单链抗体的研究进展

抗体在疾病的诊断、治疗和预防中发挥着重要的作用,其生产制备经历了抗血清多克隆抗体和单克隆抗体(Monoclonalantibodies,McAb)阶段,现已进入了基因工程抗体的时代。基因工程抗体主要包括单链抗体(ScFv)、Fab抗体、F(ab`)2抗体等小分子抗体、嵌合抗体和改形抗体。本文就单链抗体的研究进展作了综述。     

小分子半抗原抗体制备技术的研究进展

从半抗原的术的最新研究情况，旨在为制备一些采用常规设计与合成、新型载体和佐剂的使用、基因工程抗体的应用等方面论述了小分子半抗原抗体制备技方法不易获得的小分子半抗原抗体提供新的方法和思路。     

单链抗体的研究进展及其应用

随着分子生物学的发展,单链抗体作为一种小分子基因工程抗体,在理论和应用方面的研究引起了广泛的关注,其在显像定位诊断、靶向治疗和参与细胞免疫等方面展示出了可观的应用前景。对单链抗体的结构及特点、制备技术及其应用等进行了综述,以期能够为单链抗体的进一步深入研究和应用提供理论基础。     

基因工程单链抗体的研究进展及临床应用

基因工程抗体在医学生物学研究、疾病的诊断治疗及其他方面有着广泛应用。近年来国内外学者对基因工程抗体进行了广泛的研究,涉及到抗体基因的获取、构建、表达及最后的应用。尤其是单链抗体（single chain antibody,SCA ＆ single chain Fv,ScFv）,因其具有抗原亲活性、分子量小、穿透力强、体内循环半衰期短及排除了Fc段所致的免疫复合物反应等优点,而成为基因工程抗体研究领域中的热点课题。特别是将抗体进行人源化改造、与免疫毒素连接形成融合蛋白的研究已取得突破性进展,目前已有多个人源性ScFv抗体获美国FDA的批准。笔者认为,如果能进一步提高其稳定性及表达产量,开拓免疫毒素及其它新型免疫融合蛋白的研究范围,制备出性能稳定、特异性强、亲和力高、效能多样的基因工程抗体,就可在更大范围取得更大的成绩。     

纳米抗体的制备与临床应用研究进展

抗体是一类能特异性识别并结合抗原的免疫球蛋白，也是机体体液免疫的主要成分。随着科学技术的发展及对抗体研究的深入，抗体的应用领域不断扩展，可作为亲和配体或探针用于蛋白互相作用、蛋白与核酸相互作用、生物大分子定位与分布等研究，也可作为免疫抑制剂或治疗药物用于免疫性疾病、肿瘤、感染等疾病的治疗，还可结合各种标记技术用于疾病诊断、食品安全检测和环境监测。但传统抗体生产成本高、组织穿透力差、免疫排斥反应等缺点限制了其在疾病治疗等领域的广泛应用。近年来，科学家们致力于新型小分子抗体的寻找和研究，先后研制出嵌合抗体、小分子抗体、双特异性抗体等新型抗体。其中，纳米抗体（nanobody，Nb）又称重链可变区（variable heavy chain domain，VHH）抗体，是一种仅由一个重链可变区组成的单域抗体。纳米抗体保留了重链抗体完整的抗原结合能力，且具有分子质量小、组织穿透性强、抗原亲和力高、能识别隐藏表位、免疫原性低、结构稳定、水溶性好、生产成本低、易于产业化等优点，在疾病诊断、癌症和感染性疾病治疗、小分子药物及毒素残留检测等领域展现出巨大的应用前景。作者首先介绍了纳米抗体的特点，然后简述了纳米抗体的制备流程，重点综述了纳米抗体在疾病诊断、疾病治疗、食品安全和环境监测等领域的应用，最后对纳米抗体在兽医临床的应用前景进行了分析和展望。     

单链抗体在小分子化学物质残留检测中的研究进展

兽药、农药及生物毒素等小分子化学物质在食品、饲料或水体中的过量残留对人、动物的健康及生态环境的平衡造成一定程度的危害,因此建立一种针对上述小分子化学物质残留的快速检测方法十分必要。以抗原抗体特异性结合为基础的免疫分析技术是残留检测的常用手段,该技术的关键是制备可用来检测特异性抗原的抗体。随着对抗体结构的解析及重组DNA技术的发展,单链抗体为小分子化学物质的残留检测提供了新的技术手段。单链抗体具有分子质量小、免疫原性低、可塑性强、可批量生产等优点,具有广阔的发展空间。近年来,以单链抗体为基础建立的酶联免疫吸附法检测小分子化学物质的残留检测成为最常用的分析工具,且单链抗体的筛选策略、表达策略、突变策略及与碱性磷酸酶形成的融合蛋白等进一步提高了抗体产量、灵敏度、广谱性,并使免疫分析方法简便化,从而推进单链抗体免疫分析方法在小分子化学物质残留检测的应用。作者综述了以单链抗体为基础的免疫分析方法在兽药、农药及生物毒素等小分子化学物质方面的研究进展,以期为小分子化学物质残留检测提供参考。     

