莲草直胸跳甲不同发育阶段内参基因的筛选与验证

[目的]实时定量PCR(qPCR)是基因表达研究的重要技术手段,但其结果的准确性取决于内参基因,本研究筛选莲草直胸跳甲不同发育阶段稳定表达的内参基因,为后续基因表达研究奠定基础。[方法]使用qPCR测定了9个昆虫常见的候选内参基因(β-actin、RPL13a、RPS18、UBC、EF-1α、RPS6、GAPDH、α-Tubulin和β-Tubulin)在莲草直胸跳甲不同发育阶段的表达,利用ΔCt、geNorm、NormFinder和BestKeeper 4种程序综合评估了9个内参基因的表达稳定性,并用小分子热激蛋白基因(shsp20. 8)对内参基因的稳定性进行了验证。[结果]莲草直胸跳甲不同发育阶段的最适内参基因为RPS18和RPL13a,shsp20. 8在使用最稳定和最不稳定的内参基因用于数据标准化时,结果差异显著,表达量最高的虫态分别为卵和蛹期。[结论]本文证实了稳定的内参基因对qPCR试验结果准确性至关重要。     

杏鲍菇采后木质化相关基因实时定量PCR中内参基因的选择

【目的】筛选出合适的内参基因,为分析不同贮藏时期杏鲍菇(Pleurotus eryngii)子实体中木质化相关基因的表达提供支持。【方法】以4℃低温贮藏0,3,6,9,12,15和18d的杏鲍菇子实体为材料,采用实时荧光定量PCR(Quantitative real-time PCR,RT-qPCR)技术,分析了β-actin、18SrRNA、β-tubulin、ELF和GAPDH 5个候选内参基因在不同贮藏时期杏鲍菇的表达情况;通过GeNorm和NormFinder 2种软件筛选出最稳定的内参基因;选取最佳内参基因,采用相对表达定量法对木质素合成途径中的关键酶,即苯丙氨酸转氨酶(Phenylalanina ammonia-lyse,PAL)基因的表达进行定量分析。【结果】5个内参基因均能特异扩增,其中GAPDH基因表达丰度较低,不适合用作内参基因;经GeNorm软件分析计算,β-actin、β-tubulin、ELF、18SrRNA表达稳定度平均值M分别为0.527,0.527,0.584,0.875,最适内参基因组合为β-actin、β-tubulin和ELF;由NormFinder软件分析计算,β-actin、β-tubulin、ELF、18SrRNA稳定值S分别为0.221,0.356,0.583,1.092,β-actin稳定性最高;综合分析认为β-actin的表达稳定性最高,为最佳内参基因;以β-actin为内参基因,发现4℃低温贮藏3,6,9,12,15和18d的杏鲍菇子实体中PAL基因表达量分别比新鲜样品(0d)增加了11.3%,10.8%,11.3%,11.5%,11.4%,10.7%。【结论】β-actin可作为杏鲍菇子实体采后贮藏条件下品质变化相关基因表达研究的内参基因。     

尖裸鲤实时荧光定量PCR内参基因的筛选

为筛选能够稳定表达的内参基因用于尖裸鲤Oxygymnocypris stewarti实时荧光定量PCR分析,以尖裸鲤血液、心脏、肝、脾、鳃、头肾、中肾、后肾、前肠、中肠、后肠、性腺、眼、垂体、脑、红肌、白肌和皮肤18个组织为材料,应用实时荧光定量PCR技术比较了GAPDH(3-磷酸甘油醛脱氢酶)、HPRT1(次黄嘌呤鸟嘌呤磷酸核糖转移酶1)、RPL13(核糖体蛋白L13)、RPL19(核糖体蛋白L19)、RPL13a(核糖体蛋白L13a)、SDHA(琥珀酸脱氢酶亚基A)和ACTB(β-肌动蛋白)7个候选内参基因的表达情况,并采用GeNorm、NormFinder和BestKeeper软件对7个候选内参基因的稳定性进行分析。结果表明:GeNorm分析显示,7个候选内参基因的平均表达稳定值(M)依次为RPL13=RPL13aRPL19GAPDHACTBSDHAHPRT1,其中RPL13和RPL13a的M值均最小(0.62);NormFinder分析显示,7个候选内参基因的M值依次为RPL13RPL13aRPL19GAPDHACTBSDHAHPRT1,其中RPL13的M值最小(0.30);BestKeeper分析显示,7个候选内参基因的标准差(S.D.)依次为RPL13RPL19GAPDHHPRT1RPL13aSDHAACTB,变异系数(CV)值依次为RPL13RPL19HPRT1GAPDHSDHARPL13aACTB,其中RPL13的标准差(0.84)和变异系数(4.54%)均最小;7个候选内参基因在尖裸鲤不同组织中的表达量存在差异。研究表明,7个内参基因中RPL13的表达较为稳定,可作为尖裸鲤实时荧光定量PCR分析的适宜内参基因,本研究结果可为尖裸鲤遗传学及分子生物学等研究提供基础数据。     

