基于营养竞争原理的大豆根腐病生防芽孢杆菌的筛选及其特性研究

利用营养竞争平板筛选法获得了可在大豆麦麸(SWB)培养基上快速生长并拮抗大豆根腐病菌Fusarium oxysporum和F.solani的芽孢杆菌菌株B006和B010。通过16S rDNA序列分析、形态观察和生理生化性状测定,将其鉴定为枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)。田间小区试验结果表明,以种子处理(108cfu/mL,药种比为1∶60)和以麦麸为载体的固体菌剂土壤沟施(106cfu/g,用量195 kg/ha)B006和B010菌剂对真叶期大豆根腐病的防治效果分别为74.6%和63.5%,高于商品化学农药35%多福合剂种子处理的防效(P=0.05),大豆产量分别增加13.8%和24.0%。利用特异引物对生防功能基因的扩增结果表明,bmyB、fenD、bioA和srfAA基因以及srfAB基因簇的片段在2个菌株中均存在,而ituC基因仅存在于B010菌株中。对菌株生防功能基因的分析有助于今后高效菌株的快速筛选和对生防菌作用机制的研究。     

冻土荒漠区分离低温适生PGPR菌的鉴定及其抗菌促生特性

对分离自青海昆仑山口冻土荒漠区植被根围的7株可在4及10℃低温条件下正常生长的低温适生菌进行鉴定分析,并检测其拮抗病原菌活性及催芽促生特性。综合理化测定、BOX-PCR 及 ERIC-PCR 指纹图谱分析、16S rDNA及基因gyrB序列鉴定结果,其中6株菌株为简单芽孢杆菌Bacillus simplex,1株菌株为B. malacitensis。平板对峙试验表明,7株菌株对油菜菌核病原菌Sclerotinia sclerotiorum及水稻白叶枯病原菌 Xanthomonas oryzae pv. oryzae 具有显著拮抗效果。以菌株 KLD2（B. simplex）及 KLD5（B. malacitensis）发酵菌液处理玉米种子及拟南芥幼苗,结果表明菌株发酵液可明显促进种子萌发及幼苗生长,其鲜重、根长、须根数等表征均有显著增加。几株低温适生PGPR（plant growth promoting rhizobacteria）芽孢杆菌具备抗菌、催芽及促生特性,具有农业应用潜力。     

高寒草甸根围拮抗芽孢杆菌筛选鉴定及脂肽化合物分析

本研究通过平板对峙法分别从青海日月山及达日地区高寒草甸根围分离菌株中筛选到8株对油菜菌核病菌Sclerotinia sclerotiorum及水稻白叶枯病菌Xanthomonas oryzae pv.oryzae均具有明显拮抗效果的芽孢杆菌菌株RYS41、RYS42、RYS43、RYS44、DR1、DR2、DR3及DR20。生理生化、脂肪酸甲脂、16S rDNA及gyrB基因测序等分析结果表明,菌株RYS41、RYS42、RYS43、RYS44为解淀粉芽孢杆菌Bacillusamyloliquefaciens;菌株DR1、DR2、DR3、DR20鉴定为短小芽孢杆菌B.pumilus。MALDI-TOF-MS质谱分析结果表明,菌株RYS41产生脂肽类化合物Surfactin、Bacillomycins D和Fengycin,菌株DR20产生脂肽类化合物Surfactin、IturinA和Fengycin,推断可能与对油菜菌核菌及水稻白叶枯病菌的拮抗作用有关。     

对大丽轮枝菌具有拮抗作用的萎缩芽胞杆菌的分离和鉴定

旨在从新疆棉花主产区的土壤中分离对重要植物病原菌大丽轮枝菌的拮抗菌,鉴定其种类,并探讨其应用前景。采用平板对峙培养法对抗性菌株、发酵滤液进行初步筛选,并对其发酵滤液热稳定性进行测试,采用16S rDNA和gyrB基因序列分析的方法确定该菌的分类地位。共分离出61株对大丽轮枝菌拮抗菌,其中59号菌株拮抗活性强,产色素,其发酵滤液经100 ℃加热5 min后,仍然具有抑菌活性,抑菌圈直径为15.8 mm,盆栽试验结果表明该菌对大丽轮枝菌具有良好的拮抗作用,并能促进棉苗生长。经过16S rDNA和gyrB基因相结合构建的系统发育树分析,结果显示59号等9株菌株为萎缩芽胞杆菌（Bacillus atrophaeus）。这是萎缩芽胞杆菌对大丽轮枝菌有拮抗作用的首次报道。     

