猪生殖和呼吸综合征中国分离株ORF5基因的克隆及序列分析

本研究利用对应于ＰＲＲＳＶＡＴＣＣＶＲ－２３３２株及ＬＶ株ＯＲＦ５基因保守序列的１对均为２５个碱基的引物１００５ＰＳ、１００６ＰＲ对ＰＲＲＳＶ中国分离株Ｂ１３进行ＲＴ－ＰＣＲ,扩增出了包括完整ＯＲＦ５基因的ＤＮＡ片段,片段长约７３０ｂｐ。将此片段定向克隆入ｐＵＣ１８载体的ＥｃｏＲＩ和ｓｔＩ位点之间,获得了Ｂ１３ＯＲＦ５基因与ｐＵＣ１８载体的重组质粒。通过ＥｃｏｒＩ／ＰｓｔＩ、ＥｃｏｒＩ／ＨｉｎｄⅢ     

旋毛虫ES抗原结构基因TSPGⅡ重组表达质粒构建

用限制性内切酶ＥｃｏＲⅠ和ＨｉｎｄⅢ,从克隆载体ｐＵＴＳⅡ中切出一个０．９８８ｋｂＴＳＰＧⅡ基因,经ＥｃｏＲＩ和ＢｓｔＸＩ酶切鉴定,同时表达载体也用相同的酶进行酶切,经琼脂糖凝胶电泳,分别回收ＴＳＰＧⅡ基因和ｐＳＶ·ＳＰＯＲＴⅠ表达载体,用Ｔ４ＤＮＡ连接酶定向连接,转化大肠杆菌感受态细胞,挑取重组子,经ＥｃｏＲⅠ,ＢｓｔＸⅠ和ＨｉｎｄⅢ酶切鉴定,构建了重组表达质粒ｐＳＶ·ＴＳⅡ．     

苏云金芽胞杆菌CryⅠ基因RNA探针载体的构建

将办云金芽胞杆菌杀虫晶体蛋白ＣｒｙⅠＡ基因的高保守区ＥｃｏＲＩ－Ｆ片段重组到ｐＳＥ－ＬＥＣＴ－１载体的ＥｃｏＲＩ位点，构建出能够高效转录ＲＮＡ的探针载体ｐＳＢＰＬ－１。该载体在Ｔ７ＲＮＡ聚合酶作用了，通过ＤＩＧ体外标记转录制备的ＲＮＡ探针，具有灵敏度高，背景清楚，省时等优点，为苏云金芽胞杆菌分子生物学研究，及对鳞翅目有特异毒性高效菌株的筛选提供了一种方便而有效的方法。     

藏山羊RAPD及RFLP标记的初步研究

利用简单随机抽样获得亚东山羊（ｎ＝６）,高原型藏山羊（ｎ＝１５）样本,以吕梁山羊为对照进行基因组ＤＮＡＲＡＰＤ及ＲＦＬＰ标记的分析。结果表明,序列为５′－ＴＧＧＴＧ－ＣＡＣＴＣ－３′的随机引物可以作为区分亚东山羊与高原型藏山羊的标记引物,Ｓ及ＭＡＰＤ在某种程度上揭示了类群间遗传相似性;ＥｃｏＲⅠ,ＨａｅⅢ单酶切,ＥｃｏＲⅠ／ＨｉｎｄⅢ双酶切亚东山羊和高原型藏山羊基因组ＤＮＡ分别产生可观察的ＲＦＬＰ条带。     

EoSNPV egt基因的克隆和部分核苷酸序列的分析

以ＡｃＭＮＰＶ ｅｇｔ基因为探针,通过Ｓｏｕｔｈｅｒｎ杂交和原位杂交,克隆了含ＥｏＳＮＰＶ ｅｇｔ基因的４．９５ｋｂ ＥｃｏＲ Ｉ－Ｋ片段,并进一步亚克隆了含完整ｅｇｔ基因编码区的１．８ｋｂ ＨｉｎｄⅢ－ＥｃｏＲＶ片段。应用双脱氧链终止法,测定了基因编码区中的Ｘｈｏ Ｉ－ＨｉｎｃⅡ片段４７１ｂｐ的核苷酸全序列,计算机分析表明,该片段编码的１５７个氨基酸序列与其它杆状病毒ｅｇｔ基因保守区的Ⅳ（部分）     

