β-actin基因在荒漠昆虫光滑鳖甲和小胸鳖甲中表达的稳定性研究

为检测生活习性截然相反的两种荒漠昆虫光滑鳖甲和小胸鳖甲的β-actin基因在不同温度下的表达是否稳定,对不同温度处理和不同季节采集的昆虫提取总RNA反转录合成cDNA后,进行荧光实时定量PCR检测。以Ct值作为β-actin基因表达水平的测定值。通过方差分析显示:光滑鳖甲的β-actin基因在不同季节无显著差异,而小胸鳖甲则表现出β-actin基因表达的季节性差异;在不同温度处理条件下,光滑鳖甲β-actin基因表达比小胸鳖甲的要稳定。研究认为β-actin可作为研究光滑鳖甲不同温度下基因表达的内参基因,而β-actin则不适合用做研究小胸鳖甲在不同温度下基因表达的内参基因。     

光滑鳖甲Anatolica polita 抗冻蛋白基因的发育阶段性表达以及低温对其表达的影响

[目的]光滑鳖甲是广泛分布于新疆荒漠地区的一种拟步甲科(Tenebrionidae)昆虫,它能够通过抗冻蛋白的表达从而在长时间低温和剧烈的温度变化等环境条件下生存.研究光滑鳖甲抗冻蛋白基因(Apafp)在不同发育阶段表达差异和冷胁迫对其表达的影响.[方法]通过实时定量PCR方法对Apafp752和Apafp914两种抗冻蛋白基因的mRNA水平变化规律进行了研究.[结果]随着幼虫龄期的增大,Apafps mRNA水平逐渐增加,至8～9龄幼虫阶段达到最高约为小龄幼虫的7～8倍,蛹期时则显著降低.血淋巴液的渗透浓度值也呈现相同趋势.[结论]发育阶段的变化是对光滑鳖甲抗冻蛋白基因表达的重要调节因素.在低温胁迫下4～6龄幼虫afps的表达显著提高,说明冷胁迫能促进幼虫afps的累积.结合Apafps基因表达和低温存活率可以推测光滑鳖甲大龄幼虫可能是一种过冬虫态.     

米蛾β-actin基因cDNA片段的克隆及表达量检测

为克隆米蛾[Corcyra cephalonica(Stainton)]β-actin基因cDNA片段,建立米蛾β-actin基因实时荧光定量PCR(qRT-PCR)方法,并评估其在实时荧光定量研究中作为内参基因的可靠性,利用反转录PCR(RT-PCR)技术克隆获得米蛾β-actin基因cDNA片段,采用SYBR GreenⅠ染料法建立qRT-PCR方法,检测在米蛾卵、幼虫、蛹和成虫4个虫态中β-actin基因的表达量。获得了长为822bp的米蛾β-actin基因片段(Gen Bank accession:KJ599569),编码273个氨基酸残基;荧光定量标准曲线的Ct值检测范围为13~28,扩增效率为90.1%,相关系数R~2=0.992,溶解曲线分析结果显示产物为特异的单峰,其Tm值为(84±0.5)℃,符合定量要求;实时荧光定量结果表明,β-actin基因在米蛾不同发育历期中的表达水平无显著性差异(p0.05)。成功建立了米蛾β-actin基因qRT-PCR方法 ,β-actin基因可以作为米蛾基因表达定量研究中的可靠内参基因。研究结果为β-actin作内参基因进行米蛾功能基因表达差异研究奠定了分子基础。     

小胸鳖甲各龄期幼虫过冷却点的测定

[目的]了解新疆荒漠甲虫准噶尔小胸鳖甲幼虫耐寒性的发育阶段性变化.[方法]对新疆荒漠甲虫准噶尔小胸鳖甲各龄期幼虫的过冷却点进行测定.[结果]同一虫期个体间的过冷却点出现不同程度的变异,但均服从正态分布.不同虫期的过冷却点差异显著,其中1龄的过冷却点最低(-19.4～-24.1℃),且个体差异不大.老熟幼虫的过冷却点个体差异较大,其中7龄幼虫中过冷却点在个体间差异达到15.7℃(-5.6～-21.3℃).[结论]老龄幼虫最有可能是该虫在荒漠环境地区越冬的虫态.     

