深海盐单胞菌产生的微生物絮凝剂HBF-3对刚果红模拟染料废水脱色的研究

以深海盐单胞菌V3a′(Halomonas sp.V3a′)合成的新型微生物絮凝剂HBF-3对刚果红模拟染料废水进行脱色试验,探讨HBF-3加入量、溶液pH、温度对脱色效果的影响,并与活性炭和壳聚糖对刚果红染料的脱色效果进行对比。结果表明:增加HBF-3的加入量可以提高对刚果红溶液的脱色效果,HBF-3质量浓度为100mg/L时对200mg/L刚果红的去除率达83.7%;HBF-3对染料废水脱色效果受pH值的影响大,pH值在5.0～6.0时,HBF-3对刚果红溶液的脱色效果较弱,为41.1%左右;pH值在7.0～9.0之间变化时,脱色率稳定在88.7%左右;在10～70℃范围内絮凝率随温度变化而改变的幅度小。     

球形芽孢杆菌S-腺苷甲硫氨酸合成酶基因的克隆、表达与活性鉴定

根据S-腺苷甲硫氨酸合成酶的保守性，利用苏云金芽孢杆菌（Bacillus thuringiensis）基因组中S-腺苷甲硫氨酸合成酶序列信息设计引物。以球形芽孢杆菌（Bacillus sphaericus, B.sph）基因组DNA为模版，扩增获得S-腺苷甲硫氨酸合成酶基因，酶解后插入大肠杆菌表达载体pGEX-6P-1，获得重组质粒pGEX-SAM。序列分析表明，来自球形芽孢杆菌的SAM合成酶在基因水平上与大肠杆菌（K02129），枯草芽孢杆菌（Z99129），酿酒酵母（U17246），小鼠（J05571），人（BC018359）的S-腺苷甲硫氨酸合成酶基因，分别有63.9%，75.4%，58.8%，59.1%，55.7%的同源性。由于一级结构存在明显的差异，我们将该重组的质粒转入大肠杆菌DH5α。通过亲和层析纯化出球形芽孢杆菌S-腺苷甲硫氨酸合成酶。用HPLC对S-腺苷甲硫氨酸合成酶的活性进行了分析。     

费氏弧菌β-内切葡聚糖酶基因在大肠杆菌中的表达及酶学分析

以费氏弧菌（Vibrio fischeri）EM17基因组DNA为模板，通过PCR方法克隆了该菌的β-内切葡聚糖酶基因（GenBank Accession Number : EF533943）。将其插入到表达载体pGEX-6p-1中，转化大肠杆菌BL21（DE3），诱导表达。测序结果经DNAMAN软件分析，该基因与GeneBank中费氏弧菌 ES114基因组预测的β-内切葡聚糖酶基因同源性达到97.1％，但与GeneBank中其他β-内切葡聚糖酶基因同源性较低。酶学性质研究表明，该酶的最适反应温度为60℃，最适反应pH值为9.0。同时研究了6种金属离子对该酶活性的影响，结果显示该酶活性依赖金属离子的存在 Mg2+，Ca2+对酶有激活作用，Mn2+, Pb2+则严重抑制该酶的活性。     

土壤总DNA中草甘膦N-乙酰转移酶基因的克隆及酶学特性分析

实验通过PCR程序从提取的土壤总DNA中扩增出草甘膦N-乙酰转移酶基因(gat),酶解后插入大肠杆菌(Es-cherichia coli)表达载体pGEX-6p-1,获得克隆株。基因测序表明,与GenBank中的AX543338核苷酸序列有99.3%的同源性。将GAT经亲和层析纯化后,对该酶的酶学性质进行了初步分析,结果表明,该酶的最适温度为30℃,最适反应pH7。检测了6种金属离子对酶活性的影响,发现单价离子K 和Na 对GAT的激活作用高于双价离子Mg2 和Mn2 ,其中Na 的激活作用最强,而Ca2 有明显的抑制作用。     

球形芽胞杆菌S-腺苷甲硫氨酸合成酶基因的克隆和表达

根据S-腺苷甲硫氨酸合成酶(SAMS)基因核苷酸序列的保守性,利用苏云金芽胞杆菌(Bacillus thuringiensis)基因组中SAMS序列信息设计引物。通过PCR扩增出球形芽胞杆菌(Bacillus sphaericus)SAMS基因,插入大肠杆菌(Escherichia coli)表达载体pGEX-6P-1,获得重组质粒pGEX-SAM。序列分析表明,来自球形芽胞杆菌的SAMS与大肠杆菌(K02129)、枯草芽胞杆菌(U52812)、酿酒酵母(U17246)、小鼠(J05571)和人(BC018359)的SAMS基因,分别有63.9%、75.4%、58.8%、59.1%和55.7%的同源性。由于一级结构存在明显的差异,将该重组的质粒转入大肠杆菌DH5α并成功地表达了SAMS。通过亲和层析纯化出球形芽胞杆菌的SAMS,SDS-PAGE分析显示蛋白分子量为43kD。HPLC对SAMS的活性分析表明,该酶可催化ATP和蛋氨酸形成S-腺苷甲硫氨酸(SAM)。     

