猪圆环病毒2型和3型双重PCR检测方法的建立

猪圆环病毒3型(PCV3)是一种新的猪圆环病毒,与猪皮炎和肾病综合征、母猪繁殖障碍及心脏和多系统炎症相关。为了建立一种同时快速检测猪圆环病毒2型(PCV2)和PCV3的双重PCR方法,根据GenBank收录的PCV2和PCV3基因序列,分别在PCV2 Cap基因和PCV3 Rep基因高度同源保守区设计并筛选2对特异性引物,经过双重PCR反应条件的优化,建立了同时检测PCV2/3的双重PCR检测方法。本方法可同时扩增出PCV2、PCV3的486,270bp特异性片段,而扩增猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)、猪瘟病毒(CSFV)、伪狂犬病病毒(PRV)等病原核酸结果均为阴性;PCV2/3最低检出量分别为139,21.7拷贝/μL。经临床应用表明,本试验建立的双重PCR方法简便、快速,敏感度高,特异性强,为PCV2/3的鉴别诊断和联合检测提供了依据。     

猪圆环病毒2型和3型双重PCR检测方法的建立与应用

为建立一种快速且同时检测猪圆环病毒2型(PCV2)和3型(PCV3)的方法,本研究根据GenBank中PCV2和PCV3的全基因组序列,设计了两对特异性引物,通过对扩增条件的优化,建立了能够同时检测PCV2和PCV3的双重PCR方法。该方法可以同时扩增PCV2的266 bp和PCV3的594 bp特异性片段,而对猪伪狂犬病毒、猪细小病毒、猪瘟病毒、猪繁殖障碍与呼吸综合征病毒和猪流行性腹泻病毒的基因组扩增结果均为阴性。对PCV2和PCV3的最低检出量均为100拷贝/μL。对广西境内100份健康屠宰猪淋巴结样品检测结果显示,单一PCR与双重PCR检测符合率为100%。结果表明,本研究建立了一种简便快捷、反应灵敏、稳定可靠且特异性强的双重PCR技术,为临床样品中PCV2和PCV3的快速检测提供了有效的技术支持。     

猪圆环病毒2型和猪细小病毒双重PCR检测方法的建立及应用

根椐Gen Bank中登录的猪圆环病毒2型(PCV2)和猪细小病毒(PPV)核苷酸序列,分别设计2对引物,在建立各病毒单项PCR技术的基础上,优化双重PCR反应条件,建立了2种病毒的双重PCR检测方法,用这2对引物对同一样品中的PCV2和PPV核酸模板进行双重PCR扩增,结果可同时扩增PCV2的245 bp、PPV的475 bp的特异性片段,而对其他4种病原的PCR扩增结果均为阴性。敏感性测定结果表明,该双重PCR技术能检出1 pg的PCV2和1 pg的PPV模板。用105份临床病料对本研究双重PCR技术和单项PCR技术进行对比验证,结果显示,两者的总符合率为100%。表明建立的双重PCR检测方法具有特异、快速、准确的特点,可用于对这两种病毒的同时检测和鉴别诊断。     

猪伪狂犬病病毒野毒和猪圆环病毒3型双重PCR检测方法的建立

为了能够同时检测和鉴别猪伪狂犬病病毒(pseudorabies virus,PRV)和猪圆环病毒3型(porcine circovirus type 3,PCV3)。本研究参考GenBank中公布的PRV gE基因和PCV3基因组序列,且基于PRV gE和PCV3 Rep基因的保守区域,利用Primer 5.0引物设计软件设计了2对特异性引物,随后对其扩增条件进行优化,建立了能够同时检测PRV和PCV3的双重PCR检测方法。该方法可以同时扩增PRV的429 bp和PCV3的344 bp特异性片段,而对猪圆环病毒2型、猪细小病毒、猪瘟病毒、猪繁殖障碍与呼吸综合征病毒、猪流行性腹泻病毒基因组扩增结果均为阴性。PRV和PCV3的最低检测值分别为502.0和91.2 copies/μL。结果表明该方法具有良好的特异性和灵敏性。本试验建立了能够同时快速检测PRV和PCV3,且具有高度特异性和灵敏性的双重PCR检测方法,为PRV和PCV3的检测提供技术支持。     