杏鲍菇采后木质化相关基因实时定量PCR中内参基因的选择

【目的】筛选出合适的内参基因,为分析不同贮藏时期杏鲍菇(Pleurotus eryngii)子实体中木质化相关基因的表达提供支持。【方法】以4℃低温贮藏0,3,6,9,12,15和18d的杏鲍菇子实体为材料,采用实时荧光定量PCR(Quantitative real-time PCR,RT-qPCR)技术,分析了β-actin、18SrRNA、β-tubulin、ELF和GAPDH 5个候选内参基因在不同贮藏时期杏鲍菇的表达情况;通过GeNorm和NormFinder 2种软件筛选出最稳定的内参基因;选取最佳内参基因,采用相对表达定量法对木质素合成途径中的关键酶,即苯丙氨酸转氨酶(Phenylalanina ammonia-lyse,PAL)基因的表达进行定量分析。【结果】5个内参基因均能特异扩增,其中GAPDH基因表达丰度较低,不适合用作内参基因;经GeNorm软件分析计算,β-actin、β-tubulin、ELF、18SrRNA表达稳定度平均值M分别为0.527,0.527,0.584,0.875,最适内参基因组合为β-actin、β-tubulin和ELF;由NormFinder软件分析计算,β-actin、β-tubulin、ELF、18SrRNA稳定值S分别为0.221,0.356,0.583,1.092,β-actin稳定性最高;综合分析认为β-actin的表达稳定性最高,为最佳内参基因;以β-actin为内参基因,发现4℃低温贮藏3,6,9,12,15和18d的杏鲍菇子实体中PAL基因表达量分别比新鲜样品(0d)增加了11.3%,10.8%,11.3%,11.5%,11.4%,10.7%。【结论】β-actin可作为杏鲍菇子实体采后贮藏条件下品质变化相关基因表达研究的内参基因。     

莲草直胸跳甲不同发育阶段内参基因的筛选与验证

[目的]实时定量PCR(qPCR)是基因表达研究的重要技术手段,但其结果的准确性取决于内参基因,本研究筛选莲草直胸跳甲不同发育阶段稳定表达的内参基因,为后续基因表达研究奠定基础。[方法]使用qPCR测定了9个昆虫常见的候选内参基因(β-actin、RPL13a、RPS18、UBC、EF-1α、RPS6、GAPDH、α-Tubulin和β-Tubulin)在莲草直胸跳甲不同发育阶段的表达,利用ΔCt、geNorm、NormFinder和BestKeeper 4种程序综合评估了9个内参基因的表达稳定性,并用小分子热激蛋白基因(shsp20. 8)对内参基因的稳定性进行了验证。[结果]莲草直胸跳甲不同发育阶段的最适内参基因为RPS18和RPL13a,shsp20. 8在使用最稳定和最不稳定的内参基因用于数据标准化时,结果差异显著,表达量最高的虫态分别为卵和蛹期。[结论]本文证实了稳定的内参基因对qPCR试验结果准确性至关重要。     

赤霞珠葡萄发育后期RT-PCR内参基因的筛选和验证

葡萄果实发育后期基因表达水平的变化对果实品质的形成具有重要影响,选择合适的内参基因是提高实时荧光定量PCR分析准确性的首要条件。本试验以赤霞珠葡萄发育后期不同取样时间的果皮为材料,通过qRT-PCR分析了常用候选内参基因β-actin、EF-1α、GAPDH和SAND的表达变化,借助ge Norm、Norm Finder和BestKeeper程序筛选出在葡萄发育后期qRT-PCR分析的理想内参基因。结果表明,β-actin的稳定性最好,其次是SAND,而GAPDH和EF-1α的稳定性相对较低;同时,用筛选的内参基因β-actin和SAND分析葡萄白藜芦醇合成途径中二苯乙烯合酶基因的表达水平,其表达规律一致。说明,β-actin和SAND是研究赤霞珠葡萄发育后期基因表达的理想内参基因。     