花绒寄甲荧光定量PCR分析中内参基因的选择

合适的内参基因是利用实时荧光定量PCR准确分析基因相对表达量的先决条件。以存活时间为6个月、12个月、18个月、24个月、30个月和36个月的花绒寄甲成虫为研究对象,应用实时荧光定量PCR技术,检测了核糖体蛋白11(RPS),丁二酸脱氢酶复合物(SDHA)、组蛋白(Histone)、泛素结合蛋白(UBC)、cGMP依赖性蛋白激酶Ⅰ(PGK)、延伸因子(EF-1α)、β-肌动蛋白(β-Actin)、3-磷酸甘油醛脱氢酶(GAPDH)、核糖体蛋白RPL13(L13)、α-微管蛋白(α-Tubulin)共10个看家基因mRNA的表达情况。经过geNorm、NormFinder和BestKeeper 3个统计学程序,综合分析确定RPS基因或α-Tubulin基因在不同存活时间的花绒寄甲中为较佳用于校正目标基因的内参选择,而RPS、GAPDH和α-Tubulin的组合为最佳校正目标基因内参基因组合。     

白茶实时荧光定量PCR分析中内参基因的筛选与验证

利用GeNorm,NormFinder,BestKeeper软件对茶树不同叶位及白茶萎凋过程中7个候选内参基因的表达稳定性进行分析。获得3个稳定性较好的内参基因β-Actin、GAPDH和RUBP,RUBP适合作为白茶萎凋过程叶片荧光定量PCR的内参基因,β-Actin适合作为白茶不同叶位叶片荧光定量PCR的最佳内参基因。因此,在白茶萎凋过程中,使用GAPDH+RUBP组合作为内参基因进行荧光定量PCR检测。     

杜鹃红山茶实时定量PCR 内参基因筛选及验证

【目的】实时荧光定量PCR（quantitative real-time PCR，qRT-PCR）以高灵敏度和特异性等优点，成为基因表达分析的主要工具，而选择适合不同条件下工作的内参是qRT-PCR分析的前提。筛选得到适用于杜鹃红山茶不同器官、不同时期花瓣的qRT-PCR分析的内参基因，为后续相关基因功能研究提供可用的内参基因。【方法】选择转录延伸因子编码基因（EF1α）、α-tubulin（TUA）、β-tubulin（TUB）、Ubiquitin（UBQ）、肌动蛋白（Actin）和甘油醛-3-磷酸脱氢酶（Glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH）6个看家基因，使用2种不同的计算程序GeNorm和NormFinder评估了6个基因表达的稳定性。进一步通过CaGASA3基因的表达模式验证了所选内参基因的适用性。【结果】在不同器官中通过GeNorm和NormFinder筛选出稳定性最好的基因，排名前2位的均为TUA和GAPDH，GAPDH基因在两种计算程序评估中稳定性均最佳。而在不同时期花瓣中，通过2种程序得出排名前2位的内参基因均为TUB和UBQ；UBQ基因在GeNorm程序评估中稳定性最好，TUB基因在NormFinder程序的评估中稳定性最佳。【结论】杜鹃红山茶不同器官中最佳内参基因为TUA和GAPDH，不同时期花瓣中最适内参基因为TUB和UBQ。     

