活力有明显抑制作用,其浓度为37.8 mmol/L时精子快速运动时间和寿命最长,分别为38.50±2.43和117.50±3.21 s,精子激活率为80%;而后随Ca2+浓度的增加,精子开始出现聚集现象,活力明显下降,Ca2+浓度增至151.2 mmol/L时,精子已完全失活。相对于K+和Ca2+,葡萄糖可适当延长萨罗罗非鱼精子寿命,其浓度为150 mmol/L时,精子寿命最长,为281.00±5.90 s,激活率达90%。【结论】针对尼罗罗非鱼♀×萨罗罗非鱼♂人工繁殖中受精率低的问题,生产上除了选择优质尼罗罗非鱼卵细胞、优化孵化环境及人工繁殖技术外,还可通过适宜游动介质参数(pH 7.5~8.0、盐度30‰~32‰、75~100 mmol/L K+、37.8 mmol/L Ca2+、100~125mmol/L葡萄糖)激活萨罗罗非鱼精子活力,进而提高其杂交受精率。     

盐碱胁迫对尼罗罗非鱼鳃Na+/HCO3-共转运子、碳酸酐酶基因表达的影响

为了探讨盐碱胁迫条件下鱼类渗透生理调节机制,以尼罗罗非鱼(Oreochromis niloticus)为实验材料, PCR扩增得到了Na⁺/HCO₃^-共转运子(NBCe1)基因cDNA部分序列,比较了单盐(盐度10、盐度15)、单碱(1.5 g/L、3 g/L NaHCO₃)、盐碱混合(盐度10,碱度1.5 g/L;盐度15,碱度3 g/L)胁迫后不同时间(0 h、6 h、12 h、24 h、48 h、72 h、96 h)血清渗透压、离子浓度(Na⁺、K⁺、Cl^-、Ca²⁺)以及鳃碳酸酐酶(CA)活性、CA与NBCe1基因mRNA表达变化。结果显示,不同胁迫条件下,血清渗透压、离子浓度、鳃组织CA酶活、CA与NBCe1基因mRNA表达变化均与胁迫强度呈正相关。随时间推移,血清渗透压、离子浓度呈现先上升后下降的变化趋势,单盐、盐碱混合组血清渗透压值较单碱组高。单盐、单碱、盐碱混合组中, NBCe1基因mRNA在鳃中均呈略微上调,但不显著(P>0.05)。单碱组和盐碱混合组鳃CA活性较单盐组高,低盐碱胁迫(盐度10,碱度1.5 g/L)下CA活性较晚达最高值;不同胁迫条件下, CA基因mRNA表达均表现上调,单碱、盐碱混合组更为显著(P<0.05),推测CA较NBCe1对体内HCO₃^-转运作用更为显著。研究结果为尼罗罗非鱼盐碱适应生理调节提供了基础资料。