苏云金芽胞杆菌CryⅠ基因RNA探针载体的构建

将办云金芽胞杆菌杀虫晶体蛋白ＣｒｙⅠＡ基因的高保守区ＥｃｏＲＩ－Ｆ片段重组到ｐＳＥ－ＬＥＣＴ－１载体的ＥｃｏＲＩ位点，构建出能够高效转录ＲＮＡ的探针载体ｐＳＢＰＬ－１。该载体在Ｔ７ＲＮＡ聚合酶作用了，通过ＤＩＧ体外标记转录制备的ＲＮＡ探针，具有灵敏度高，背景清楚，省时等优点，为苏云金芽胞杆菌分子生物学研究，及对鳞翅目有特异毒性高效菌株的筛选提供了一种方便而有效的方法。     

纤维素降解菌Gibberella fujikuroi产酶条件的优化

以稻秆作为唯一碳源,研究了氮源、接种量、培养时间、培养温度、培养基初始pH等对丝状真菌菌株Gibberella fujikuroi产纤维素酶的影响.结果表明:该丝状真菌菌株产纤维素酶的最适氮源为CO(NH2)2,接种量为5%,培养时间为120h,培养温度为28～37℃,培养基初始pH为5～6.在最适宜的条件下,培养液中内切葡聚糖酶活力、天然纤维素酶活力和滤纸酶活力分别可达到1.723IU/mL、0.368IU/mL和0.344IU/mL.     

新型Resilin-R5融合蛋白的大肠杆菌表达和纯化

为了获得兼具"高弹性"和"硅沉积"性能的新型功能生物材料,将具有高弹性的Resilin蛋白与具有硅沉积作用的R5肽进行了融合,研究其在大肠杆菌中的表达,建立了简易的纯化方法。首先,将果蝇弹性蛋白基因CG15920序列与硅藻R5肽基因序列进行拼接,经过稀有密码子优化后合成重组基因resilin-r5。然后将其插入原核表达载体pET28a,转化大肠杆菌BL21(DE3)pLysS获得表达菌株,并通过IPTG进行诱导表达。最后以盐析加热法和Ni离子柱亲和层析法纯化带组氨酸标签的重组融合蛋白。最终实现Resilin-R5融合蛋白的高效表达,产量达到120 mg·L-1发酵液,为"高弹性-硅沉积"融合蛋白Resilin-R5的性能表征和创新应用奠定了基础。     

利用苏云金芽胞杆菌非芽胞特异性的启动子表达cry1Ac10和cry1C基因

利用重叠延伸ＰＣＲ技术,将苏云金芽胞特异性的ｃｒｙ３Ａ基因的启动子替换ｃｒｙ１Ａｃ１０和ｃｒｙ１Ｃ基因的启动子序列,并用ｃｒｙ１Ａｃ１０基因的终止序列,替换ｃｒｙ１Ｃ基因终止密友子下淳的序列,得到改造的ｃｒｙ１Ａｃ１０和ｃｒｙ１Ｃ基因,改免与其内源杀虫晶体蛋白基因竞争转录因子（σ因子）从而提高杀虫晶体蛋白的表达量,为构建高效杀虫工程菌提供了有效的基因。     

草甘膦N-乙酰转移酶反应动力学研究

草甘膦N-乙酰转移酶(glyphosate N-acetytransferase,GAT)是一种能够通过转乙酰基的反应将草甘膦代谢为低毒物质乙酰草甘膦的酶,在抗除草剂转基因作物中具有潜在的应用价值。通过将地衣芽孢杆菌Ba-cillus licheniformis(Weigmann)Chester AB 94036中的草甘膦N-乙酰转移酶(glyphosate N-acetyltransferase,GAT)基因克隆到大肠杆菌中,获得含有重组质粒pGEX 6p-1-gat的重组菌株。对重组菌株进行诱导表达,经过GST亲和层析纯化,获得约17 ku的目的蛋白。通过酶标仪和连续分光光度分析法,对GAT蛋白进行了酶反应动力学测定。研究表明GAT的催化常数kcat为6.420 min-1,米氏常数KM为1.162 mmol/L,由此得出其催化效率kcat/KM为5.52 L/(mmol.min)。