猪细小病毒、猪伪狂犬病毒和猪圆环病毒2型多重PCR方法的建立及初步应用

根据GenBank中猪细小病毒(PPV)、猪伪狂犬病毒(PRV)和猪圆环病毒2型(PCV2)3种病原体的基因保守序列,分别设计了3对检测引物。在建立各病毒单项PCR技术的基础上,用这3对引物对人为混合的样品中的PPV、PRV和PCV2的DNA模板进行多重PCR扩增和多重PCR反应条件的优化,结果同时得到3条与试验设计相符的251bp(PPV)、375bp(PRV)和493bp(PCV2)特异性条带。对20份自然感染病猪样品的检测结果表明,该多重PCR检测结果与单项PCR检测对比检测试验的符合率为100%,表明建立的多重PCR检测方法具有特异、快速、准确的特点,可同时鉴别诊断这3种病毒。     

多重POR检测CSFV和PRRSV与PCV2

根据GenBank上猪瘟病毒（CSFV）、猪繁殖与呼吸综合征（PRRSV）和猪圆环病毒2型（PCV2）的已发表序列,分别设计并合成了3对特异性扩增引物,建立CSFV、PRRSV和PCV2单项PCR检测方法,分别扩增出预期的466bp、202bp和706bp片段。在优化单项PCR反应条件基础上,建立了CSFV—PRRSV—PCV2多重PCR检测方法,为预防和控制上述三种病毒性传染病提供了一种快速、敏感、特异的检测方法。     

猪圆环病毒2型巢式PCR检测方法的建立与初步应用

猪圆环病毒2型(porcine circovirus type 2,PCV2)给养猪业造成了重大的经济损失,建立经济、快速的检测方法尤为重要。本研究旨在利用巢式PCR技术,建立高灵敏度PCV2检测平台,以加强对猪圆环病毒病的防控。根据PCV2 ORF2基因保守区,设计内、外2对巢式PCR引物,通过优化PCR反应条件,建立巢式PCR检测方法,并对猪场临床样本进行检测。结果显示,本研究建立的巢式PCR检测方法灵敏度高、重复性强,最低检出量为10拷贝/μL,检出率达97.3%。本研究建立的巢式PCR检测方法为快速、高效地检测PCV2以及为猪圆环病毒病的防控提供有力手段。     

猪主要DNA病毒多重二温式PCR检测方法的建立及初步应用

通过对GenBank发布的猪细小病毒(PPV)、伪狂犬病毒(PRV)和猪圆环病毒2型(PCV2)的核苷酸序列进行比对分析,找出PPV的VP2基因,PRV的gH基因和PCV2的ORF2基因的相对保守区域。利用生物学软件在保守序列分别设计高溶解温度引物,将常规三温式PCR过程中的退火与延伸合并为一步,通过对PCR反应条件的优化,确定最佳引物浓度、最佳聚合酶浓度、最佳退火温度以及最佳反应体积,建立了多重二温式PCR方法检测PPV、PRV和PCV2,其扩增的目的片断大小分别为PPV(142 bp)、PRV(300 bp)和PCV2(469 bp),从而节省临床检测时间,同时又能通过一个反应体系对PPV、PRV和PCV2 3种猪主要DNA病毒进行检测。用30份临床病料对本研究多重PCR技术和单项PCR技术进行对比验证,结果显示,两者的总符合率为95%以上。表明建立的多重PCR检测方法,具有高度特异、快速、敏感等特点,可用于对这3种病毒的同时检测和鉴别诊断。     

