葡萄霜霉病拮抗细菌N22的筛选鉴定及其防效初探

采用叶盘法筛选到1株防治葡萄霜霉病效果较好的芽孢杆菌N22菌株,并对该菌株进行了鉴定。结果表明,用N22菌株的16S r DNA序列与其相关种属进行比对,其序列与解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)及枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)都具有100%的相似性。系统发育分析也表明,N22菌株和枯草芽孢杆菌及解淀粉芽孢杆菌聚在一个枝上。经进一步克隆了该菌株的gyr A基因序列,其比对结果中相似度高的菌株中只出现了解淀粉芽孢杆菌,其Query cover达到91%。因此,该菌株最终鉴定为解淀粉芽孢杆菌。以解淀粉芽孢杆菌N22菌株的田间防效显示,当发酵液菌体孢子含量为10~7个/m L的防治效果最好,防效可达76.94%。     

GFP标记生防细菌B579及其定殖能力检测

 利用绿色荧光蛋白（Green fluorescent protein, GFP）标记靶标微生物是目前研究微生物和宿主互作的重要手段。在本研究中,作者用电击转化的方法将携带质粒gfpmut3a基因的穿梭载体pGFP4412导入生防枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）B579中,并得到成功表达GFP的枯草芽孢杆菌B579-gfp。用抗生素平板回收结合激光扫描共聚焦显微镜（LSCM）观察对枯草芽孢杆菌B579-gfp在盆栽的黄瓜根表定殖情况进行了研究,结果表明：标记菌株在激发光波长为488 nm的蓝光下可观察到亮绿色的荧光;B579-gfp菌体能够定殖在黄瓜根部,在根基部和中部都有菌体聚集而形成膜状结构,在根的分叉和根冠处可观察到大量B579-gfp定殖;浸种、蘸根以及灌根接种均可回收到大量的B579-gfp,分别为4.0×10³、1.0×10⁴和2.0×10² cfu/g。     

芽孢杆菌几丁质酶基因的克隆、序列分析及其在伯克氏菌B418中的表达

采用PCR技术扩增到枯草芽孢杆菌几丁质酶基因的编码序列。片段共2227bp,含有一个具有1788个核苷酸的开放阅读框架,起始密码子位于211bp,终止密码子位于1998bp,共编码氨基酸605个。序列比较发现同已发表的枯草芽孢杆菌几丁质酶核苷酸具有99.39%的同源性。将该基因与大肠杆菌-伯克氏菌穿梭质粒pRK415连接,获得重组质粒pRChi113。重组质粒电击转入伯克氏菌B418中,获得工程菌株B418-9、B418-13。与野生菌株B418相比,平板拮抗试验表明,工程菌株B418-9、B418-13对大丽花轮枝孢、立枯丝核菌、麦根腐长蠕孢、禾谷丝核菌抑菌效果明显提高。     

地衣芽胞杆菌HS10原生质电转化体系的研究

地衣芽胞杆菌Bacillus licheniformis HS10及其粗蛋白对多种病原真菌具有防治效果,为挖掘其生防功能基因,本研究通过对原生质体的制备、再生培养基、渗透压稳定剂、电击参数等试验条件进行优化,建立了地衣芽胞杆菌HS10原生质体电转化法。结果表明最佳转化条件为:转接培养10h达到对数生长后期的菌体,浓缩4倍后,利用终浓度1mg/mL的溶菌酶,于37℃、150r/min酶解20min,酶解效率达到99.34%,1×SMM洗涤3次,调整菌浓度至1.0×108 cfu/mL,并通过1.6kV、5ms的电击后,迅速在SMMP溶液中100r/min、37℃恢复6~10h,涂布于含Kan和Erm的再生培养基DM3平板。将该方法用于突变体库构建的质粒pMarA(8 253bp)和基因敲除质粒pMADΔCP(13 043bp)的大片段质粒转化,分别获得了37cfu/μg DNA和10cfu/μg DNA阳性转化子。该遗传转化体系为地衣芽胞杆菌HS10中相关基因功能的研究提供了技术支撑。     

