开花期水稻颖花实时定量RT-PCR分析中内参基因的选择

实时定量RT-PCR (qRT-PCR)技术现已发展成为基因表达分析的首选方法,然而为了得到精确和可靠的qRT-PCR分析结果,需要应用稳定表达的内参基因对样品进行校正.以粳稻‘武运粳7号’和籼稻‘明恢63’的颖花为试验材料,应用geNorm算法对6个常用的内参基因(ACT1、eEF1-oα、β-TUB、UBQ5、GAPDH和UBC)在颖花开放过程中的表达稳定性进行分析.结果发现:eEF1-α和β-TUB在‘武运粳7号’颖花样品中的表达最为稳定,UBC和GAPDH在‘明恢63’颖花样品中的表达最为稳定,而ACT1在2个品种的颖花样品中表达均最不稳定.此外,同时选取2个最稳定表达的内参基因作内参照可获得更精确的校准.分析不同内参基因对JA生物合成关键基因OsAOC表达定量的影响.OsAOC表达的相对定量会随所选内参基因的不同而发生变异,进一步强调选择合适的内参基因进行校准是获得可靠qRT-PCR结果的重要前提.     

番茄qRT-PCR内参基因的筛选

以高温、低温、盐胁迫、TYLCV接种处理和对照的番茄幼苗为植物材料,通过实时荧光定量RT-PCR(Real-time fluorescence quantitative PCR,qRT-PCR)方法分析了常用的8个内参基因肌动蛋白基因(ACT)、甘油醛-3-磷酸脱氢酶基因(GAPDH)、泛素基因(UBI)、18S核糖体RNA基因(18S)、转录延伸因子基因(EF-1a)、β-微管蛋白基因(TUB)、表达蛋白基因(EXP)和接合素蛋白复合物基因(CAC)在不同样本中的表达情况。利用ge Norm和Norm Finder软件分析筛选表达稳定性较高的内参基因。结果表明,在不同胁迫处理条件下,UBI和ACT的稳定性较高;在同样的胁迫处理中,8个内参基因的表达稳定性不同。综合而言,虽然UBI和ACT的稳定性同样较高,但在TYLCV接种处理试验中ACT的稳定性相对较差,而TUB和GAPDH表达较稳定,故TUB和GAPDH可在TYLCV接种处理试验中作为番茄qRT-PCR的内参基因。     

菠菜非生物胁迫下实时荧光定量PCR分析中内参基因的选择

为筛选适宜菠菜不同胁迫下基因表达水平分析的内参基因,本研究选取ACT11、ACT2/7、G6PD、ELF1B、UBC2、TUB、TUA和CYP2共8个常用内参基因作为候选内参基因,利用实时荧光定量PCR技术,通过ge Norm、Norm Finder、Best Keeper软件分析和评价其在不同胁迫下菠菜幼苗中的表达稳定性。结果表明,8个候选内参基因在不同胁迫处理下菠菜幼苗中的表达丰度及稳定性存在差异,Na Cl和高温胁迫下G6PD表达稳定性最好,PEG胁迫下ELF1B表达稳定性最好。本研究结果可为菠菜非生物胁迫下相关基因的功能分析和基因差异表达研究提供有效的校正工具。     

花绒寄甲荧光定量PCR分析中内参基因的选择

合适的内参基因是利用实时荧光定量PCR准确分析基因相对表达量的先决条件。以存活时间为6个月、12个月、18个月、24个月、30个月和36个月的花绒寄甲成虫为研究对象,应用实时荧光定量PCR技术,检测了核糖体蛋白11(RPS),丁二酸脱氢酶复合物(SDHA)、组蛋白(Histone)、泛素结合蛋白(UBC)、cGMP依赖性蛋白激酶Ⅰ(PGK)、延伸因子(EF-1α)、β-肌动蛋白(β-Actin)、3-磷酸甘油醛脱氢酶(GAPDH)、核糖体蛋白RPL13(L13)、α-微管蛋白(α-Tubulin)共10个看家基因mRNA的表达情况。经过geNorm、NormFinder和BestKeeper 3个统计学程序,综合分析确定RPS基因或α-Tubulin基因在不同存活时间的花绒寄甲中为较佳用于校正目标基因的内参选择,而RPS、GAPDH和α-Tubulin的组合为最佳校正目标基因内参基因组合。     