竹林金针虫实时荧光定量PCR内参基因的筛选与应用

  目的   筛选平沙绿僵菌Metarhizium pingshaense侵染条件下筛胸梳爪叩甲Melanotus cribricollis幼虫稳定表达的内参基因,为该竹林金针虫相关基因的表达研究奠定基础。   方法   基于筛胸梳爪叩甲幼虫的转录组数据,利用实时荧光定量PCR扩增特异性引物,分析相关性和扩增效率;利用GeNorm、NormFinder和BestKeeper软件评估筛选出6个候选内参基因(β-actin、GAPDH、α-tubulin、RPL13α、RPS3、RPS27a),并验证其表达稳定性。   结果   GeNorm分析结果显示:PRS27a和RPS3的表达最稳定,随后依次是α-tubulin、RPL13α、β-actin和GAPDH;最适合的内参基因数目为2。NormFinder分析结果显示:RPL13α的表达最稳定,随后依次是α-tubulin、RPS3、RPS27a、β-actin和GAPDH。BestKeeper分析结果显示:β-actin和GAPDH的P＞0.5,不适合作为本试验条件下的内参基因。不同软件分析得出的候选内参排序存在一定差异。综合分析和表达稳定性验证表明PRS27a或RPS3是最佳内参基因,6个目的基因的表达水平变化趋势均基本一致。   结论   PRS27a和RPS3是研究平沙绿僵菌侵染的竹林金针虫相关基因表达的最佳内参基因。图3表3参27     

不同引物对和退火温度对盐生植物盐穗木内参基因β-actin扩增效率的影响

【目的】以盐生植物盐穗木为材料,研究不同引物对和不同退火温度对盐穗木内参基因β-actin扩增效率的影响。【方法】设计扩增β-actin基因的两对引物,标记为β-actin1和β-actin2,分别建立这两对引物扩增盐穗木β-actin基因和特异性引物扩增该物种的过氧化物酶基因POD(盐响应的代表性基因),在不同退火温度下的标准曲线和扩增曲线。【结果】不论55还是58℃退火温度,引物对β-actin1比引物对β-actin2有更好的扩增效率;在55℃退火温度下,引物对β-actin1有更高的扩增效率。在这两个退火温度下,分别以β-actin1和β-actin2引物对扩增β-actin基因作为内参,盐穗木POD基因的相对表达水平具有一定的差异性。【结论】引物和退火温度会影响荧光定量PCR的扩增效率,进而会影响靶基因的相对表达水平。     

斜纹夜蛾普通气味结合蛋白基因SlitGOBP2的时空表达分析

[目的]分析斜纹夜蛾普通气味结合蛋白(GOBP)基因(SlitGOBP2)的时空表达模式,为深入研究Slit-GOBP2蛋白在斜纹夜蛾生长发育过程中的生理功能提供参考.[方法]以斜纹夜蛾为试验材料,分别收集并提取斜纹夜蛾卵、1~6龄幼虫、蛹共8个不同发育时期和雌、雄成虫触角、喙、胸、前足、中足、后足、腹部、翅膀共16个不同组织的RNA;以斜纹夜蛾Actin为内参基因,采用半定量RT-PCR分别对SlitGOBP2基因在雌、雄虫不同组织及不同发育阶段的基因表达模式进行比较分析.[结果]SlitGOBP2基因在斜纹夜蛾雌、雄虫的触角、喙、胸、前足、中足、后足、腹部和翅膀各组织中均有表达,其中在雌、雄虫触角中的表达水平均最高,在雌虫的喙、前足、后足和翅膀次之且明显高于雄虫的相应部位;雌、雄虫胸部和腹部的表达水平基本相同;而雌虫在中足的表达水平略低于雄虫.SlitGOBP2基因在斜纹夜蛾1~4龄幼虫和蛹后期均有表达,且在1龄幼虫和蛹后期中表达量相对较高,而在卵期、5和6龄幼虫中不表达.[结论]SlitGOBP2蛋白除具有取食、寻找寄主和产卵场所等基本功能外,雌虫可能还具有感受其他特殊信息素的功能.     