生防细菌BRF-1和BRF-2鉴定及生物学特征

BRF-1和BRF-2是从大豆根际土壤中筛选得到的两株革兰氏阳性生防细菌,平板对峙培养表明它们对7种植物病原真菌具有拮抗作用。BRF-1芽孢球型中生,无鞭毛;而BRF-2芽孢球型端生,周生鞭毛。部分生物学特征研究表明,两菌株之间存在较大的差异。采用Biolog微生物自动鉴定仪鉴定和对两菌株的16S rDNA基因序列分析表明,菌株BRF-1和BRF-2分别与多粘类芽孢杆菌和枯草芽孢杆菌亲缘关系最近,故把菌株BRF-1和BRF-2分别定为多粘类芽孢杆菌和枯草芽孢杆菌。     

具分泌几丁质酶活性的生防细菌的筛选鉴定及其几丁质酶基因的克隆和表达

 本研究通过平板透明圈法筛选获得一株具有几丁质酶活性的生防细菌CAB-1,该菌株对番茄灰霉病菌等多种病原真菌表现较强的拮抗活性。通过生理生化、16S rDNA和gyrB基因序列测定,将菌株CAB-1鉴定为萎缩芽胞杆菌（Bacillus atrophaeus）。对菌株CAB-1全基因组序列进行分析和功能预测,发现该菌株存在2个几丁质酶编码基因chit1和chit2。通过PCR技术从菌株CAB-1中克隆出这两个几丁质酶的编码基因并在大肠杆菌中表达,其原核表达产物均表现几丁质酶活性,其中chit1的原核表达产物能够显著抑制灰霉菌分生孢子的萌发。对其原核表达条件进行优化,发现在30℃下振荡培养24 h,IPTG浓度为0.2~1.0 mmol/L时,其蛋白表达量最高。     

油菜菌核病生防芽孢杆菌的分离鉴定及其脂肽化合物分析

采用平板拮抗筛选,分别从西藏日喀则地区和拉萨地区杂草根围土壤中筛选到2个对油菜菌核病菌有显著拮抗活性的芽孢杆菌菌株RJGP16和YBWC43。通过生理生化鉴定、16S rDNA序列分析和BOX-PCR指纹图谱分析,鉴定菌株RJGP16为萎缩芽孢杆菌Bacillus atrophaeus, 菌株YBWC43为解淀粉芽孢杆菌Bacillus amyloliquefaciens。离体叶片试验结果显示,菌株RJGP16和YBWC43对油菜菌核病菌防治效果分别为50.24%和100.00%。脂肽化合物种类分析显示,菌株RJGP16产生脂肽化合物表面活性素和芬枯草菌素,菌株YBWC43产生杆菌霉素D和芬枯草菌素。表明菌株RJGP16和YBWC43对油菜菌核病的防治效果与其产生的脂肽化合物有关。     

利用芽孢杆菌在温室环境中控制番茄青枯病

 在离体条件下测试了81株芽孢杆菌分离物抑制番茄青枯病菌的能力,有4个菌株(B2、B5、B7和B8)显示了较好的抑菌效果,经细菌生物学性状、Biolog和16S rDNA序列分析,B2菌株鉴定为短短小芽孢杆菌(Brevibacillus brevis),B5、B7和B8鉴定为枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)。在温室环境中,4个菌株都能不同程度的促进灭菌土和自然土的番茄生长,并能减轻番茄青枯病的发生。B2菌株显示了显著的抑菌作用,在灭菌土和自然土中分别降低了80.0%和87.4%的番茄青枯病发生率。     

棉花黄、枯萎病拮抗菌株B110的鉴定及其抑菌作用方式

分离得到的芽孢杆菌菌株B110对棉花黄、枯萎病原真菌具有强烈抑制作用,根据其形态特征、生理生化特征、16S rDNA基因序列测定和聚类分析鉴定菌株B110为枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)。用经过硫酸铵沉淀、Sephadex G-75分离得到的粗提蛋白,通过对分生孢子萌发的抑制试验和对菌丝生长的抑制试验对其抑菌方式进行了研究,抗菌蛋白能够使棉花黄萎病菌的孢子萌发受到抑制,菌丝扭曲畸变,进而原生质凝聚,最后导致菌丝断裂。     