井冈霉素对3种生防芽孢杆菌的生长抑制活性

管碟法测定了井冈霉素对12株枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）、6株苏云金芽孢杆菌（B．thuringiensis）及3株蜡质芽孢杆菌（Bacillus cereus）的离体抑制活性。结果表明,不同种以及同种不同菌株的芽孢杆菌对井冈霉素的敏感性存在差异,但从总体上看,井冈霉素A对大多数枯草芽孢杆菌的抑制作用较强．而对大多数蜡质芽孢杆菌和苏云金芽孢杆菌的抑制活性较低,在1．00×10^5mg／L浓度下仅有轻微的抑制作用。     

ywbB基因对枯草芽胞杆菌NCD-2菌株生物膜形成和根际定殖能力的影响

为明确枯草芽胞杆菌Bacillus subtilis NCD-2菌株生物膜形成相关基因及其在生物膜形成、根际定殖中的作用,采用转座子插入技术,从4000余株NCD-2突变子中获得6株生物膜形成能力降低的突变子。在生物膜形成能力丧失的突变子M3中,转座子以单拷贝的形式插入到ywbB基因内部。通过基因同源重组技术对ywbB基因进行缺失突变,获得ywbB基因缺失突变菌株NCD-2(ΔywbB),与野生菌株相比,突变子丧失了生物膜形成能力。进一步比较发现,突变菌株NCD-2(ΔywbB)显著降低了在棉花根际的群体数量,同时也降低了对棉花立枯病的防治效果。研究证明,ywbB是NCD-2菌株生物膜形成途径中的重要基因,且生物膜形成与NCD-2菌株根际定殖和生防效果呈正相关。     

GFP标记的多粘芽孢杆菌1114在番茄根际的定殖

多粘芽孢杆菌Paenibacillus polymyxa菌株1114对多种植物病原菌具有良好的防治效果。为研究其在作物根际土壤中的迁移和定殖规律,通过电击转化引入绿色荧光标记质粒pB-SVG101,得到稳定表达的荧光标记菌株,转化后的菌株对青枯菌Ralstonia solanacearum仍保持良好的抑制效果。通过多种接种方法,发现该菌株能通过浸根的方式侵入番茄的维管组织和周围细胞。     

At7基因在植物内生芽孢杆菌A47中的表达及生物学功能测定

蜡样芽孢杆菌A47菌株(Bacillus cereus A47) 是从植物体内分离得到的对多种作物具有良好防病、促生、改善品质、提高抗逆性等功能的有益内生芽孢杆菌。田涛等人(2004)把来自质粒pAD4412 的启动子和gfpmut3a基因插入大肠杆菌-芽孢杆菌穿梭载体pBE2,构建了芽孢杆菌表达GFP的载体pGFP4412。在本研究中,用PCR的方法将信号肽序列连接到At7基因上,将该基因连同含有4412 启动子的载体pGFP4412连接,构建了重组载体 pSAt7-4412。用重组载体转化野生型生防芽孢杆菌A47菌株,获得转基因工程菌株。经过对工程菌株质粒遗传稳定性研究表明,重组质粒pSAt7-     

利用16S rDNA结合gyrA和gyrB基因对生防芽孢杆菌R31的快速鉴定

克隆16S rDNA、DNA促旋酶A亚基编码基因gyrA和B亚基编码基因gyrB对分离自石斛兰（Dendrobiumsp.）叶片的广谱抗真菌生防芽孢杆菌R31进行鉴定。首先通过生理生化测定和克隆16S rDNA序列,分析显示其属于芽孢杆菌属（Bacillus）,但不能准确鉴定到种;然后分别利用克隆的gyrA基因和gyrB基因以及其BLAST分析结果构建系统发育树,最终将该菌株确定为枯草芽孢杆菌（B.subtilis）。结果显示利用16S rDNA与gyrA基因组合可以快速鉴定枯草芽孢杆菌,利用16S rDNA与gyrB基因组合可以快速鉴定枯草芽孢杆菌及其近缘种。     