大蒜内参基因筛选及AsACO基因对盐胁迫和促生菌的响应分析

【目的】筛选大蒜在盐胁迫下的稳定内参基因,并分析1-氨基环丙烷-1-羧酸氧化酶基因（AsACO）对盐胁迫和促生菌的响应表达特性,为深入探究促生菌的促生机制及大蒜对盐胁迫的响应机制研究提供理论参考。【方法】以乐都紫皮大蒜为试材,采用实时荧光定量PCR（qRT-PCR）检测5个内参基因ACT、UBC、HIS3、18S rRNA、TUB在盐胁迫下的表达稳定性,结合GeNorm、NormFinder和BestKeeper筛选出最稳定的内参基因,并分析恶臭假单胞菌UW4对盐胁迫下AsACO基因表达的影响。【结果】 5个候选内参基因引物的特异性强、无引物二聚体。GeNorm分析得出候选内参基因稳定性排名为18S rRNA=TUB>HIS3>UBC>ACT,NormFinder分析得出内参基因稳定性排名为18S rRNA>HIS3>TUB>UBC>ACT,BestKeeper分析得出内参基因稳定性排名为UBC>HIS3>18S rRNA>TUB>ACT,最终以几何平均数综合分析得出18S rRNA为最稳定的内参基因。以18S rRNA为内参基因,检测出AsACO基因表达具有明显的组织特异性,在叶片中的相对表达量明显高于根。整个处理过程中,盐胁迫明显诱导AsACO基因在不同处理时间及不同组织中表达上调,根和叶片中AsACO基因的相对表达量分别在2 d和12 h时达最高,较正常培养（CK）分别显著升高124.43%和238.34%（P<0.05,下同）,与盐胁迫处理相比,盐胁迫+浇施恶臭假单胞菌UW4处理显著降低AsACO基因在不同处理时间根和叶片中的相对表达量,其中在2 d和12 h时降幅较大,分别降低了112.08%和343.34%。【结论】18S rRNA是盐胁迫下大蒜中最稳定的内参基因。盐胁迫可诱导大蒜根和叶片中AsACO基因的上调表达,从而间接促进ACO和乙烯水平升高,加速由乙烯调控的细胞衰老,甚至死亡,但盐胁迫下恶臭假单胞UW4具有抑制AsACO基因表达的作用,以减少ACO和乙烯的合成,从而延缓大蒜细胞衰老,提高逆境耐受性。     

朱砂叶螨各发育阶段内参基因评估及筛选

在实时荧光定量PCR试验中需引入一个或几个表达稳定的内参基因作为参照物对表达结果进行校正和标准化处理,但并非所有内参基因都完美地适用于任何特定试验条件下的生物样本,要得到准确、真实的定量结果,就需要筛选与试验匹配的最佳内参基因。研究通过实时荧光定量技术,利用geNorm软件分析,对朱砂叶螨敏感品系及抗炔螨特品系各个发育阶段中6个常用内参基因的表达稳定性进行评估。结果表明,两个品系间RPS18与α-TUB内参基因组合表达稳定度较高;不同发育阶段α-TUB与GAPDH内参基因组合表达稳定度较高。     

桉树焦枯病菌内参基因的筛选

为筛选出桉树焦枯病菌在盐胁迫及侵染桉树叶片两种条件下表达稳定的内参基因,采用实时荧光定量聚合酶链式扩增反应(RT-q PCR)技术分析了桉树焦枯病菌中7个常用内参基因(GAPDH、α-tubulin-1、α-tubulin-2、18S rRNA、ubiquitin、β-actin、β-tubulin)的mRNA差异表达情况,并采用ge Norm软件分析了它们在两种条件下的表达稳定性。结果表明,ubiquitin和α-tubulin-2为桉树焦枯病菌在NaCl胁迫下表达最稳定的基因,且不需要引入第3个基因;18S rRNA和α-tubulin-1为侵染桉树叶片下表达最稳定的基因,但需引入第3个基因GAPDH。因此,ubiquitin和α-tubulin-2为桉树焦枯病菌在NaCl胁迫下较适合的内参基因,而18S rRNA、α-tubulin-1和GAPDH为侵染桉树叶片较适合的内参基因。     