烟草叶围细菌Tpb55菌株的鉴定及其抑菌活性

Tpb55是从烟草叶面生境中分离获得的一株拮抗细菌,本研究从形态、生理生化、16S-23S rDNA转录间隔区PCR（ITS-PCR）分析,初步明确了该菌株的分类地位。光学显微镜下观察到Tpb55菌体为杆状,革兰氏染色均匀,鞭毛周生,产芽孢,各项生理生化测试指标与枯草芽孢杆菌菌株表现一致;16S-23S rDNA ITS-PCR分析结果表明,Tpb55与枯草芽孢杆菌同源性达到99.75%。Tpb55代谢产物对7种病原真菌和3种病原细菌均有不同程度的抑菌作用,表明该菌株代谢产物具有较高的抑菌活性和较广的抑菌谱。进一步研究发现,该菌株代谢产物对有机溶剂、蛋白酶、热和pH值都有很高的稳定性,是具较好开发潜能的生防菌株。     

西藏低温适生芽孢杆菌的分离鉴定及其抗菌和促生作用

从西藏拉萨色拉寺杂草根围土壤中分离到1株低温适生芽孢杆菌LSSC3,对该菌株进行了形态学、生理生化和分子生物学鉴定及抗菌和促生作用研究。菌株LSSC3细胞短杆状,芽孢圆形,10℃条件下生长良好。生理生化特征显示,该菌株与巨大芽孢杆菌Bacillus megaterium特征一致,但ERIC-PCR指纹图谱分析表明其与B. megaterium模式菌株存在显著差异。16SrRNA基因序列分析结果显示,菌株LSSC3与B. subtilis和B. atrophaeus的系统发育相似性均很高。进一步通过gyrB基因测序和比对,其同源性与B. atrophaeus达到100%,没有找到与B. subtilis的同源性关系。据此,将其鉴定为B. atrophaeus。菌株LSSC3对植物病原真菌和细菌均具有很强的抑制作用,同时对拟南芥有良好的促生长作用。该菌具有耐低温和生防的双重特点,具有在农业生产上应用的潜力。     

马铃薯坏疽病Phoma foveata生防菌的筛选及鉴定

采用平板对峙法筛选到了马铃薯坏疽病的生防菌 ZA1,其对马铃薯坏疽病菌的抑制率为71.83%;通过形态特征和生理生化测定,结合16S rDNA和gyrB基因序列同源性分析,鉴定该菌为莫海威芽孢杆菌Bacillus mojavensis。抑菌谱测定表明,菌株ZA1对番茄早疫病菌Aalternaria solani、马铃薯褐腐病菌Stysanus stemonitis、马铃薯干腐病菌Fusarium oxysporum和马铃薯炭疽病菌Colletotrichum coccodes的抑制率分别达64.30%、41.05%、61.42%和74.92%。在贮藏库中进行10倍液喷雾,对马铃薯坏疽病的防效达64.31%。     

一种玉米新型细菌性褐腐病的病原鉴定

本研究从河北省武邑、献县、阜城和永年采集感病玉米植株。病株症状为叶梢枯死卷曲,叶脉产生黄色病斑,茎秆处黄褐色干腐。从发病植株中分离得到了10株疑似病原细菌菌株,经过回接验证和16SrDNA和gyrB基因的序列分析,结果表明,引起该病害的病原物为菠萝泛菌(Pantoea ananatis)和分散泛菌(Pantoea dispersa)。这是国内首次报道菠萝泛菌和分散泛菌引起玉米细菌性病害。     

拟康宁木霉T 51几丁质酶活性及内切几丁质酶基因克隆与分析

木霉是一类重要的生防真菌,木霉产生的几丁质酶在其生物防治的重寄生过程中起着重要作用。拟康宁木霉Trichoderma koningiopsis T-51是一株对番茄灰霉病有生防潜力的木霉菌株,本文测定了T-51菌株产生几丁质酶的活性,结果表明T-51在PDB中液体培养以及与灰霉病菌在PDA上对峙培养时产生的几丁质酶活性显著受到灰霉病菌的诱导。采用RACE技术首次克隆了拟康宁木霉T-51中一个几丁质酶基因Tkchit42,全长为1 817bp,包含4个外显子和3个内含子。预测该基因有一个1 275bp的开放阅读框,编码424个氨基酸,预测的蛋白总分子量为46.378kDa,预测的等电点(pI)为5.16,与T.koningii中42kDa内切几丁质酶的氨基酸序列相似性达到99%。     