枯草芽胞杆菌NCD-2中调控因子PhoP对fengycin合成的调控作用

 PhoR/PhoP双因子调控系统是枯草芽胞杆菌中一个重要的全局性调控系统, 在低磷环境下, 感应激酶PhoR自磷酸化, 并且将获得的磷酸基团转移到调控因子PhoP上, 从而激活PhoP的调控活性。为了明确调控因子PhoP对枯草芽胞杆菌NCD-2菌株中主要抑菌活性物质-fengycin合成能力的调控作用, 本研究通过同源重组技术缺失突变NCD-2菌株中的phoP基因, 拮抗活性测定结果表明, phoP基因缺失菌株显著降低了对立枯丝核菌的抑菌活性。通过快速蛋白质液相色谱(FPLC)技术比较了NCD-2菌株野生型及其phoP基因突变子fengycin的合成能力, 结果证明, phoP基因突变菌株降低了fengycin的合成能力。对突变子进行phoP基因互补发现, 互补phoP基因可使突变子的相关性状恢复到野生型菌株水平。以上结果证明, phoP基因对枯草芽胞杆菌NCD-2菌株中fengycin的合成具有正调控功能。     

棉花根系分泌物对枯草芽胞杆菌NCD-2生物膜形成和根际定殖的影响

 为明确棉花根系分泌物对生防枯草芽胞杆菌NCD-2生物膜形成的影响,本研究首先比较了菌株NCD-2在不同棉花品种(冀棉11、中棉所41、中植棉2号、鲁棉29和海岛棉Pima90)根际的定殖能力。结果表明,菌株NCD-2在Pima90的根际定殖能力最强,播种35 d后在根际的群体数量达到7.63×10⁵ CFU·g^-1根重;而在中植棉2号的根际定殖能力最弱,播种35 d后根际菌株NCD-2的群体数量为6.51×10⁴ CFU·g^-1根重。通过再循环水培系统收集根系分泌物的方法获得了不同棉花品种的根系分泌物,测定了其对菌株NCD-2生物膜形成的影响。结果表明,海岛棉Pima90的根系分泌物对该菌株生物膜形成的促进作用最强,而中植棉2号的根系分泌物对菌株NCD-2生物膜形成影响最弱。进一步分析了棉花根系分泌物中6种糖分和13种氨基酸对菌株NCD-2生物膜形成的影响,结果发现,葡聚糖和脯氨酸显著促进了该菌株的生物膜形成。     

香梨果萼黑斑病菌Alternaria alternata遗传转化体系的建立及GFP标记菌株的获得

 为建立香梨果萼黑斑病菌链格孢(Alternaria alternata)的原生质体遗传转化体系,本实验以香梨果萼黑斑病菌强致病性菌株LI1为供试材料,研究菌龄、酶系统、酶解时间等对链格孢菌原生质体制备的影响。链格孢菌菌丝在CM液体培养基中培养20 h,以0.7 mol·L^-1 NaCl为稳渗剂,1%裂解酶+1%崩溃酶+1%蜗牛酶的酶液组合下,28 ℃酶解4 h,原生质体制备效率最高。通过PEG/CaCl₂介导法将含有潮霉素B抗性基因和绿色荧光蛋白基因的质粒转入链格孢菌LI1,转化子生长表型及外源基因的PCR鉴定结果表明抗性基因已成功整合到香梨果萼黑斑病菌中。成功建立了香梨果萼黑斑病菌链格孢菌的原生质体遗传转化体系,并成功获得GFP标记菌株,为病原菌侵染定殖过程及致病机制研究奠定了基础。     