二斑叶螨内参基因的筛选及解毒酶基因的表达水平

【目的】筛选二斑叶螨（Tetranychus urticae）敏感（SS）和抗甲氰菊酯品系（Fe-R）中合适的内参基因,并通过基因相对表达定量PCR研究二斑叶螨抗性品系解毒酶基因表达水平的变化。【方法】采用实时荧光定量PCR（quantitative real time PCR,RT-qPCR）技术,分析二斑叶螨5.8S rRNA、α-tubulin、β-actin、ELF、GAPDH、RPL13a、SDHA和TBP共8个候选内参基因mRNA表达水平的稳定性,并分析二斑叶螨酯酶（Carboxyl/cholinesterases,CCEs）、谷胱甘肽转移酶（Glutathione s-transferase,GSTs）及细胞色素P450单加氧酶（Cytocheome P450 monooxygenases,P450s）等主要解毒酶基因相对表达量。用GeNorm和NormFinder软件进行内参基因稳定性评估,通过比较Ct值的方法进行基因相对表达量计算。【结果】8个内参基因中稳定性最高的为α-tubulin;以α-tubulin为内参基因,二斑叶螨Fe-R品系GSTs 基因TuGSTo1、TuGSTd1及P450s 基因CYP3D2相对表达量均显著高于SS品系,而CCEs 基因TuCCE1的表达量有所降低。【结论】在二斑叶螨SS和Fe-R品系中α-tubulin为理想的内参基因,RT-qPCR研究表明TuGSTo1、TuGSTd1和CYP3D2相对表达量的升高可能是二斑叶螨对甲氰菊酯产生高抗性的分子机理。     

赤霞珠葡萄发育后期RT-PCR内参基因的筛选和验证

葡萄果实发育后期基因表达水平的变化对果实品质的形成具有重要影响,选择合适的内参基因是提高实时荧光定量PCR分析准确性的首要条件。本试验以赤霞珠葡萄发育后期不同取样时间的果皮为材料,通过qRT-PCR分析了常用候选内参基因β-actin、EF-1α、GAPDH和SAND的表达变化,借助ge Norm、Norm Finder和BestKeeper程序筛选出在葡萄发育后期qRT-PCR分析的理想内参基因。结果表明,β-actin的稳定性最好,其次是SAND,而GAPDH和EF-1α的稳定性相对较低;同时,用筛选的内参基因β-actin和SAND分析葡萄白藜芦醇合成途径中二苯乙烯合酶基因的表达水平,其表达规律一致。说明,β-actin和SAND是研究赤霞珠葡萄发育后期基因表达的理想内参基因。     

大鲵不同发育阶段及组织中内参基因稳定性评价

【目的】研究18S核糖体RNA(18SrRNA)、延伸因子1-α(EF1-α)、甘油醛-3-磷酸脱氢酶(GAPDH)、β-肌动蛋白(β-actin)和琥珀酸脱氢酶A亚基(SDHA)等5种常见内参基因在大鲵不同组织、不同发育阶段及嗜水气单胞菌感染下的稳定性,为大鲵后基因组学研究提供指导。【方法】采集3龄健康大鲵的肝脏、肠、胃、胰腺、肾脏、肌肉、皮肤、脾脏等组织,3龄、2龄、1龄、9月龄、1周龄健康大鲵的皮肤组织及嗜水气单胞菌感染大鲵后第3,5,7天的皮肤组织,提取其RNA,进行实时荧光定量PCR检测,应用3种内参基因稳定性评价分析工具(geNorm,NormFinder,BestKeeper)分析5种内参基因在大鲵不同组织、不同发育阶段以及不同病理状态下的稳定性。【结果】5种内参基因在大鲵不同组织中表达稳定性较好的是EF1-α和SDHA,而在不同发育阶段及嗜水气单胞菌感染大鲵的皮肤组织中,5种内参基因的表达稳定性不同于在不同组织中的表达,稳定性较好的是EF1-α和GAPDH。【结论】EF1-α表达最为稳定,是大鲵定量PCR首选内参基因,而SDHA、GAPDH以及β-actin表达稳定性受生理状态的影响较大,作为第二内参基因时应视试验目的而定,在不同组织中进行定量PCR比较时应选用SDHA,而在不同生理状态下则应选用GAPDH为第二或备用内参基因。     

荷花淹水胁迫下实时定量PCR内参基因的验证

旨在筛选荷花淹水胁迫过程中表达稳定的内参基因,使不同胁迫处理下荷花目标基因的定量更为准确。以不同淹水胁迫时间的荷花叶片为材料,利用实时定量PCR技术验证5个植物常用内参基因,包括18S rRNA(18S)、actin(ACT)、elongation factor 1α(EF1α)、Histone H3(HIS)及β-tubulin(TUB)的表达水平,结合GeNorm、NormFinder和BestKeeper软件对结果进行分析,对其表达稳定性进行评价。将优选的2个内参基因(18S和ACT)应用于荷花转录因子基因ERFB2-1(ethylene responsive factor B2-1)和ERFB2-2的淹水胁迫表达,结果显示表达趋势一致,验证了可靠性。本研究对荷花淹水胁迫过程中关键基因表达的qRT-PCR分析有重要的应用价值。     