PRRSV和PCV-2二重PCR检测方法的建立及初步应用

参考GenBank上已发表的猪繁殖与呼吸综合征病毒Nsp2基因序列和猪圆环病毒2型ORF1基因序列,分别设计并合成了可用于检测猪繁殖与呼吸综合征病毒和猪圆环病毒2型的2对引物,扩增目的片段大小分别为421 bp和714 bp。在建立了用于检测猪繁殖与呼吸综合征病毒和猪圆环病毒2型的单项PCR检测方法并优化单项PCR条件的基础上,建立了针对两种病毒的二重PCR检测方法。通过检测143份临床病料对二重PCR方法和单项PCR/RT-PCR方法进行了对比验证。结果显示,两者的总符合率在92.6%以上,表明该二重PCR检测方法可以用于临床病料的检测。     

PCV2、PPV、PRV、PRRSV和CSFV复合PCR检测方法的建立

根据GenBank上猪圆环病毒2型（PCV2）、猪细小病毒（PPV）、猪伪狂犬病病毒（PRV）、猪繁殖与呼吸综合征（PRRSV）和猪瘟病毒（CSFV）的已发表序列,分别设计并合成了5对特异性扩增引物,建立PCV2、PPV、PRV、PRRSV和CSFV单项PCR检测方法,分别扩增出预期的466bp、759bp、349bp、202bp和706bp片段。在优化单项PCR反应条件基础上,建立了PCV2．PPV-PRV-PRRSV-CSFV复合PCR检测方法,为预防和控制上述几种病毒性传染病提供了一种快速、敏感、特异的检测方法。     

多重PCR检测CSFV和PRRSV与PCV2

根据GenBank上猪瘟病毒(CSFV)、猪繁殖与呼吸综合征(PRRSV)和猪圆环病毒2型(PCV2)的已发表序列,分别设计并合成了3对特异性扩增引物,建立CSFV、PRRSV和PCV2单项PCR检测方法,分别扩增出预期的466 bp、202 bp和706 bp片段。在优化单项PCR反应条件基础上,建立了CSFV-PRRSV-PCV2多重PCR检测方法,为预防和控制上述三种病毒性传染病提供了一种快速、敏感、特异的检测方法。     

猪捷申病毒与猪圆环病毒2型双重PCR检测方法的建立及初步应用

为建立可同时检测猪捷申病毒（PTV）与猪圆环病毒2型（PCV2）的双重PCR方法,本研究根据GenBank登录的相关病毒基因序列,选择保守区域设计引物,经过反应条件的优化,建立了可同时检测以上2种病毒的PCR诊断方法,扩增片段长度分别为187bp（PTV）、120bp（PCV2）。通过实验证明该方法具有良好的特异性和较高的敏感性,对PTV、PCV2核酸检测最低浓度分别为2．8×10^-2ng和6．6×10^-3ng。应用该方法对43份临床样品进行检测发现,PTV阳性率为23％,PCV2阳性率为38％,PTV与PCV2共感染率为16％。该方法的成功建立,为快速高效地检测以上2种病毒提供有力手段。     

猪圆环病毒2型SYBR Green Ⅰ荧光定量PCR检测方法的建立

为了建立猪圆环病毒2型(PCV2)SYBR GreenⅠ荧光定量PCR检测方法,采用PCR扩增PCV2 ORF2基因242 bp片段,并克隆入pMD18-T载体中,以纯化的重组质粒为模板作荧光定量PCR扩增,建立了PCV2荧光定量PCR检测方法,该方法检测灵敏度可达1.2×10~1拷贝/μL,与猪圆环病毒1型(PCV1)、猪瘟病毒(CSFV)、猪蓝耳病病毒(PRRSV)、猪细小病毒(PPV)、猪伪狂犬病病毒(PRV)、乙型脑炎病毒(JEV)核酸均不发生扩增反应,具有很好的特异性和重复性。结果表明:建立的PCV2实时荧光定量PCR检测方法具有特异、敏感、快速、定量、重复性好等优点,可用于临床PCV2的检测。     