拟南芥菜LEAFY基因片段的分离及果树基因组中存在LEAFY同源基因…

利用ＰＣＲ技术从拟南芥菜基因组ＤＮＡ中扩增出一条长４１４ｂｐ的ＤＮＡ片段。该片段被克隆到ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＳＫ（－）手ＥｃｏＲＶ位点上。序列分析结果证实扩增和克隆的ＤＮＡ片段是分生组织特征基因ＬＥＡＦＹ３＇端的部分片，不含内含子序列。结果表明，供试果树，基因组中均存在单拷贝的ＬＥＡＦＹ同源基因。     

传染性支气管炎病毒T株核衣壳蛋白（N）基因的克隆及部分序列分析

人工合成一双对应于ＩＢＶ－Ｂｅａｕｄｅｔｔｅ株Ｎ基因ＯＲＦ两侧序列的引物,应用ＲＴ－ＰＣＲ方法,获得肾型传染性支气管炎病毒Ａｕｓｔｒａｌｉａ－Ｔ株核衣壳蛋白基因,长度１．２３ｋｂ,利用引物设计中的ＥｃｏＲ Ｉ位点将其克隆至载体ｐＳＫ（＋）中,对该基因进行限制性酶切分析。结果与已报道的相一致。通过Ｎ基因的Ｃ端部分序列分析及与Ｂｅａｕｄｅｔｔｅ株、Ｍ４１标准株和日本分离株相比较,结果表明该部分的序列有     

FPV282E4株BamHI7．3kb片段的亚克隆

选用ＦＰＶ２８２Ｅ４株ＢａｍＨＩ７．３ｋｂ含非必需区片段，经ＸｂａⅠ酶切，将Ａ、Ｂ、Ｃ３个片段亚克隆于ＫＳ（—）质粒中，同时使Ｄ片段自身环化，获得ＫＳＦａ、ＫＳＦｂ、ＫＳＦｃ、ｐＵＣＦｄ４个重组克隆，经酶切鉴定证明亚克隆正确。为以ＦＰＶ基团组非必需区的ＢａｍＨＩ７．３ｋｂ片段中ＢｇｌⅡ片段所在区域构建重组载体质粒和体内重组表达外源基因的研究以及非必需区的核苷酸序列分析奠定基础     

鸽Ⅰ型禽副粘病毒F基因克隆及序列分析

利用ＲＴ－ＰＣＲ技术获得了编码鸽Ⅰ型禽副粘病毒ＧＤ－Ｐ１分离株Ｆ０裂解位点附件８８４ｂｐ的Ｆ基因ｃＤＮＡ片段,并将其克隆到ｐＧＥＭ－Ｔ Ｅａｓｙ质粒中,获得了重组质粒Ｔ－ｐＰＭＶ－Ｆ－Ｉ,核酸序列测定和分析表明,该片段与新城疫病毒强毒株Ｆ４８Ｅ９和ＨＥＲ／３３相应区域的同源性分别为８７．５％和８８．１９％,与新城疫病毒弱毒株ＬａＳｏｔａ和Ｂ１株的同源性分别为８３．８３％和８４．１５％。该病毒Ｆ０裂     

番茄乙烯形成酶基因的克隆及其反义基因的表达载体构建

从成熟的番茄果实中提取总ＲＮＡ,进行ＲＴ－ＰＣＲ扩增合成乙烯形成酶ｃＤＮＡ,并将其克隆至载体Ｂｌｕｅｓｃｒｉｐｔ的ＥｃｏＲＶ位点,经限制酶谱分析,构建亚克隆进行全序列测定和序列分析。将所克隆基因以反义基因的形式定向重组到载体ｐＳＰＲＯＫ上,同时将带有完整启动子和终止子的标记基因ＢＡＲ基因引入ｐＳＰＲＯＫ中,最终获得表达乙烯形成酶反义基因和ＢＡＲ基因的植物表达载体ｐＢＡＲ－ＥＦＥ。     