不同盐度下中华绒螯蟹胁迫相关基因的表达差异

通过对中华绒螯蟹在4个盐度梯度(0、10、20、30)下的胁迫试验,观察了4个类别的10个相关基因,即4个能量代谢相关基因、3个生长相关基因、2个应激性相关基因和1个渗透压调节相关基因的表达情况.结果表明:3个能量代谢相关基因(VATB、UBE、GAPDH)、1个应激性相关基因(GST)和渗透压调节相关基因(NAK)在不同盐度间的表达量存在显著差异(P0.05),而其他基因的表达量差异不显著(P0.05).应用Best Keeper、Norm Finder和Ge Norm 3个软件对各基因的稳定性进行分析发现:应激性相关基因(GST)和渗透压调节相关基因(NAK)对盐度变化的响应程度较高,表达不稳定;3个生长相关基因(S27、β-ACTIN、α-TUB)对盐度变化的响应程度低,表达稳定,可以作为不同盐度处理下基因差异表达的内参基因.     

大蒜内参基因筛选及AsACO基因对盐胁迫和促生菌的响应分析

【目的】筛选大蒜在盐胁迫下的稳定内参基因,并分析1-氨基环丙烷-1-羧酸氧化酶基因（AsACO）对盐胁迫和促生菌的响应表达特性,为深入探究促生菌的促生机制及大蒜对盐胁迫的响应机制研究提供理论参考。【方法】以乐都紫皮大蒜为试材,采用实时荧光定量PCR（qRT-PCR）检测5个内参基因ACT、UBC、HIS3、18S rRNA、TUB在盐胁迫下的表达稳定性,结合GeNorm、NormFinder和BestKeeper筛选出最稳定的内参基因,并分析恶臭假单胞菌UW4对盐胁迫下AsACO基因表达的影响。【结果】 5个候选内参基因引物的特异性强、无引物二聚体。GeNorm分析得出候选内参基因稳定性排名为18S rRNA=TUB>HIS3>UBC>ACT,NormFinder分析得出内参基因稳定性排名为18S rRNA>HIS3>TUB>UBC>ACT,BestKeeper分析得出内参基因稳定性排名为UBC>HIS3>18S rRNA>TUB>ACT,最终以几何平均数综合分析得出18S rRNA为最稳定的内参基因。以18S rRNA为内参基因,检测出AsACO基因表达具有明显的组织特异性,在叶片中的相对表达量明显高于根。整个处理过程中,盐胁迫明显诱导AsACO基因在不同处理时间及不同组织中表达上调,根和叶片中AsACO基因的相对表达量分别在2 d和12 h时达最高,较正常培养（CK）分别显著升高124.43%和238.34%（P<0.05,下同）,与盐胁迫处理相比,盐胁迫+浇施恶臭假单胞菌UW4处理显著降低AsACO基因在不同处理时间根和叶片中的相对表达量,其中在2 d和12 h时降幅较大,分别降低了112.08%和343.34%。【结论】18S rRNA是盐胁迫下大蒜中最稳定的内参基因。盐胁迫可诱导大蒜根和叶片中AsACO基因的上调表达,从而间接促进ACO和乙烯水平升高,加速由乙烯调控的细胞衰老,甚至死亡,但盐胁迫下恶臭假单胞UW4具有抑制AsACO基因表达的作用,以减少ACO和乙烯的合成,从而延缓大蒜细胞衰老,提高逆境耐受性。     

不同光周期和温度处理下桂花内参基因的筛选

光周期和温度处理能够影响桂花Osmanthus fragrans的基因表达水平和花芽分化过程,通过实时荧光定量聚合酶链式反应（qRT-PCR）分析基因表达已成为研究这些过程机制的重要手段,而筛选出适合光周期和温度处理的内参基因在研究桂花分子机制中尤为重要。为了得到不同光周期和温度处理下桂花中稳定的内参基因,以桂花品种‘佛顶珠’O.fragrans‘Foding Zhu’当年生枝条的第2或第3对幼叶为材料,以OfACT,OfEF1α,OfIDH,OfRAN1,OfTUB,OfUBC2和Of18S等7个基因作为候选内参基因,利用geNorm,NormFinder和BestKeeper 3个软件对候选内参基因的表达稳定性进行比较分析;以昼夜节律相关基因GIGANTEA（GI）对筛选出的最佳内参基因进行验证。结果表明:在不同处理条件下,桂花叶片中OfRAN1和OfIDH为最佳内参基因,Of18S的稳定性最差（geNorm分析结果显示OfRAN1和OfIDH的稳定值为0.347,而Of18S的稳定值为0.601;NormFinder显示OfRAN1和OfIDH的稳定值为0.135和0.206,而Of18S为0.474;BestKeeper显示OfRAN1的稳定值为0.80,OfIDH为0.133,而Of18S为0.474）;GI基因的相对表达水平分析表明（昼夜节律基因GI的表达模式为在白天累积并在夜间下降）,在7个内参基因及OfRAN1和OfIDH的基因组合中,使用OfRAN1和OfIDH的内参基因组合可获得GI基因更为精确的基因表达结果。综上所述,OfRAN1和OfIDH内参基因组合是桂花在不同光周期和温度处理下最佳内参基因组合。这为桂花分子机制研究奠定基础。     