大豆不同发育时期及非生物胁迫下实时荧光定量PCR内参基因筛选

为研究大豆在不同发育时期的不同组织、不同非生物胁迫下稳定表达的最适内参基因,以大豆“JN28”V1时期的根、茎、叶,R3、R4时期的豆荚,R5、R8时期的子粒,干旱、低温、盐、脱落酸（ABA）胁迫下的根和叶共15个样本为试验材料。选择8个候选内参基因（Actin,β-actin,CYP2,EF1-α,Fbox,GAPDH,TUB4,18SrRNA）进行实时荧光定量PCR检测,并分析8个候选内参基因表达的稳定性。利用geNorm、NormFinder、BestKeeper软件分析后,再经过RefFinder计算筛选出合适的内参基因。结果表明：4个软件的分析结果不同,以RefFinder综合分析结果显示,V1期的根和叶、R3期的豆荚、ABA胁迫下的根,最适的内参基因为Actin;V1期的茎、R4期的豆荚、R8期的子粒,最适内参基因为EF1-α;R5期的子粒、干旱胁迫下的叶,最适内参基因为Fbox;干旱胁迫下的根,最适的内参基因为CYP2;盐胁迫的根、ABA胁迫下的叶,最适内参基因为18SrRNA;低温胁迫下的叶,最适内参基因为β-actin;低温胁迫下的根,最适内参基因为EF1-α和18S...     

大蒜NAC基因家族的鉴定与低温表达分析

为挖掘大蒜NAC转录因子家族成员，研究其在低温胁迫下的表达特性，基于大蒜转录组的测序结果，对低温胁迫下大蒜NAC转录因子家族的响应进行分析。结果表明，共鉴定出49个大蒜NAC基因，根据系统发育特征将其分为10个亚族。大蒜NAC蛋白的序列长度为81～619 aa，分子量9 293.66～70 229.04 Da，且均为亲水蛋白。保守结构域分析发现，大部分NAC蛋白在N端具有保守性，其中18个NAC蛋白在N端均有motif 3、motif4、motif1、motif2、motif5保守域。从中随机挑选6个蛋白（AsNAC001、AsNAC010、AsNAC013、AsNAC014、AsNAC017、AsNAC047）对其进行蛋白二级及三级结构的预测，发现无规则卷曲是构成大蒜NAC蛋白的重要组成部分，其次是α-螺旋和延长链，且这6个NAC蛋白具有高度的相似性。实时荧光定量分析发现，检测的6个NAC基因中有4个（AsNAC001、AsNAC010、AsNAC013、AsNAC014）在低温胁迫12和24 h时显著上调表达；2个（AsNAC017、AsNAC047）在低温胁迫4 h时显著下调表达...     

偏穗鹅观草RT-PCR内参基因筛选及验证

偏穗鹅观草（Roegneria komarovii Nevski）是小麦族鹅观草属的植物，具有抗旱、抗病等特点，是多年生优良牧草，也是小麦三级资源库。为分析偏穗鹅观草耐盐机制及抗病基因的表达，筛选出偏穗鹅观草在不同非生物胁迫条件下稳定表达的内参基因，以偏穗鹅观草根、茎、叶对照组及盐胁迫处理组的偏穗鹅观草为材料，利用实时荧光定量PCR (qRT-PCR)技术，对肌动蛋白（Actin1、Actin2、Actin3）、微管蛋白（BUTB）、亲环素（Cyclophilin）、甘油醛-3-磷酸脱氢酶（glyceraldehyde-3-phosphate,GAPDH）、组蛋白（histone 3, H3）、延伸因子（EF1a1）8个常用小麦内参基因进行筛选；并借助geNorm、BestKeeper软件对内参基因表达的稳定性进行评价，进一步利用SnRK2基因对获得的内参基因的稳定性和可靠性进行验证。结果表明，2个软件筛选出的内参基因基本一致，8个候选内参基因在偏穗鹅观草不同胁迫处理下的表达丰度及稳定性存在差异，盐处理及干旱处理下Cyclophilin、GAPDH稳定性表现最好，高温处理下EF1a1、...     

