肠出血性大肠杆菌O157多重PCR检测方法的建立

为了建立肠出血性大肠杆菌(EHEC)O157的多重PCR检测方法,本研究选取调控基因fusR与n5512,联合经典的rfbE、stx1和stx2基因,共同作为靶基因,通过对引物浓度等参数优化,建立了稳定性好的检测EHEC O157的多重PCR方法。并检测了该方法的特异性与敏感性,结果显示,该方法对非O157的产志贺毒素的大肠杆菌、肠致病性大肠杆菌(EPEC)、沙门氏菌、假结核耶尔森菌等检测均为阴性,特异性强;对EHEC基因组DNA的检测下限约为2.27×10~(-2)ng/μL,对EHEC CFU的检测下限约为104cfu/mL。对人工感染菌的样品进行检测,增菌前与增菌后的检测限分别为:饲料,4×10~3cfu/g和4×10~(-4)cfu/g;土壤,4×103cfu/g和4×10~(-2)cfu/g;牛肉,8×10-1cfu/g和8×10-3cfu/g;废水,4×103cfu/g和4×10~(-3)cfu/g。该方法还能检出感染了EHEC O157小鼠的粪便。综上,本研究建立了一种优化的EHEC O157多重PCR检测方法,为动物养殖与肉品加工过程中EHEC O157的检测提供了便捷、灵敏、可靠的技术手段。     

EHEC O157 △ler/stx(pBR322::stx1/2B::eae)对小鼠免疫保护作用的实验研究

通过粘膜免疫途径对基因工程菌EHEC O157Δler/stx（pBR322：：stx1/2B：：eae）进行小鼠免疫保护作用实验研究。结果表明,用EHEC O157Δler/stx（pBR322：：stx1/2B：：eae）灌胃免疫小鼠能够诱导小鼠产生抗EHEC O157特异性免疫应答,两次免疫后7d,免疫组血清IgG抗体显著高于对照组,14 d检测IgG抗体达到最高峰,粪便中检测到高水平的抗EHEC O157特异性IgA抗体,表明该工程菌可以诱导肠道粘膜免疫应答和系统免疫应答。EHEC O157强毒株经胃肠道途径攻毒后,一次免疫组和两次免疫组小鼠存活率（67%和78%）均高于未免疫组（50%）;免疫小鼠强毒菌排菌时间大大缩短,两次免疫组攻毒后第5 d检测不到强毒菌,未免疫组排菌达10 d以上;攻毒后免疫组小鼠体重较快恢复正常水平。     

检测牛奶中肠出血性大肠杆菌O157:H7的双抗夹心化学酶联免疫方法的建立

为了检测牛奶中肠出血性大肠杆菌(enterohemrrhagic Escherichia coil, EHEC)O157:H7污染,采用兔多抗作为捕捉抗体与一株O157:H7单克隆抗体作为检测抗体进行配对,构建了针对EHEC O157:H7的双抗夹心化学发光酶联免疫检测方法。该方法最低检测限可达到2.5×10~4 CFU/mL,优于ELISA检测方法,且特异性良好,与其他大肠杆菌、沙门菌、李斯特菌、阪崎肠杆菌等均无交叉反应。在用于牛奶样本的模拟添加检测中,较ELISA方法可缩短前增菌处理时间。本研究为牛奶中O157:H7污染检测提供了一种准确度高、特异性强的检测手段。     

单增李斯特菌单克隆抗体制备及免疫磁珠分离方法的建立

免疫磁珠技术操作简单、快速高效，目前已广泛应用于细菌的快速分离纯化等领域，本研究旨在建立一种捕获率高、特异性好的单增李斯特菌免疫磁珠分离方法。首先通过杂交瘤技术制备出8株抗单增李斯特菌单克隆抗体，效价均达到1∶1 024 000,且特异性较好。利用效价最高的腹水6-E6制备单增李斯特菌免疫磁珠，并对单增李斯特菌免疫磁珠最适条件进行优化，结果选择MEST(7.0)为偶联缓冲液、磁珠直径为750 nm、免疫磁珠添加量为0.4 mg、捕获时间45 min、单增李斯特菌含量在1×10⁴ CFU/mL时，免疫磁珠捕获率最高可达76.29%。在模拟牛奶样品中免疫磁珠特异性捕获率可达到67.71%。该分离方法可快速且特异地分离单增李斯特菌，操作简便，为快速分离食品中的单增李斯特菌并实现快速检测提供了技术支持。     

采用免疫磁珠富集呋喃唑酮残留标示物的研究

将呋喃唑酮代谢物3-氨基-2-恶唑烷酮(AOZ)单克隆抗体偶联至经3-乙基碳二亚胺(EDC)和N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)活化的磁珠上制备成免疫磁珠,建立快速、特异性富集鸡肉中残留标示物NPAOZ(3-[[(4-硝基苯基)-亚甲基]-氨基]-2-恶唑烷酮)的方法。纳米磁珠经EDC和NHS活化后与AOZ单克隆抗体偶联,得到抗体偶联量为50μg/mg的免疫磁珠。该免疫磁珠只对NPAOZ具有较高的特异性吸附,而对呋喃妥因代谢物AHD、呋喃西林代谢物SEM、呋喃它酮代谢物AMOZ的衍生物均无吸附作用。在样品前处理过程中利用免疫磁珠富集呋喃唑酮代谢物,当加标量为0.25~2 ng/g时回收率均在78%以上,变异系数为5.3%~10.9%,最低检测限为0.049μg/kg,远低于样品常规样品前处理法的最低检测限0.139μg/kg。结果显示基于免疫磁珠的样品前处理方法能有效富集鸡肉中NPAOZ,进一步有效提高ELISA检测方法的灵敏度。     