甜瓜果实八氢番茄红素合成酶基因的克隆及正义表达载体的构建

根据C,enBank中登记的甜瓜八氢番茄红素合成酶（CmPSY）基因序列设计引物,利用lit—PCR技术克隆了甜瓜PSY全长基因,该基因全长1443bp,编码421个氨基酸,在GenBank中登记号为GU361622。以＆帆HI和剐I双酶切pMDI8-T—CmPSY和表达载体pBI121,再将回收的目的片段与pBI121用T4 DNA连接酶连接,结果证明,渊y正向插入到pBI121中,得到了pBI121-CmPSY的重组质粒。该研究为了解甜瓜八氢番茄红素合成酶的活性调节机制,并通过基因工程手段研究甜瓜PSY的活性奠定了基础。     

抗除草剂bar基因植物表达载体的构建与抗性功能的检测

摘要：根据GenBank上发表的抗除草剂har基因序列设计引物,通过高保真DNA聚合酶进行PCR扩增,获得har基因片段,连接在pMD18-T中间克隆载体上,用限制性内切酶XbaI和BamHI酶切后连接到pBI121上获得pBI121-bar。用HindⅢ内切酶切含Bt-4AB基因的质粒并与pBI121-bar重组,重组质粒命名为pBI121-bar／Bt。重组质粒导人农杆菌LBA4404工程菌中,转化新海24号棉花胚性愈伤组织。PPT抗性实验证明,构建的pBI121-bar／Bt载体获得抗除草剂抗性,并筛选出PPT临界筛选浓度为3．0mg／L。     

猪传染性胃肠炎病毒S基因植物表达载体的构建

应用RT-PCR技术克隆了猪传染性胃肠炎病毒TGEV-JL株S基因全序列,将其连接到pMD18-T载体。经SacⅠ和BamHⅠ酶切鉴定,其产物全长4320bp。测序后与TH-98等8个TGEV毒株的S基因序列进行比对,同源性为97.6%～99.8%。将该基因插入植物表达载体pBI121的CaMV35S启动子下游,构建高效植物表达载体,转入根癌农杆菌EHA101中。结果表明:成功构建了重组植物表达载体pBI121-S,获得农杆菌工程菌。     

甜瓜蔗糖合成酶基因(CmSS1)反义表达载体的构建及遗传转化

以BamHⅠ和SalⅠ双酶切pMD18-T-CmSS1和表达载体pBI121,再用T4 DNA连接酶将回收的目的片段反向与pBI121连接。结果证明,CmSS1反向插入到pBI121中,得到了pBI121-CmSS1的重组质粒;利用农杆菌介导法将反义CmSS1基因转化甜瓜,经PCR检测,得到5株转基因植株。这为以后研究甜瓜蔗糖合成酶的活性调节机制及通过基因工程手段研究甜瓜SS的活性奠定了基础。     

草莓乙烯受体FaEtr2基因的克隆及其反义表达载体的构建

为了构建草莓乙烯受体FaEtr2基因的反义表达载体,在已报道的FaEtr2基因序列的基础上,设计特异引物,克隆草莓乙烯受体FaEtr2基因部分特异序列,将该片段反向插入植物表达载体pBI121的CaMV 35S启动子和NOS终止子之间,构建了反义表达载体pBI121Etr2。通过双酶切鉴定后,导入农杆菌EHA105中,酶切和PCR鉴定表明质粒已导入到农杆菌中。本研究为后期该反义基因转化草莓品种以改良草莓果实耐贮运性打下基础。     