翡翠贻贝肾CYP4基因表达受多氯联苯影响的研究

[目的]了解多氯联苯(PCB)对翡翠贻贝肾中细胞色素P450第4亚族(CYP4)基因表达的影响。[方法]从野生翡翠贻贝cDNA中扩增得到了翡翠贻贝CYP4基因和β-actin基因的部分cDNA序列,并根据所得序列设计定量PCR引物,以β-actin为内参基因,以SYBRGreenI为荧光染料,利用荧光定量PCR对经PCB暴露处理后的翡翠贻贝肾中CYP4基因表达水平进行定量测定。[结果]PCB暴露处理对翡翠贻贝肾中CYP4基因的表达有明显的诱导作用,并且这种诱导作用对CYP4表达水平的影响与PCB暴露处理的时间以及浓度有相关性。[结论]该研究为CYP4基因作为生物大分子标记物在环境监测领域的应用提供了分子生物学水平的支持,同时为海水双壳类动物体内CYP4基因功能的研究提供了有益线索。     

大鲵不同发育阶段及组织中内参基因稳定性评价

【目的】研究18S核糖体RNA(18SrRNA)、延伸因子1-α(EF1-α)、甘油醛-3-磷酸脱氢酶(GAPDH)、β-肌动蛋白(β-actin)和琥珀酸脱氢酶A亚基(SDHA)等5种常见内参基因在大鲵不同组织、不同发育阶段及嗜水气单胞菌感染下的稳定性,为大鲵后基因组学研究提供指导。【方法】采集3龄健康大鲵的肝脏、肠、胃、胰腺、肾脏、肌肉、皮肤、脾脏等组织,3龄、2龄、1龄、9月龄、1周龄健康大鲵的皮肤组织及嗜水气单胞菌感染大鲵后第3,5,7天的皮肤组织,提取其RNA,进行实时荧光定量PCR检测,应用3种内参基因稳定性评价分析工具(geNorm,NormFinder,BestKeeper)分析5种内参基因在大鲵不同组织、不同发育阶段以及不同病理状态下的稳定性。【结果】5种内参基因在大鲵不同组织中表达稳定性较好的是EF1-α和SDHA,而在不同发育阶段及嗜水气单胞菌感染大鲵的皮肤组织中,5种内参基因的表达稳定性不同于在不同组织中的表达,稳定性较好的是EF1-α和GAPDH。【结论】EF1-α表达最为稳定,是大鲵定量PCR首选内参基因,而SDHA、GAPDH以及β-actin表达稳定性受生理状态的影响较大,作为第二内参基因时应视试验目的而定,在不同组织中进行定量PCR比较时应选用SDHA,而在不同生理状态下则应选用GAPDH为第二或备用内参基因。     

苹果蠹蛾β-actin基因cDNA的克隆、序列分析及mRNA表达稳定性检测

【目的】克隆苹果蠹蛾(Cydia pomonella(L.))的β-actin基因cDNA全长,确定其作为内参基因的可能性。【方法】运用RT-PCR和RACE技术分段扩增苹果蠹蛾β-actin基因5′和3′非编码区及保守区,拼接后根据所获序列设计引物,完整克隆苹果蠹蛾β-actin基因。利用生物信息学软件对苹果蠹蛾β-actin基因编码的蛋白质进行分析预测;通过实时定量PCR和半定量PCR方法,检测不同发育阶段以及杀虫剂处理后苹果蠹蛾β-actin mRNA的表达情况。【结果】苹果蠹蛾β-actin基因cDNA全长1 466bp(GenBank登录号为KC832921),包括5′非编码区67bp、3′非编码区268bp和开放阅读框1 131bp,编码一个由376个氨基酸残基组成的蛋白质。推导的蛋白质相对分子质量为41.793 7ku,等电点为5.29,含有3个actin蛋白家族的典型识别特征以及6种类型的特定功能位点,氨基酸序列与其他昆虫β-actin一致性高达99%。实时定量PCR和半定量PCR结果表明,β-actin基因在苹果蠹蛾发育不同时期以及杀虫剂处理后表达量无显著差异(P0.05)。【结论】苹果蠹蛾β-actin基因可作为可靠的内参基因应用于基因mRNA的表达定量研究。     