高温胁迫下景宁木兰淀粉与蔗糖代谢途径转录分析

  目的  从分子生物学角度探究景宁木兰Magnolia sinostellata能否适应城市高温环境,为木兰属Magnolia植物城市推广应用和胁迫分子研究奠定基础。  方法  采取人工控制实验,对景宁木兰幼苗进行40 ℃极端高温处理,测定果糖、葡萄糖、蔗糖、淀粉碳同化产物,以及果糖磷酸酶、蔗糖磷酸合成酶,进行了转录组测序。  结果  随着胁迫时间的延长,景宁木兰叶片果糖、葡萄糖、蔗糖、淀粉质量分数发生一定的变化,但是差异不显著(P＞0.05),果糖合成酶活性呈现显著下降趋势(P＜0.05),蔗糖合成酶变化不显著(P＞0.05)。转录组数据进一步揭示了在高温胁迫下,相比于24 h,48 h时景宁木兰叶片调节淀粉合成的SS(Unigene 40295)、Glc-1-pa(Unigene 38453)、GBE(CL4668.contig3)基因的表达量增加,随着高温胁迫的加深,调节蔗糖合成的SPS基因呈现下降趋势,并通过荧光定量验证了以上结果。  结论  景宁木兰对极端高温(40 ℃)有一定的短时耐受性,为应对高温胁迫,不但碳同化产物发生显著变化,调控淀粉与蔗糖代谢途径的关键基因表达也发生了变化,进一步证明了高温会导致景宁木兰叶片内蔗糖和淀粉的相互转化。图4表3参25     

不同盐度下中华绒螯蟹胁迫相关基因的表达差异

通过对中华绒螯蟹在4个盐度梯度(0、10、20、30)下的胁迫试验,观察了4个类别的10个相关基因,即4个能量代谢相关基因、3个生长相关基因、2个应激性相关基因和1个渗透压调节相关基因的表达情况.结果表明:3个能量代谢相关基因(VATB、UBE、GAPDH)、1个应激性相关基因(GST)和渗透压调节相关基因(NAK)在不同盐度间的表达量存在显著差异(P0.05),而其他基因的表达量差异不显著(P0.05).应用Best Keeper、Norm Finder和Ge Norm 3个软件对各基因的稳定性进行分析发现:应激性相关基因(GST)和渗透压调节相关基因(NAK)对盐度变化的响应程度较高,表达不稳定;3个生长相关基因(S27、β-ACTIN、α-TUB)对盐度变化的响应程度低,表达稳定,可以作为不同盐度处理下基因差异表达的内参基因.     

Identification of suitable reference genes in leaves and roots of rapeseed(Brassica napus L.)under different nutrient deficiencies