基因工程抗体研究进展

抗体技术的发展经历了3个阶段，第1代抗体为血清多克隆抗体，1975年Kohler和Milstein创立了单克隆杂交瘤技术使第1代抗体发展到了第2代抗体即单克隆抗体，但由于鼠单抗对人体具有免疫原性，不能重复使用，影响疗效，而且生产单抗的成本较高，难以普及使用，1984年国外首次报道人－鼠嵌合体在骨髓瘤细胞中成功表达，开创了基因工程抗体技术，标志着第3代抗体－基因工程抗体的诞生，随后1985年人源化抗体构建和表达成功，1988年第首次证明抗体的Fab和Fv片段可以在大肠杆菌中正确地装配成保持抗原特异性的小分子抗体，1991年报道了用附着型载体构建成功抗体库，利用抗体库技术获得全人源化的抗体，因此基因工程抗体技术可以通过基因操作改造已知的抗体，也可以不经细胞融合及免疫动物直接从基因水平制备抗体是继杂交瘤技术之后抗体产生技术的又一次革命，随着这项技术的发展和完善，人们可以在更大程度上根据需要改造和制备抗体。     

基因工程重组抗体技术的研究进展

经历了多克隆抗体技术、杂交瘤单克隆抗体技术后、基因工程抗体技术发展十分迅速,应用也越来越广泛。本文介绍基因工程重组抗体技术的研究进展。     

噬菌体抗体库技术及其研究策略

噬菌体抗体库技术是近年发展起来的将抗体基因与噬菌体外壳蛋白基因在其表面进行融合表达的技术。可用来构建噬菌体抗体库 ,并可从中制备各种基因工程抗体 ,为抗体的进一步开发应用提供了具有良好前景的新方法。     

纳米抗体在口蹄疫防治中的研究进展

口蹄疫作为一种急性、热性和高度传染性疫病,目前尚缺乏长期有效且能完全抑制其病原的药物或疫苗。纳米抗体是一种新型基因工程抗体,具有生产成本低、与抗原亲和力高、特异性强、相对分子质量小等优点,且结构独特,因而成为对抗病毒的抗体之一,被用于某些病毒性疾病的预防及治疗。本文从纳米抗体的结构与特性、在口蹄疫诊断中的应用、在中和口蹄疫病毒中的作用以及在口蹄疫治疗中的展望等方面进行综述,探索其作为“探针”来诊断疾病的能力,以及将药物传递到机体内部,作为免疫抑制剂或治疗药物来中和病毒毒力的能力,以期为纳米抗体用于口蹄疫预防提供研发基础及创新思路。     

抗H5N1亚型高致病性禽流感猴源噬菌体scFv的构建和表达

为探索治疗禽流感的方法,本实验从免疫H5N1亚型禽流感疫苗的猕猴淋巴细胞中提取总mRNA并扩增重链和轻链可变区(VH、Vλ和Vκ),用重叠延伸PCR方法构建VH-Linker-Vλ和VH-Linker-Vκ形式的单链抗体(scFv),采用噬菌体展示技术构建了噬菌体抗体库,从2.2×106的噬菌体库中淘选得到具有较高亲和力的H6株scFv,并通过ELISA、SDS-PAGE、western blot、间接免疫荧光(IFA)和竞争抑制ELISA对其进行鉴定,证实所获得的scFv为32ku,并且能与病毒发生特异性结合。IgBlast序列分析发现,所得到的scFv基因Vλ与人免疫球蛋白胚系基因同源性达91.5%,而VH同源性为75%。本研究所得到的猴源抗体可变区为人源化抗体的构建以及禽流感的治疗奠定了基础。     

抗体信号肽基因的克隆和序列测定及真核表达载体的构建

根据抗体重链与轻链基因的核苷酸序列设计并合成了1对引物,以猪外周血淋巴细胞基因组mRNA为模板,通过RT_PCR方法获得了一大小约85bp的DNA片段,并将其克隆到pGEM_T载体上进行序列测定,测序结果显示,猪抗体信号肽基因核苷酸序列长度为57bp,编码19个氨基酸,核苷酸及推导的氨基酸序列与已发表的抗体信号肽基因序列一致,同时在信号肽基因3’端下游提供可供肽酶切割的窗口和外源基因的克隆位点。然后将信号肽基因亚克隆到真核表达载体pcDNA3.1( )中,成功构建了一含信号肽序列的真核表达载体3.1_SFc,为外源基因在pcDNA3.1( )中的表达与分泌提供了一有效的信号肽,也为研究基因的功能奠定了基础。     