高寒地区芸豆氮肥与密度优化组合模式研究

以黑龙江省北部主栽芸豆品种英国红为试验材料,分析了氮肥和密度对生育期、形态特征、产量、产量构成因素、商品与营养品质等方面的影响。结果表明:N肥会显著增加各个生育时期和生育期的天数,低密度时差异不显著,超过20万株·hm-2差异显著。单株荚数、单荚粒数和百粒重随着密度的增加而降低,各氮肥处理间差异不显著;芸豆的商品率随着密度的增大而降低;N肥45 kg·hm-2和密度10万株·hm-2的组合脂肪含量最大为1.51%,各处理间差异显著;蛋白质最大值出现在N肥60 kg·hm-2和10万株·hm-2的密度与氮肥组合上,最大值为14.55%,与N肥45 kg·hm-2和10万株·hm-2组合差异不显著,与其它组合间差异显著;N30 kg·hm-2和20万株·hm-2组合产量最高,为3 418.56 kg·hm-2,与N肥45 kg·hm-2和15万株·hm-2组合产量(3 417.46 kg·hm-2)相当,与其他组合间差异显著。综合种植的经济效益和品质分析,最为理想栽培模式为N肥45 kg·hm-2和15万株·hm-2组合。     

甲基营养型芽胞杆菌AL7对棉花黄萎病的盆栽防治效果及定殖能力

为了探明甲基营养型芽胞杆菌AL7对棉花黄萎病的防治效果及其定殖能力,本文利用盆栽接种试验研究了菌株AL7对棉花黄萎病的防治效果;将带四环素抗性的pGFP78质粒转入到菌株AL7中,分析了菌株AL7在棉花根围土壤中、根部组织内的定殖情况。结果表明,菌株AL7对棉花黄萎病的盆栽防治效果为77.1%。pGFP78质粒转入后对菌株AL7的生长没有明显影响,仍具有游动性和产生物膜。定殖检测结果表明,菌株AL7能够在棉花根围土壤中及根系组织内长期定殖,接种5 d时定殖数量最高,达6×10~6cfu/g土,接种80 d后根围土壤中的定殖数量仍维持在2×10~6 cfu/g,根系组织内的定殖量为6×10~4 cfu/g。利用激光共聚焦显微镜观察验证,接种7 d后菌株AL7已经进入到棉花根部的中柱鞘细胞,能够在棉花根内大量定殖。     

L-脯氨酸对枯草芽胞杆菌NCD-2菌株生物膜形成的影响

 枯草芽胞杆菌 NCD-2菌株在棉花品种‘冀棉11'根际的定殖能力与其根系分泌物中的L-脯氨酸相关。本研究通过外源添加L-脯氨酸评价其对NCD-2菌株生长量和生物膜形成的影响。结果表明,在MSgg培养基中添加L-脯氨酸培养48 h后对菌株生长不存在显著影响。采用称重法测定生物膜的湿重和干重,结果表明在MSgg培养基添加L-脯氨酸显著增加了生物膜产量,且生物膜的褶皱程度和立体结构变得更为明显。采用结晶紫染色法进行生物膜的定量测定发现,浓度为1.250～10.000 mg·mL^-1的L-脯氨酸可以显著提高菌株生物膜形成能力,而低浓度0.625 mg·mL^-1 的L-脯氨酸对生物膜形成无影响。通过RT-qPCR检测了NCD-2菌株生物膜形成相关基因tasA和epsA表达量的变化,结果表明,添加上述不同浓度L-脯氨酸能够显著提高tasA基因表达量,提高了2.53~9.98倍。除了浓度为0.625 mg·mL^-1 L-脯氨酸可提高epsA基因表达外,其他浓度没有显著改变epsA基因的表达,而且epsA基因表达量低于tasA基因。综合分析表明,L-脯氨酸促进NCD-2菌株生物膜形成不是通过改变菌株生长量,而是诱导tasA基因的表达产生更多的胞外蛋白TasA。     

蜡样芽孢杆菌ANTI-8098A在番茄内的定殖和对青枯病的防治研究

本文研究了生防菌ANTI-8098A在番茄植株内的定殖及其对青枯病的生防特性,采用激光共聚焦显微技术观察了GFP标记菌株ANTI-8098A:pCM20在番茄根系的分布.ANTI-8098A及其标记菌株可很好地定殖于番茄植株内,在根内定殖浓度最高,达104～105cfu·g-1,茎部、叶片内次之,达103～104cfu·g-1;ANTI-8098A处理后番茄根系PPO活性显著提高,对番茄叶绿素含量有短期效应;处理后5～15d番茄根际微生物数量略低于对照,其后逐渐与对照趋于一致;ANTI-8098A及其标记菌株对青枯病的防效存在一定差异,平均防效为57.1%～100%.     