Nutrient deficiency stresses often occur simultaneously in soil. Thus,it's necessary to investigate the mechanisms underlying plant responses to multiple stresses through identification of some key stress-responsive genes. Quantitative real-time PCR(qRT-PCR)is essential for detecting the expression of the interested genes,of which the selection of suitable reference genes is a crucial step before qRT-PCR. To date,reliable reference genes to normalize qRT-PCR data under different nutrient deficiencies have not been reported in plants. In this study,expression of ten candidate reference genes was detected in leaves and roots of rapeseed(Brassica napus L.)after implementing different nutrient deficiencies for 14 days. These candidate genes,included two traditionally used reference genes and eight genes selected from an RNASeqdataset. Two software packages(Ge Norm,Norm Finder)were employed to evaluate candidate gene stability. Results showed that VHA-E1 was the highest-ranked gene in leaves of nutrient-deficient rapeseed,while VHA-G1 and UBC21 were most stable in nutrient-deficient roots. When rapeseed leaves and roots were combined,UBC21,HTB1,VHA-G1 and ACT7 were most stable among all samples. To evaluate the stabilities of the highest-ranked genes,the relative expression of two target genes,Bn Trx1;1 and Bn Pht1;3 were further determined. The results showed that the relative expression of Bn Trx1;1 depended on reference gene selection,suggesting that it's necessary to evaluate the stability of reference gene prior to qRT-PCR. This study provides suitable reference genes for gene expression analysis of rapeseed responses to different nutrient deficiencies,which is essential for elucidation of mechanisms underlying rapeseed responses to multiple nutrient deficiency stresses.     

景宁木兰PIF转录因子的生物信息学分析及极端遮阴条件下的表达模式

  目的  群落所造成的遮阴是导致景宁木兰Magnolia sinostellata濒危的重要因素之一。PIF家族转录因子在光信号传导和植物生长发育中起到重要作用。对PIF家族转录因子进行系统分析和研究,为探究其在景宁木兰光信号转导机制中的作用奠定基础。  方法  从景宁木兰转录组数据中鉴定获得PIF家族转录因子并进行生物信息学分析,利用实时荧光定量聚合酶链式反应(qRT-PCR)技术对其在极端遮阴条件下的表达模式进行分析。  结果  从景宁木兰转录组中共筛选出9个MsPIFs转录因子基因,其编码的蛋白质长度为188~735 个氨基酸,蛋白质大小为20 314.56~78 957.02 Da,理论等电点范围为5.18~8.22。MsPIFs基因编码的蛋白质均为不稳定蛋白质,所有蛋白质均为亲水性蛋白质。亚细胞定位预测结果显示所有蛋白质均定位于细胞核。9个蛋白质均具有丝氨酸(Ser)、苏氨酸(Thr)和酪氨酸(Try)磷酸化位点。qRT-PCR结果表明:极端遮阴条件下,9个MsPIFs家族基因表达均发生不同程度的变化。其中,MsbHLH23的表达变化较其他基因更为明显,遮阴处理5和10 d时的表达量分别上调为对照的52.77与20.03倍。  结论  景宁木兰PIF转录因子家族均能响应遮阴,为后续对MsPIFs进行生物学功能鉴定奠定了基础。图7表3参32     