含绿色荧光蛋白及trp3iar基因的草菇表达载体的构建

分别用限制性内切酶EcoR I和HindIII酶切质粒pBGgHg,将切下的含双孢蘑菇gpd启动子、EGFP基因和35S终止子的碱基序列连接到含Ap抗性的pBSK II上,再将这一段序列切下连接到含kan抗性的pCAMBIA1300载体上,形成中间质粒载体YH2873。用限制性内切酶HindIII分别酶切质粒YH2873和质粒pDB06,将从pDB06切下的trp3iar基因连接到中间质粒载体YH2873上,得到表达载体pSAGF。中间载体pYH2873经限制性内切酶EcoR I和HindIII酶切,电泳后显示1.3 kb的目的片断和9 kb的载体片断,表达载体pSAGF经限制性内切酶HindIII酶切,电泳后显示4 kb的trp3iar基因的目的片断和10 kb的载体片断,进一步测序证明重组质粒连接正确,成功构建了草菇的表达载体pSAGF。     

含绿色荧光蛋白及trp3iar基因的草菇表达载体的构建

分别用限制性内切酶EcoR I和HindIII酶切质粒pBGgHg,将切下的含双孢蘑菇gpd启动子、EGFP基因和35S终止子的碱基序列连接到含Ap抗性的pBSK II上,再将这一段序列切下连接到含kan抗性的pCAMBIA1300载体上,形成中间质粒载体YH2873。用限制性内切酶HindIII分别酶切质粒YH2873和质粒pDB06,将从pDB06切下的trp3iar基因连接到中间质粒载体YH2873上,得到表达载体pSAGF。中间载体pYH2873经限制性内切酶EcoR I和HindIII酶切,电泳后显示1.3 kb的目的片断和9 kb的载体片断,表达载体pSAGF经限制性内切酶HindIII酶切,电泳后显示4 kb的trp3iar基因的目的片断和10 kb的载体片断,进一步测序证明重组质粒连接正确,成功构建了草菇的表达载体pSAGF。     

胰蛋白酶抑制剂SKTI3基因的克隆及其植物表达载体的构建

以大豆基因组DNA为模板,利用聚合酶链式反应(PCR)技术克隆了大豆胰蛋白酶抑制剂基因SKTI3的全长DNA片段,并将其构建到pMD18-T vector上。核苷酸序列测定结果表明:该基因片段全长654 bp,与已发表的SKTI3基因序列同源性达99%。将目的基因片段插入到pB I121 35S启动子下,构建重组质粒pB ISKTI3,采用冻融法将该重组质粒转入农杆菌EHA105中,获得了植物表达载体。     

轮状病毒外壳抗原蛋白VP4基因转化苎麻的研究

利用套叠PCR技术对轮状病毒外壳抗原蛋白VP4基因进行了定点突变,将改造后的基因插入pBI121构建植物表达载体。在设计PCR引物时,引入植物表达载体pBI121具有的克隆位点BamH I和Sac I,利用BamH I和Sac I切除pBI121上的GUS基因并使载体质粒线性化,用同样的2种酶消化pTVP4克隆载体获得VP4基因片段,使之形成与线性化pBI121质粒相同的粘性末端。在T4DNA连接酶的作用下,将线性化pBI121质粒和酶切后的VP4基因片段连接成新的重组质粒pBI121/VP4,通过直接转化法转化到根癌农杆菌(Agrobacteriumefaciens)EHA105菌株中,获得农杆菌工程菌株。采用叶盘转化法转化苎麻(Boehmeria.nivea L.Guad)栽培品种圆叶青,以卡那霉素抗性作为转化植株的筛选标记获得抗性植株。经PCR、PCR Southernblot分析表明,初步获得了轮状病毒外壳蛋白VP4的转基因苎麻植株。     

牡丹ACC氧化酶基因片段的克隆及其反义表达载体的构建

利用CTAB改良法提取牡丹洛阳红花瓣总RNA,通过反转录酶和设计的ACC氧化酶基因特异引物合成709bp目的片段,进行测序和比对,以确定目的片段的正确性。在709bpACC氧化酶基因片段和pBI121植物表达载体上选择合适的酶切位点,进行XbaⅠ和SmaⅠ双酶切。将709bp片段上切下的510bp片段反向插入pBI121植物表达载体35S启动子后面,构建成含510bp牡丹ACC氧化酶基因反义表达载体。最后采用电击法转化进感受态农杆菌GV3101,以备用于花粉管通道法转化牡丹。