Stability evaluation of reference genes for real-time quantitative PCR normalization in Spodoptera frugiperda(Lepidoptera: Noctuidae)

Real-time quantitative PCR(qPCR) is a reliable and widely used technique for analyzing the expression profiles of target genes in different species, and reference genes with stable expressions have been introduced for the normalization of the data. Therefore, stability evaluation should be considered as the initial step for qPCR experiments. The fall armyworm Spodoptera frugiperda(J. E. Smith)(Lepidoptera: Noctuidae) is a polyphagous pest that consumes many plant species and seriously threatens corn production around the world. However, no studies thus far have examined the stability of reference genes in this pest. In this study, the expression profiles of the eight candidate reference genes of Actin, elongation factor 1 alpha(EF1α), elongation factor 2(EF2), glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase(GAPDH), ribosomal protein L3(RPL3), ribosomal protein L13(RPL13), alpha-tubulin(α-TUB), and beta-1-tubulin(β-1-TUB) were obtained from S. frugiperda in different samples and the stability was evaluated by ΔCt, BestKeeper, geNorm, NormFinder, and RefFinder methods. The results of pairwise variation(V) calculated by GeNorm indicated two reference genes could be selected for normalization. Therefore, the combinations of the most stable reference genes for different experimental conditions of S. frugiperda were shown as follows: EF2 and RPL13 for developmental stages, RPL3 and β-1-TUB for larval tissue samples, EF2 and EF1α for the larval samples treated with different temperatures, RPL3 and EF1α for the larval samples under starvation stress, and RPL13 and EF1α for all the samples. Our results lay the foundation for the normalization of qPCR analyses in S. frugiperda and could help guarantee the accuracy of subsequent research.     

3种化学杀虫剂对筛胸梳爪叩甲幼虫的毒力测定

  目的  为明确3种化学杀虫剂对筛胸梳爪叩甲Melanotus ribricollis幼虫的防治效果,选择最适杀虫剂。  方法  采取拌土法对幼虫阶段筛胸梳爪叩甲进行室内毒力测定。选取了质量分数为5.0%的辛硫磷颗粒剂、0.5%的氟虫腈粉剂20.0%的氯虫苯甲酰胺悬浮剂3种药剂,分别以5个质量分数梯度均匀拌入按照1∶2的体积比混合的砂子和竹林土中,以喷洒清水作为空白对照,24 h后观察不同药剂处理后筛胸梳爪叩甲的死亡率。  结果  3种化学杀虫剂对筛胸梳爪叩甲均有一定的毒杀效果,毒力由高到低依次为5.0%辛硫磷、0.5%氟虫腈、20.0%氯虫苯甲酰胺,其中5.0%辛硫磷毒力最高,致死中质量分数（LC₅₀）为0.190 0 g·kg?1,其次为0.5%氟虫腈,LC₅₀为0.950 0 g·kg?1,而20.0%氯虫苯甲酰胺毒力最低,LC₅₀为1.820 0 g·kg?1。  结论  根据毒力、毒性和防治成本等综合因素考虑,5.0%辛硫磷颗粒剂和0.5%氟虫腈粉剂均适合防治竹林害虫筛胸梳爪叩甲。表2参27     