甜菜WRKY转录因子全基因组鉴定及其在非生物胁迫下的表达分析

【目的】WRKY转录因子是一类植物响应生物、非生物胁迫,对生长发育都起重要调控作用的转录因子。在甜菜全基因组信息分析的基础上,鉴定WRKY家族基因(Bv WRKYs),解析其组织特异性及盐、热胁迫下的表达情况,为该类基因的功能研究提供参考,为观赏甜菜和石竹目其他观赏植物的基因工程打下基础。【方法】以75条拟南芥WRKY蛋白为参考,根据WRKY保守蛋白序列(PF03106)利用hmm和BLAST同源性搜索对甜菜WRKY家族基因进行鉴定。利用Map Inspect、GSDS2.0、MEGA5.0、DNAMAN5.0、Web Logo 3、MEME生物信息学工具对甜菜WRKY家族基因染色体定位、系统发生关系、基因结构、蛋白质保守结构域、保守元件进行预测和分析。利用RNA-seq和q RT-PCR分析甜菜WRKY组织表达特异性,盐胁迫、热胁迫条件下WRKY表达情况。【结果】甜菜WRKY家族基因包含40个成员,其中39条不均匀地分布在9条染色体上,另外1条定位到随机片段上。根据WRKY保守域特征并与拟南芥WRKY蛋白进化分析,可将40个成员分为Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ3类,Ⅰ类有9个成员,Ⅱ类有26个成员,Ⅲ类有5个成员。根据进化关系Ⅱ类可进一步分为Ⅱa(1个)、Ⅱb(4个)、Ⅱc(9个)、Ⅱd(5个)和Ⅱe(7个)5个亚类。基因结构分析发现,甜菜WRKY外显子和内含子数目具有高变异性(2—7个外显子),即使同一亚类内也都差异较大。保守元件分析显示同一类或亚类内成员具有相同的保守元件。WRKY保守域分析发现2个WRKY七肽域变型:WRKYGKK和WRKYGEK。每个WRKY至少在2个组织中表达,30个WRKY在叶中表达,40个WRKY在花序中均有表达,36个WRKY在幼叶中有表达,38个WRKY在直根中有表达,39个WRKY在幼苗中有表达,36个WRKY在种子中有表达。各WRKY表达量差异较大,可分为低表达、高表达基因两类,如Bv WRKY23、Bv WRKY3、Bv WRKY11、Bv WRKY7、Bv WRKY6、Bv WRKY26、Bv WRKY4、Bv WRKY40、Bv WRKY24、Bv WRKY2和Bv WRKY28在各组织中均有较高表达,而Bv WRKY38、Bv WRKY13、Bv WRKY36、Bv WRKY35、Bv WRKY5和Bv WRKY34在各组织中均表达较低。热胁迫条件下Bv WRKY16、Bv WRKY21、Bv WRKY20、Bv WRKY22、Bv WRKY32、Bv WRKY33和Bv WRKY34上调表达;盐胁迫条件下Bv WRKY1、Bv WRKY6、Bv WRKY19、Bv WRKY31和Bv WRKY33呈现不同程度上调表达;Bv WRKY33对热、盐2种胁迫均有明显响应。【结论】甜菜WRKY蛋白结构高度保守,基因序列长度和内含子数量变化很大,在不同组织中呈现出多种表达模式,部分WRKY响应热或盐胁迫,对甜菜逆境生理调控起重要作用。     

11种杀虫剂对松墨天牛延伸因子2(EF-2)基因表达的影响

[目的]研究杀虫剂对松墨天牛延伸因子2（MaEF-2）的影响,为深入研究MaEF-2的功能、利用延伸因子基因靶标有效防治松墨天牛提供参考.[方法]从松墨天牛文库中分离得到EF-2cDNA序列,利用RT-qPCR技术测定了11种杀虫剂胁迫后MaEF-2的相对表达量.[结果]得到的MaEF-2基因的部分序列,长度为1 184bp,编码287个氨基酸;与黑腹果蝇（Drosophila melanogaster）和家蚕（Bombyx mori氨基酸相似性分别为92％和93％.RT-qPCR测定结果表明,杀虫剂作用下MaEF-2均上调表达,表达量为对照的1.28 ～11.59倍.[结论]啶虫脒的相对表达量最高,毒死蜱和噻虫啉的表达量最低,这可能表明松墨天牛产生了自我保护反应.     