猪圆环病毒2型和3型双重PCR鉴别检测方法的建立及应用

为建立一种鉴别检测猪圆环病毒2型(PCV-3)和3型(PCV-3)的方法,本研究根据GenBank中PCV-2、PCV-3基因序列分别设计合成特异性检测引物,经过双重PCR反应条件的优化,建立了鉴别检测PCV-2和PCV-3的双重PCR方法。该方法对PCV-2、PCV-3、PCV-2/PCV-3混合物可分别扩增出300 bp、518 bp、300 bp和518 bp的特异性条带,检测PRV、PPV、PRRSV、CSFV、TGEV、PEDV均为阴性,对PCV-2/PCV-3混合物的检测灵敏度达2.1 ng DNA,与PCV-2和PCV-3单项PCR方法的符合率均为100%。该方法在检测136份临床病料样品的应用中,PCV-2阳性率达23.53%(32/136),PCV-3阳性率达18.38%(25/136),PCV-2/PCV-3混合感染率达7.35%(10/136),说明青海省部分地区猪群中存在PCV-2、PCV-3的流行,且存在PCV-2和PCV-3的混合感染。表明该双重PCR具有良好的特异性、敏感性、重复性、准确性和临床适用性,可以用于临床病料中PCV-2和PCV-3的快速低含量鉴别检测,将为PCV-2和PCV-3感染的临床鉴别诊断和流行病学监测提供了一种简便适用的方法,为我国猪圆环病毒病的综合防控提供技术支持。     

猪圆环病毒2型SYBR Green I荧光定量PCR检测方法的建立

为了建立猪圆环病毒2型（PCV2）SYBR Green I荧光定量PCR检测方法,采用PCR扩增PCV2 ORF2基因242 bp片段,并克隆入pMD18-T载体中,以纯化的重组质粒为模板作荧光定量PCR扩增,建立了PCV2荧光定量PCR检测方法,该方法检测灵敏度可达1.2×101拷贝/μL,与猪圆环病毒1型（PCV1）、猪瘟病毒（CSFV）、猪蓝耳病病毒（PRRSV）、猪细小病毒（PPV）、猪伪狂犬病病毒（PRV）、乙型脑炎病毒（JEV）核酸均不发生扩增反应,具有很好的特异性和重复性。结果表明：建立的PCV2实时荧光定量PCR检测方法具有特异、敏感、快速、定量、重复性好等优点,可用于临床PCV2的检测。     

多重PCR快速检测猪伪狂犬病病毒、猪圆环病毒2型方法的建立

根据GenBank上猪伪狂犬病病毒（PRV）、猪圆环病毒2型（PCV2）的已知序列,利用Primer Premier 5.0及DNAstar软件对上述病毒基因保守区进行引物设计,选出扩增序列为PRV gB基因373 bp、PCV2 ORF2基因430 bp两对引物。在优化单项PCR反应条件基础上,建立了PRV-PCV2两重PCR检测方法。敏感性及特异性试验结果显示,该mPCR对2种病毒的核酸检测可至1.47×10-6~1.62×10-6 ng,而对灭菌双蒸水、猪细小病毒（PPV）猪繁殖与呼吸障碍综合征病毒（PRRSV）、猪瘟病毒（CSFV）多重PCR的扩增结果均为阴性,作为临床上猪伪狂犬病和猪圆环病毒2型感染的病原学快速诊断方法具有可行性。     

Ⅱ型猪细环病毒及Ⅱ型猪圆环病毒双重荧光定量PCR检测方法的建立

为了在临床上能够同时、快速、准确的检测Ⅱ型猪细环病毒(TTSuV2)和Ⅱ型猪圆环病毒(PCV2),本试验根据GenBank上公布的TTSuV2和PCV2序列中的高度保守片段设计引物,并分别合成标记羧基荧光素试剂(FAM)和六氯荧光素(HEX)报告基团的探针,建立双重荧光定量PCR检测方法,并对该方法的灵敏度、稳定性和特异性进行评价。结果显示,建立的双重荧光定量PCR检测方法对TTSuV2和PCV2的最低检测浓度均为1×10~2拷贝/μL,与猪源的其他病毒性病原体无交叉反应。应用建立的检测方法对采集的300份病料样品进行检测。结果显示,PCV2单独感染率为36.0%,TTSuV2单独感染率为60.0%,2种病毒混合感染率为14.8%。表明本试验建立的双重荧光定量PCR检测方法比普通PCR更加敏感,可应用于临床检测TTSuV2和PCV2,并可分析TTSuV2和PCV2的载量与相关疾病的关系。     