天然鼠源噬菌体单链抗体库的构建

噬菌体展示技术是一项利用丝状噬菌体体外表达外源基因的新技术。它模拟动物体内抗体的形成过程，将抗体片段呈现在噬菌体表面，建成噬菌体抗体库，用与亲和层析相类似的原理，从抗体库中筛选出特异性噬菌体抗体，为制备人和动物用抗体提供了极为有效的手段。单链抗体是利用基因工程技术，由一个DNA片段(Linker)将抗体重链、     

猪流行性腹泻病毒S蛋白原核表达及多克隆抗体的制备与鉴定

【目的】 探索猪流行性腹泻病毒（Porcine epidemic diarrhea virus,PEDV） S蛋白的结构和功能,为建立PEDV感染的诊断方法和疫苗开发提供理论依据。【方法】 以PEDV经典CV777株为模板,通过PCR扩增获得S、S1基因片段;PCR扩增产物分别克隆pET-30a （+）原核表达载体和pFLAG-CMV-3真核表达载体,构建原核表达质粒pET-30a-PEDV-S和真核表达质粒pFLAG-CMV-3-PEDV-S1;将pET-30a-PEDV-S转化大肠杆菌BL21（DE3）感受态细胞,IPTG诱导表达PEDV-S重组蛋白,通过变性、复性、浓缩纯化重组蛋白并进行Western blotting检测;将PEDV-S重组蛋白免疫C57BL小鼠制备多克隆抗体,获得的多克隆抗体经间接免疫荧光试验（IFA）检测特异性,通过间接ELISA法检测多克隆抗体效价;将pFLAG-CMV-3-PEDV-S1转染至HEK293T细胞,以制备的多克隆抗体为一抗,经IFA测定PEDV-S1蛋白的抗原性和多克隆抗体的反应性。【结果】 成功克隆出PEDV S和S1基因,构建了可表达PEDV-S重组蛋白的原核表达质粒和在HEK293T细胞中高效表达S1蛋白的真核表达质粒;PEDV-S重组蛋白在IPTG为0.5 mmol/L、16 ℃诱导8 h条件下可获得最高表达量,主要以包涵体形式存在;Western blotting结果显示,PEDV-S重组蛋白成功表达;ELISA检测结果显示,制备的多克隆抗体效价达1：3 280 500;IFA结果显示,多克隆抗体有良好的特异性,可特异性识别PEDV-S和PEDV-S1蛋白。【结论】 本研究获得了PEDV-S重组蛋白,并成功表达S1蛋白,制备出PEDV-S蛋白多克隆抗体,为研究S蛋白的结构和功能提供了条件,为揭示PEDV致病机制奠定了基础。     

狂犬病病毒中和抗体ELISA技术的建立

将狂犬病病毒(RV)糖蛋白(G蛋白)中和抗原表位串联表达的重组蛋白作为抗原,建立了检测RV中和抗体的间接ELISA技术。结果表明,最佳抗原包被量为2μg/孔,被检血清最佳稀释倍数为1:200。该方法与快速荧光灶抑制试验(RFFIT)的阳性符合率为88%,阴性符合率为96%。特异性试验表明,该抗原不与犬腺病毒I型、犬细小病毒、犬瘟热病毒、犬副流感病毒和犬冠状病毒阳性血清发生交叉反应,具有良好的特异性。板内和板间重复性试验的平均变异系数分别为2.7%和4.2%,具有良好的重复性,为动物RV中和抗体检测提供了简单快捷的检测方法。     

抗乙肝病毒人源噬菌体单链抗体库的构建及筛选

为了构建抗乙肝病毒人源噬菌体特异性单链抗体库,从中筛选抗乙肝病毒人源噬菌体单链抗体库特异性单链抗体,试验提取患者外周淋巴细胞总RNA,以总RNA为模板,通过RT-PCR技术分别扩增出H链和L链可变区基因,采用SOE-PCR方法将VH和VL片段随机拼接成ScFv片段,然后将ScFv片段克隆至pCANTAB5E载体,电转E.coil TG1,构建抗乙肝病毒人源单链抗体库,并从中筛选阳性克隆抗体。结果表明:经过5轮筛选,获得2株能与乙肝病毒抗原特异性结合的阳性克隆。说明利用噬菌体抗体技术可不经免疫制备抗乙肝病毒人源噬菌体特异性单链抗体。     