甘薯褪绿矮化病毒西非株系实时荧光定量PCR检测方法的建立及应用

 依据GenBank中登录的甘薯褪绿矮化病毒(Sweet potato chlorotic stunt virus,SPCSV)西非株系(WA)的核苷酸序列,分别设计两对特异性引物和一条TaqMan探针。以SPCSV-WA外壳蛋白(cp)基因的重组质粒为阳性标准质粒绘制标准曲线,通过优化反应体系和反应条件,建立了SPCSV-WA的实时荧光定量PCR检测方法。试验结果表明,该方法只能检测到目的病毒,标准曲线的斜率和相关系数分别为-3.239和1,扩增效率为103.568%。最低可检测到约3.31 copies/μL的阳性质粒,灵敏度比常规PCR高1 000倍。本研究建立的SPCSV实时荧光定量PCR方法可用于田间样品的检测,为SPCSV的早期预警和流行学研究提供了技术手段。     

防治棉花黄萎病的生防细菌NCD-2的田间效果评价及其鉴定

 生防细菌NCD-2是自棉花根围土壤分离到的一株细菌菌株,田间小区试验表明:NCD-2菌株对棉花黄萎病的防治效果2年平均为85.4%,3年大区示范防病效果为51.2%~60.6%,并且该生防细菌对棉花产量和产量构成因子(单铃重、衣分、衣指、籽指等)及纤维品质(绒长)有所提高和改善。同时,本文测定了NCD-2对主要大田作物的安全性,证明其对小麦、玉米、棉花、马铃薯、黄瓜、茄子和大豆7种作物没有致病性,并且对这些作物的出苗、生长和发育没有不良影响。应用API50CH和API20 E细菌鉴定试剂盒,将NCD-2鉴定为枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis Cohn.)。     

香蕉枯萎病菌TR4原生质体转化和基因敲除体系构建

正香蕉枯萎病是一种典型的维管束和土传真菌病害,也是最具毁灭性的植物病害之一~([1])。香蕉一旦感病,很难结果,而且目前尚无有效的防治措施~([1])。因此,研究植物病原菌侵染进程和致病机制,可以拓宽思路以寻求植物病害防治新途径。香蕉枯萎病是由尖孢镰刀菌古巴专化型(Fusarium oxysporum f.sp.cubense,Foc)侵染所致~([1])。对生产影响最大的Foc是侵染包括大蜜哈、     

梅奇酵母XY201对冬枣采后病原真菌的抑制效果

本文对梅奇酵母Metschnikowia zizyphicola XY201进行了生物量最大值培养时间、不同环境条件下的活力变化及其对冬枣采后病原真菌抑制效果的研究。结果表明,梅奇酵母XY201菌株在NYDB培养基中培养96h后,菌体生物量达最大值3.84×108cfu/ml。XY201在20℃、4℃和0℃三个不同温度和不同介质条件下的生活力变化不同,0℃培养液菌体生活力最强,240d时菌液浓度为6.46×107cfu/ml。XY201能显著抑制冬枣采后病原菌扩展青霉Penicillium expansum、细极链格孢Alternaria alternata、黑曲霉Aspergillus niger和黑根霉Rhizopus nigricans的孢子萌发和菌丝伸长;当酵母菌浓度为5×108cfu/ml时,对病原菌的抑制率可达100%。对峙培养结果显示XY201对A.alternata生长的抑制率为42.59%。