PCV2和PCV3双重纳米PCR方法的建立及初步应用

本研究旨在建立一种同时检测猪圆环病毒2型（PCV2）和猪圆环病毒3型（PCV3）的双重纳米PCR（nano-dPCR）方法,同时应用该方法对PCV2和PCV3进行检测。参考GenBank中登录的PCV2和PCV3型基因序列分别设计特异性引物,对nano-dPCR的反应条件进行优化;同时考察所建立的nano-dPCR检测方法的特异性和敏感性。结果显示,所建方法的特异性和敏感性良好,对PCV2和PCV3两种病毒的最低核酸检测量分别为93.2和91.6拷贝/μL,其敏感性比普通PCR高100倍。应用该方法对送检的265份临床样本进行检测,结果显示,PCV2和PCV3在猪群中存在普遍感染,PCV3和PCV2的阳性率分别为16.6%和14.7%,混合感染阳性率为6.8%。临床样品的检测结果表明,本试验建立的nano-dPCR方法为PCV2和PCV3早期感染进行快速、敏感鉴别诊断提供了新方法。     

猪圆环病毒2型和3型检测方法建立及初步应用

为快速检测并鉴别猪圆环病毒2型(PCV2)和猪圆环病毒3型(PCV3)病毒。本文研究参考GenBank中PCV2和PCV3高度保守片段分别设计了探针引物,成功建立了一种双重TaqMan荧光定量检测方法。结果显示：该方法特异性好,可鉴别 PCV2、PCV3与其他猪病病毒;PCV2最低检测下限为1.00×10¹ copies/μL,PCV3最低检测下限为1.00×10⁰ copies/μL;重复性高,批内、批间的变异系数分别为0.01%～0.02%和0.02%～0.05%;本研究采用建立的方法与商品试剂盒同步检测猪只样品440份,PCV2样品符合率为97.47%,PCV3样品符合率为96.85%;测序结果显示,PCV2均为2d亚型,PCV3均为3c亚型。结果表明,建立的双重TaqMan荧光定量检测方法具有良好的特异性、敏感性且快速、准确,节约成本,可为PCV2和PCV3的监测与防控提供技术支撑。     

猪细小病毒、猪伪狂犬病病毒和猪圆环病毒2型多重PCR检测方法的建立与应用

根据GenBank中已发表的猪细小病毒(porcine parvovirus,PPV)、猪伪狂犬病病毒(pseudorabies virus,PRV)和猪圆环病毒2型 (porcine circovirus type 2,PCV2)基因序列,对各病毒基因区进行同源性分析,确定PPV 的VP2、PRV的 gD、和PCV2的ORF2基因为各病毒的诊断靶序列,设计特异性引物,在建立各病毒单项PCR技术的基础上,优化多重PCR反应条件,建立了3种病毒的多重PCR技术,可同时扩增PPV 313 bp、 PRV 217 bp和PCV2 447 bp的特异性片段。用多重PCR技术与单项PCR技术对比检测试验证明两者的符合率为100％,表明建立的多重PCR检测方法,具有特异、快速、准确的特点,可同时鉴别诊断这3种病毒。从10个发病猪场和门诊病例的病猪采集的211份样品,用建立的多重PCR检测方法,检出PPV阳性42份,阳性率为19.91%;PRV阳性26份,阳性率为12.32%;PCV2阳性56份,阳性率为26.54%;2种以上病毒混合感染25份,混合感染阳性率为11.85%。检测结果表明,山西省猪群已感染这3种疫病。