东方泽泻实时荧光定量PCR内参基因的筛选及AoSS基因的组织表达特性分析

[目的]筛选适用于东方泽泻实时荧光定量PCR(qRT-PCR)的内参基因,并分析其鲨烯合酶基因(AoSS)的表达特性,为后续研究东方泽泻原萜烷型三萜生物合成调控及诱导机制打下基础.[方法]从东方泽泻转录组中选取内参基因18S rRNA、EF1α、GAPDH、ACT、UBQ和UBC,应用qRT-PCR检测其在不同组织和激素处理下的表达情况,并借助Delta CT、GeNorm、NormFinder、BestKeeper和RefFinder对其表达稳定性进行分析评价.以筛选到的内参基因分析AoSS基因在不同组织中的表达情况.[结果]18S rRNA、GAPDH和EF1α基因在东方泽泻不同组织的表达稳定性较高,但18S rRNA、UBC和EF1α基因在不同激素处理下的表达稳定性均较高.以18S rRNA、GAPDH和EF1α基因为内参分析AoSS基因在东方泽泻不同组织中的表达量情况,结果显示,AoSS基因在东方泽泻不同组织中均有表达,其表达情况基本一致,均在东方泽泻块茎中表达量最高,其次是叶柄和叶,而在根中表达量最低.[结论]18S rRNA、GAPDH和EF1α基因是研究东方泽泻不同组织中基因表达分析的首选内参基因;18S rRNA、EF1α和UBC基因是研究激素处理下基因表达的首选内参基因.AoSS基因的表达具有组织特异性,其可能在东方泽泻的生长发育中发挥重要的调控功能.     

Polycomb家族基因BmSu（z）12在家蚕幼虫中的表达研究

[目的]研究家蚕Polycomb蛋白家族基因BmSu（z）12在家蚕幼虫中的表达情况.[方法]根据家蚕基因组预测的BmSu（z）12基因序列,设计特异引物,利用qRT-PCR对该基因在家蚕不同龄期幼虫中的表达进行研究.[结果]BmSu（z）12基因在5龄幼虫蜕皮后2d和变态前2d有较高表达,而在1～5龄取食中期表达量较低,表达特征具有一定的规律性.[结论]BmSu（z）12基因在家蚕幼虫生长发育中具有重要作用,该研究为进一步研究家蚕SU（Z）12蛋白的功能奠定基础.     

奶牛GPR109A基因SYBR GreenⅠ实时荧光定量PCR检测方法的建立

[目的]建立奶牛G蛋白偶联受体109A基因(GPR 109A)的实时荧光定量PCR检测方法,为开展奶牛产后脂类代谢紊乱及酮病发生机理研究奠定基础.[方法]根据GenBank中奶牛GPR 109A基因和卢-actin基因(内参基因)的mRNA保守序列设计合成两对引物,以奶牛肝脏组织cDNA为模板,PCR扩增目的基因后与载体连接构建重组质粒,以SYBR Green Ⅰ实时荧光定量PCR进行扩增,绘制标准曲线,并对其特异性、敏感性、重复性等进行检验.[结果]GPR109A基因和β-actin基因的实时荧光定量PCR标准曲线方程分别为y=-3.309x+10.92(R2=0.9985)和y=-3.289x+9.794(R2 2=0.9997),扩增效率分别为101.0％和100.0％.特异性试验结果显示,GPR 109A基因和β-actin基因的溶解曲线峰单一,无引物二聚体和非特异性扩增产物生成;敏感性试验结果显示,线性扩增范围广,可检测到1.8×102个拷贝的GPR109A基因;重复性试验结果显示,各扩增反应的变异系数(CV)小于或等于1.7％.[结论]基于GPR109A基因建立的SYBR Green Ⅰ实时荧光定量PCR具有操作简便、敏感性高、特异性强和重复性好等特点,可用于牛源性GPR109A基因表达量的快速检测和定量分析.     