一种犬细小病毒基因工程抗体的制备

本研究旨在利用HEK-293细胞系制备鼠源犬细小病毒（canine parovirus，CPV）基因工程抗体并检测其生物活性。通过抗体亚型检测试剂盒检测CPV单克隆抗体亚型；采用间接ELISA检测CPV单克隆抗体的亲和力和特异性；经RACE-PCR获得CPV单克隆抗体的可变区序列，将可变区序列与鼠源抗体恒定区序列连接；分别构建真核表达载体pcDNA3.1（+）-L和pcDNA3.1（+）-H，将载体共转染HEK-293细胞，采用血凝抑制与中和试验的方法检测鼠源CPV基因工程抗体生物活性；采用HEK-293F细胞悬浮表达并用间接ELISA方法检测鼠源CPV基因工程抗体的表达量；用Protein A亲和层析柱纯化鼠源CPV基因工程抗体后进行SDS-PAGE鉴定；间接免疫荧光检测纯化后鼠源CPV基因工程抗体的活性。结果显示，CPV单克隆抗体亚型为IgG_2b，亲和力常数6个Ka平均值为1.02×10¹¹ L/mol，只与CPV VLPs发生反应。琼脂糖凝胶电泳结果显示，试验成功构建真核表达载体pcDNA3.1（+）-L和pcDNA3.1（+）-H；HEK-293和HEK-293F细胞培养上清液血抑效价分别为1∶2⁴和1∶2⁶，中和试验结果显示，HEK-293和HEK-293F细胞培养上清液中和效价分别为1∶152和1∶1 290；鼠源CPV基因工程抗体在HEK-293F细胞中的表达量为5.97 mg/L，SDS-PAGE分析在55和25 ku处出现条带，表明鼠源CPV基因工程抗体成功在HEK-293F细胞中表达并纯化。间接免疫荧光检测结果表明，纯化后鼠源CPV基因工程抗体具有良好的生物活性。本研究在HEK-293F细胞中成功表达具有中和活性、纯度较高的鼠源CPV基因工程抗体，为今后CPV基因工程抗体药物的研发奠定基础。     

抗重组猪蛔虫抗原AD41蛋白鼠源性单链抗体库的构建及筛选

为了构建重组猪蛔虫抗原AD41蛋白鼠源性单链抗体库,试验用重组蛋白AD41抗原免疫接种Balb/c小鼠,提取小鼠脾脏总RNA,以总RNA为模板经RT-PCR合成cDNA,再以cDNA为模板,用小鼠免疫球蛋白重链和轻链设计引物,分别扩增重链和轻链可变区基因,利用SOE-PCR法将VH和VL片段随机拼接成单链抗体(ScFv)片段,将其克隆入质粒表达载体pCANTAB5E中,转化于大肠杆菌TG1,通过辅助噬菌体M13K07援救构建噬菌体单链抗体库。结果表明:从30个噬菌体克隆中筛选到25个阳性克隆。说明成功地构建了抗重组猪蛔虫抗原AD41蛋白鼠源性单链抗体库。     

重组白细胞介素- 2对固始鸡免疫机能的影响

本试验旨在探讨重组白细胞介素- 2（IL- 2）对固始鸡免疫机能的影响。应用大体解剖技术和免疫技术,对重组IL- 2对固始鸡免疫机能的影响进行了研究。注射固始鸡IL- 2的各免疫组的抗体水平均高于鸡志贺氏菌苗组,明显高于空白对照组;各免疫组抗体水平在第2～3周达到最高水平,以后在4～7周内基本保持恒定水平;注射IL- 2的各免疫组的脾脏指数、胸腺指数、法氏囊指数基本上均高于空白对照组和鸡志贺氏菌苗组。重组IL- 2可促进固始鸡免疫器官的生长发育和成熟,增强鸡的免疫机能,可抵抗各种病原微生物的感染。     

猪唾液酸黏附素氨基端结构域基因的克隆表达及其多克隆抗体制备

本试验旨在克隆出猪唾液酸黏附素的近氨基端结构域基因,进而构建原核表达载体并诱导表达重组蛋白,以制备多克隆抗体。试验中应用RT-PCR技术从健康仔猪肺巨噬细胞中克隆出猪唾液酸黏附素的近氨基端结构域的cDNA序列,并将其亚克隆到原核表达载体pET-32a中,构建重组表达质粒pET-Sn150,成功表达了分子质量大小约为43.1 ku的γ亚单位重组蛋白。将重组蛋白pET-Sn150免疫小鼠,制备获得鼠抗pET-Sn150重组蛋白多克隆抗体,将得到的重组蛋白多克隆抗体采用间接 ELISA 和Western blotting试验方法检测,ELISA测定多克隆抗体的血清效价为1∶12800;Western blotting试验结果证明,制备的鼠抗pET-Sn150多克隆抗体可以与重组蛋白进行特异性结合,从而证明重组蛋白具有较好的免疫原性。本试验克隆出猪唾液酸黏附素的近氨基端结构域基因并成功表达,为进一步研究其结构与功能奠定了基础。