植物内生细菌在辣椒体内的定殖动态及对辣椒疫病的防治效果

为了探讨具生防作用的植物内生细菌在辣椒体内的定殖动态与其防治辣椒疫病的关系,采用对峙培养法和盆栽苗防效法筛选生防菌株,依据菌体形态、生理生化性质和16SrDNA序列鉴定菌种,用抗利福平标记研究菌株在辣椒苗中的定殖动态,在同时接入植物内生细菌和灌根接种辣椒疫霉菌的条件下分析生防菌株的定殖数量与防效的关系。结果表明,菌株G9、R15和J13对辣椒疫病防效最好,经鉴定均为荧光假单胞菌Pseudomonasfluorescens。菌株G9和R15在辣椒根部定殖量高于菌株J13;定殖周期均在30-40d,呈“先增后减”的变化趋势;菌株G9和R15在接种第15d时定殖量最高,菌株J13在根、茎和叶中定殖量达到最高的天数分别为第9、15和15-20d,定殖数量的变化为根〉茎〉叶。菌株G9定殖量达到9．73×10^5cfu·g-1时辣椒疫病的防效达到100％,保持该数量的时间约6d;菌株R15定殖量达到6．30×10^5cfu·g-1以上时对辣椒疫病的防效达到100％,保持该数量的时间约14d。研究结果展现了植物内生细菌在辣椒疫病生物防治上的应用潜力,为制定植物内生细菌防治辣椒疫病的施用技术提供了科学依据。     

生防细菌FD6的鉴定及其对番茄灰霉病菌的作用机制

拮抗细菌FD6分离自福建闽侯青口青菜根围土壤,采用凹玻片法和离体叶片接种法测定菌株FD6的抑菌能力,经16S rDNA序列比对和相关生理生化性状分析,对生防细菌FD6进行了鉴定,并通过PCR扩增、薄层层析、薄层色谱生物自显影等探讨FD6产生抗生素的种类及其抑菌效果。结果表明,FD6的细菌悬浮液可显著抑制灰霉病菌分生孢子萌发,抑制率达99%,FD6培养滤液的抑制率仅为31%;细菌悬浮液对番茄灰霉病防效达59.7%。FD6的16S rDNA序列与假单胞菌属Pseudomonas的相似性达99%,系统进化树显示与荧光假单胞菌P.fluorescens遗传距离最近,结合生理生化表型特征将FD6菌株鉴定为荧光假单胞菌P.fluorescens。菌株FD6可产生硝吡咯菌素、2,4-二乙酰基间苯三酚、藤黄绿脓菌素、嗜铁素、氢氰酸和蛋白酶等抗菌物质,不产生吩嗪-1-羧酸,其中,硝吡咯菌素可直接抑制番茄灰霉病菌孢子萌发和菌丝的生长。     

油菜菌核病菌拮抗海洋细菌GM-1菌株的种类鉴定及抑菌作用研究

从连云港海域分离到1株对油菜菌核病菌有显著抑制作用的海洋细菌菌株GM-1,对其进行种类鉴定、抗菌作用测定及盆栽防病效果测定.通过形态特征观察、生理生化试验及16SrDNA序列、gyrB基因序列分析,将该菌株鉴定为芽胞杆菌属(Bacillus)的解淀粉芽胞杆菌(Bacillus amylolique faciens).抑菌作用测定结果表明:GMl菌株和无菌发酵液对油菜菌核病菌菌丝的生长具有明显的抑制作用,培养7d的抑菌带宽度分别达到30mm和16mm,GM-1菌株和无菌发酵液对菌丝细胞结构有明显的破坏作用,导致菌丝细胞壁变厚、膨大;同时对菌核的萌发有明显的抑制作用,菌液较无菌发酵液的抑制作用更显著.盆栽防病效果测定表明:该菌株菌液对油菜菌核病具有明显的防治作用,防治效果达68％,同时能够促进油菜种子萌发,显示出良好的开发应用前景.     

短小芽胞杆菌抑菌相关基因的高效克隆

为有效挖掘生防短小芽胞杆菌Bacillus pumilus的抑菌相关基因,对DX01菌株进行了Solexa基因组扫描,并选取其中2个代表性基因TasA和Surf2,以DX01基因组DNA为模板,采用PCR方法对其进行克隆、序列比对及系统进化分析。结果表明,DX01菌株共得到4 267个基因,有3 145个具有明确生物学功能的蛋白。其中,与短小芽胞杆菌抑菌活性相关的基因（簇）有84个,包括2个细菌防御酶基因、2个细菌生物膜形成相关基因、1个信号转导基因、27个细胞壁降解或水解酶基因、15个抗生素合成或转运基因、4个抑菌蛋白基因、1个次生代谢物合成基因簇及32个细菌鞭毛生物合成与调控相关基因。TasA基因在芽胞杆菌属细菌中具有高度的保守性,各同源基因的序列相似性在92%以上;而Surf2基因的同源基因在该属细菌中具有一定的变异性,有的序列相似性低至73%。