荧光定量PCR技术优化及在草莓上的应用

[目的]为优化荧光定量PCR技术体系并在草莓研究中应用.[方法]以二倍体草莓(Fragaria vesca‘Ruegen’)为试材,草莓当中两个β-肌动蛋白基因家族成员Actin1和Actin2为内参基因,对比分析10 μL和20 μL反应体系条件下荧光定量PCR扩增反应.[结果]内参基因引物组合Actin1的扩增效率等指标优于Actin2;10μL反应体系中的扩增效率等指标优于20 μL反应体系;内参基因Actin1在10 μL反应体系下是草莓最优的荧光定量PCR技术体系.[结论]优化了草莓荧光定量PCR体系并应用该技术体系检测了草莓CrRLK1Ls家族成员的时空表达情况.     

细胞周期蛋白家族基因在家蚕幼虫蜕皮过程中的表达

细胞周期蛋白(cyclin)是调控真核生物细胞有丝分裂的重要蛋白。以家蚕1~5龄幼虫的眠蚕和起蚕为材料,采用实时荧光定量PCR方法对家蚕cyclin家族基因(CyclinA、CyclinB、CyclinB3、CyclinE)在不同龄期幼虫蜕皮过程中的表达进行研究。结果显示,1龄幼虫在眠期、起蚕期几乎均检测不到CyclinA、CyclinB、CyclinB3、CyclinE基因的表达,表明此时幼虫器官发育基本完成,细胞分裂迟缓。在起蚕期,CyclinA、CyclinB、CyclinE基因表达量均随着幼虫的发育进程逐渐增加,表明细胞分裂过程加剧,促进家蚕个体的不断生长;眠期则没有规律性变化。在2~5龄幼虫中,CyclinA、CyclinB、CyclinE基因表达量均为起蚕期高于眠期,眠期最重要的生理过程是细胞凋亡,因此眠期细胞周期蛋白家族基因表达水平较低,而CyclinB3基因在整个幼虫时期几乎不表达。本试验结果为细胞周期蛋白在家蚕蜕皮变态发育过程中的调控机制研究提供了参考。     

金纹细蛾β-actin基因克隆及表达分析

为了明确β-actin基因在金纹细蛾定量实验中作为内参基因的可靠性。根据近缘物种同源基因设计简并引物,通过RT-PCR技术克隆得到金纹细蛾β-actin基因片段,并进行序列分析;利用QRT-PCR方法检测该基因在金纹细蛾不同发育时期及成虫5种组织间的表达情况。结果表明:金纹细蛾β-actin基因片段为594bp(GenBank登录号:KF880733),编码174个氨基酸残基,具有actin蛋白家族典型特征,富含4种类型特定功能位点,其氨基酸序列与其他鳞翅目昆虫的相似性均大于96%。金纹细蛾β-actin基因在其生长发育阶段稳定表达,无显著差异,可以作为研究金纹细蛾不同发育时期的内参;在成虫头、胸、足和翅4种组织间表达量无显著差异。     

大豆不同发育时期及非生物胁迫下实时荧光定量PCR内参基因筛选

为研究大豆在不同发育时期的不同组织、不同非生物胁迫下稳定表达的最适内参基因,以大豆“JN28”V1时期的根、茎、叶,R3、R4时期的豆荚,R5、R8时期的子粒,干旱、低温、盐、脱落酸（ABA）胁迫下的根和叶共15个样本为试验材料。选择8个候选内参基因（Actin,β-actin,CYP2,EF1-α,Fbox,GAPDH,TUB4,18SrRNA）进行实时荧光定量PCR检测,并分析8个候选内参基因表达的稳定性。利用geNorm、NormFinder、BestKeeper软件分析后,再经过RefFinder计算筛选出合适的内参基因。结果表明：4个软件的分析结果不同,以RefFinder综合分析结果显示,V1期的根和叶、R3期的豆荚、ABA胁迫下的根,最适的内参基因为Actin;V1期的茎、R4期的豆荚、R8期的子粒,最适内参基因为EF1-α;R5期的子粒、干旱胁迫下的叶,最适内参基因为Fbox;干旱胁迫下的根,最适的内参基因为CYP2;盐胁迫的根、ABA胁迫下的叶,最适内参基因为18SrRNA;低温胁迫下的叶,最适内参基因为β-actin;低温胁迫下的根,最适内参基因为EF1-α和18S...