平欧杂种榛实时荧光定量PCR内参基因的筛选与体系建立

【目的】构建中国榛属植物主要栽培种平欧杂种榛实时荧光定量PCR内参基因的筛选体系,并筛选稳定的内参基因,为榛属植物的基因表达分析提供内参基因,进而为其植物资源利用和创新育种研究提供理论基础。【方法】利用课题组前期对平欧杂种榛不同亲和性授粉、授粉后不同时间的雌蕊转录组测序数据,结合相关文献搜索,共选取12个候选内参基因;以平欧杂种榛主栽品种‘达维’的盛花期雌蕊、未伸长期雄花序、幼嫩叶片、花粉、一年生枝形成层、嫩茎、根尖、根蘖等8个不同组织器官为研究材料;通过反转录PCR初筛,实时荧光定量PCR检测表达量,并利用ge Norm、Norm Finder、Best Keeper、Delta Ct程序和Ref Finder在线网站评价内参基因的稳定性。【结果】反转录PCR初筛表明,12个候选内参基因引物的特异性良好,Cha STP5和Cha TF在不同组织器官材料中表达存在明显差异,其余候选内参基因在8个组织中均有表达。实时荧光定量PCR的表达谱分析表明,Ch18S r RNA的表达量最高,Cha STP5表达量最低,其余10个候选内参基因均为中等表达量;Cha STP5和Cha TF的稳定性最差,其余10个候选内参基因的稳定性处于中等水平。ge Norm、Norm Finder、Best Keeper和Delta Ct的结果表明,Cha Actin均排名第一,为最稳定的内参基因,Ch18S r RNA的排名均在前五,而其他候选内参基因在不同程序分析结果中的排名存在差异。稳定性综合分析表明,Cha Actin和Ch18S r RNA的稳定性良好,即在8个不同组织器官中表达量均一且在4个稳定性分析程序中均排名靠前,适合作为内参基因;ge Norm程序的变异系数分析则表明,选取6个内参基因便可对RT-q PCR的数据进行精准的标准化处理;相关性分析表明,4个程序均在0.01水平上呈现显著的相关性,Norm Finder和Delta Ct程序的相关性最高,Delta Ct与Best Keeper的相关性最低。【结论】建立了平欧杂种榛实时荧光定量PCR内参基因的筛选体系:以反转录PCR初筛引物,荧光定量PCR分析引物特性及基因表达,4个程序单独评价引物稳定性,Ref Finder综合分析选出最适稳定内参基因,并选出榛属植物8个不同组织器官中最为稳定的2个内参基因Cha Actin和Ch18S r RNA。     

景宁木兰热胁迫下实时荧光定量PCR内参基因的筛选

高温对景宁木兰Magnolia sinostellata生长产生严重影响。通过筛选景宁木兰热胁迫下稳定表达的内参基因,可以为景宁木兰在高温条件下基因表达研究提供准确数据,达到对目的基因进行准确量化的目的。以热胁迫下景宁木兰1年生实生苗的根、茎、叶组织为材料,从转录组数据库中选取13个管家基因ACTIN-7（肌动蛋白基因-7）,CYP（亲环蛋白基因）,EF-1α（延伸因子-1α蛋白基因）,GAPDH（甘油醛-3-磷酸脱氢酶基因）,GTB（GTP结合蛋白基因）,NAC（NAC域蛋白基因）,NADP（异柠檬酸脱氢酶基因）,TEF（翻译延伸因子基因）,UBC（泛素化酶基因）,UBQ（多聚泛素蛋白基因）,α-TUB（α微管蛋白基因）,β-TUB（β微管蛋白基因）和18S（18S核糖体RNA）,通过Primer 5.0进行引物设计,琼脂糖电泳和溶解曲线分析验证引物特异性;利用实时荧光定量聚合酶链式反应（qRT-PCR）技术和geNorm,NormFinder和BestKeeper等3个内参分析软件研究候选内参基因在热胁迫下不同组织中的表达稳定性,并通过CSLD3和KOR 2个目的基因的表达分析验证其可靠性。13个内参基因的电泳结果均显示单一条带,溶解曲线也均显示单一峰,证明引物特异性良好;13对引物的扩增效率均在100%左右;内参软件综合分析得到,UBC,EF-1α和ACTIN-7是景宁木兰在热胁迫下较为稳定的内参基因,以3个单独的内参基因以及内参组合（EF-1α和ACTIN-7）为参照对CSLD3和KOR的表达模式进行校准,也显示了一致的表达水平。通过qRT-PCR技术和内参软件分析,UBC,EF-1α和ACTIN-7等3个内参基因在景宁木兰热胁迫下不同组织中稳定性较高,CSLD3和KOR等2个目的基因的表达也证实了其可靠性。因此,UBC,EF-1α和ACTIN-7可以作为景宁木兰热胁迫下稳定表达的内参基因。