饲料中肠出血性大肠杆菌O157∶H7双重PCR检测方法的建立

根据肠出血性大肠杆菌(enterohemorrhagic E.coli,EHEC)O157∶H7的O抗原编码基因rfb E和H抗原编码基因fli C分别设计引物,建立双重PCR方法。饲料样品人工污染EHEC O157∶H7后进行增菌培养,利用双重PCR进行检测EHEC O157∶H7。结果表明:建立的PCR方法能够特异性扩增出目的条带,敏感性可达到100 cfu细菌。双重PCR方法可以有效地检测出饲料中人工污染的EHEC O157∶H7,人工污染饲料样品经4 h预增菌处理后,该方法的检测下限为20 cfu细菌。本研究建立的双重PCR方法可快速、特异地检测出饲料中污染的EHEC O157∶H7,可用于饲料中EHEC O157∶H7的检测及流行病学调查。     

3种病原菌多重IMS-荧光RPA检测体系的建立及初步应用

建立一种同时检测沙门氏菌、大肠杆菌O157:H7和布氏杆菌的快速、灵敏、高通量的检测方法。利用特异性免疫磁珠,在37℃条件下从200 mL样液体系中循环捕获目标致病菌。磁珠液提取DNA后,对3种病原菌进行多重IMS-荧光RPA检测。结果表明:针对沙门氏菌、大肠杆菌O157:H7和布氏杆菌的检测限分别达到3.0、4.5和8.7 CFU/mL。使用新建多重IMS-荧光RPA方法对人工感染60份皮张、毛皮纺织品DNA样本进行扩增,结果显示与预期结果一致;对60份公共场所收集的皮张、毛皮、纺织品DNA样本进行扩增,结果显示有2个样本沙门氏菌阳性、1个样本大肠杆菌O157:H7阳性,3份阳性样品送测序,测序结果与GenBank检索沙门氏菌、大肠杆菌O157:H7 DNA序列一致。得出结论:建立的多重IMS-荧光RPA检测体系灵敏度、特异性、准确度符合要求,能够在2 h内完成对3种病原菌检测,可以作为快速应对此三类病原菌安全突发事件的检测手段。     

检测冻肉中大肠杆菌O157∶H7的两种方法比较

大肠杆菌O157∶H7属于肠出血性大肠杆菌(en-terohemorrhagic E.coli,EHEC),是EHEC的主要血清型。感染大肠杆菌O157∶H7可使人患腹泻、出血性结肠炎,也可引发溶血性尿毒综合征及血栓形成性血小板减少性紫癜等严重并发征。笔者运用胶体金免疫(Colloidal gold immunoassay,GIA)检测卡和荧光PCR技术,对东莞市108份冻肉中的大肠杆菌O157∶H7进行了检测,并对2种方法的检测效果进行了分析比较。1材料与方法1.1材料东莞市各镇(区)冻肉库中的冻肉,共108份。大肠杆菌O157∶H7、O1、O48、沙门菌等菌株,由华南农业大学兽医学院郭霄峰教授惠赠…     

大肠杆菌O157:H7实时定量PCR检测方法的建立

根据GenBank公布的大肠杆菌O157:H7的Flic(H7)基因序列进行同源性比较分析,选择保守序列设计一对特异性扩增引物,通过优化反应条件,建立一个用于大肠杆菌O157:H7快速定量检测的实时定量PCR方法.该方法的最低检测极限是103CFU/mL,敏感性比常规PCR提高10倍.方法重复性好、特异性强,重复性检测的变异系数均小于2%;只能检测大肠杆菌O157:H7,对非大肠杆菌O157:H7血清型细菌、猪链球菌2型、副猪嗜血杆菌无反应.利用此方法对模拟样本进行定量检测,其结果与平板细菌计数基本一致,表明此方法可作为大肠杆菌O157:H7快速诊断和疫情监测的一种快速、准确、简便的检测工具.     

大肠杆菌O157∶H7实时定量PCR检测方法的建立

根据GenBank公布的大肠杆菌O157∶H7的Flic(H7)基因序列进行同源性比较分析,选择保守序列设计一对特异性扩增引物,通过优化反应条件,建立一个用于大肠杆菌O157∶H7快速定量检测的实时定量PCR方法。该方法的最低检测极限是103CFU/mL,敏感性比常规PCR提高10倍。方法重复性好、特异性强,重复性检测的变异系数均小于2%;只能检测大肠杆菌O157∶H7,对非大肠杆菌O157∶H7血清型细菌、猪链球菌2型、副猪嗜血杆菌无反应。利用此方法对模拟样本进行定量检测,其结果与平板细菌计数基本一致,表明此方法可作为大肠杆菌O157∶H7快速诊断和疫情监测的一种快速、准确、简便的检测工具。