近零磁场下灰飞虱转录表达分析稳定性内参基因筛选

【背景】 地磁场（geomagnetic field,GMF）并不是稳定不变的,其随时间和空间时刻变化。目前,随着对动物磁生物学研究的日益深入,基于实时荧光定量PCR (qRT-PCR)技术开展的磁响应基因转录表达谱研究有力促进了磁响应通路的鉴定和磁感受机制的揭示。【目的】 筛选近零磁场（near-zero magnetic field,NZMF）下短翅型灰飞虱（Laodelphax striatellus）稳定表达的内参基因,使对目的基因的定量分析更加准确。【方法】 迁飞性昆虫灰飞虱采自江苏省农业科学院试验田并在室内使用TN1三叶期稻苗进行扩繁（温度：（25.0±1.0）℃,相对湿度：70%—90%,光周期：14L﹕10D）。采用亥姆霍兹线圈室内模拟近零磁场（NZMF;＜500 nT）和地磁场（GMF;~50 000 nT）,人工模拟磁场强度有效处理空间为直径30 cm的球形空间,试验过程中严格控制除磁场强度外的环境因子（温度：（25.0±1.0）℃,相对湿度：75%,光周期：14L﹕10D）并利用磁通门计每日对人工模拟磁场进行校准和监测,灰飞虱连同TN1三叶期稻苗均置于试管中进行暴露处理,每隔两日与对照磁场中稻苗对调以避免稻苗潜在磁响应对灰飞虱的影响。利用Trizol法分别提取初羽化灰飞虱雌、雄成虫总RNA,检测各生物学重复RNA质量并调至含量一致,反转录为cDNA,利用qRT-PCR技术并结合常用内参筛选分析软件geNorm、NormFinder、BestKeeper以及在线综合分析系统RefFinder对在NZMF和GMF两种磁场强度下灰飞虱体内的内参基因稳定性进行评估筛选,其中,待评估的11个常用内参基因包括Actin1、Tubulin（α1TUB和α2TUB）、Elongation factor 1 alpha（EF-1α）、Glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase（GAPDH）、Ubiquitin（UBI）、Ribosomal protein S11（RPS11）、Ribosomal protein S15e（RPS15）、Ribosomal protein L8（RPL8）、Ribosomal protein L9（RPL9）和ADP ribosylation factor2（ARF2）。【结果】 不同磁场环境（NZMF vs. GMF）下,灰飞虱短翅雌成虫EF-1α和RPL9表达稳定性在geNorm和NormFinder两种评估方法中都居于前两位,与BestKeeper软件的结果略有差异,进而利用在线工具RefFinder对以上3种方法的评估结果进行稳定性综合排序,结果表明EF-1α稳定性最好,RPL9稳定性次之;灰飞虱短翅雄成虫中,基于geNorm、NormFinder和BestKeeper 3种评估方法,α2TUB和RPL9表达稳定性中均居于前两位,而Actin1表达稳定性虽在NormFinder和BestKeeper中处于前两位,但其在geNorm中稳定性较低,最后,通过在线工具RefFinder综合分析表明,α2TUB稳定性最好,RPL9稳定性次之。【结论】 明确了不同磁场强度（NZMF vs. GMF）下适用于灰飞虱短翅雌、雄成虫中稳定表达的内参基因,其中,若使用双内参系统,雌成虫中可使用EF-1α和RPL9搭配,雄成虫中可使用α2TUB和RPL9搭配,为稳定表达的内参基因系统。此外,RPL9在灰飞虱短翅型雌、雄成虫中均可作为稳定的单一内参基因使用。研究结果确保了对灰飞虱响应磁场强度变化研究中关键目的基因转录表达的准确定量,并为今后开展磁场强度变化下的转录表达谱分析提供了有力保障。     

竹林金针虫实时荧光定量PCR内参基因的筛选与应用

  目的   筛选平沙绿僵菌Metarhizium pingshaense侵染条件下筛胸梳爪叩甲Melanotus cribricollis幼虫稳定表达的内参基因,为该竹林金针虫相关基因的表达研究奠定基础。   方法   基于筛胸梳爪叩甲幼虫的转录组数据,利用实时荧光定量PCR扩增特异性引物,分析相关性和扩增效率;利用GeNorm、NormFinder和BestKeeper软件评估筛选出6个候选内参基因(β-actin、GAPDH、α-tubulin、RPL13α、RPS3、RPS27a),并验证其表达稳定性。   结果   GeNorm分析结果显示:PRS27a和RPS3的表达最稳定,随后依次是α-tubulin、RPL13α、β-actin和GAPDH;最适合的内参基因数目为2。NormFinder分析结果显示:RPL13α的表达最稳定,随后依次是α-tubulin、RPS3、RPS27a、β-actin和GAPDH。BestKeeper分析结果显示:β-actin和GAPDH的P＞0.5,不适合作为本试验条件下的内参基因。不同软件分析得出的候选内参排序存在一定差异。综合分析和表达稳定性验证表明PRS27a或RPS3是最佳内参基因,6个目的基因的表达水平变化趋势均基本一致。   结论   PRS27a和RPS3是研究平沙绿僵菌侵染的竹林金针虫相关基因表达的最佳内参基因。图3表3参27