牛磺熊脱氧胆酸对黄牛体外受精早期胚胎发育的影响

旨在研究牛磺熊脱氧胆酸(Tauro ursodeoxychollc acid,TUDCA)对黄牛体外受精(IVF)早期胚胎发育的影响。采用RT-PCR法检测黄牛IVF胚胎早期发育各时期XBP-1mRNA剪接激活情况,随后分别用添加不同浓度(0、100、250、500、1 000μmol·L-1)TUDCA的培养液培养胚胎,分别统计胚胎分裂率、囊胚率、囊胚细胞总数及囊胚细胞凋亡率,采用qRT-PCR法分析囊胚内质网应激相关基因Grp78、Chop、Bax、Bcl-2的表达情况。结果表明,在胚胎的4-细胞、桑椹胚、囊胚检测到XBP-1mRNA明显剪接;IVF胚胎经不同浓度TUDCA培养后各组间的胚胎分裂率差异不显著(P0.05),但500μmol·L-1 TUDCA组提高了胚胎的囊胚发育率及囊胚细胞数(P0.05),并降低了囊胚细胞凋亡率(P0.05);qRT-PCR检测表明,500μmol·L-1 TUDCA处理组下调了囊胚Chop基因的表达,且上调了Bcl-2基因的表达(P0.05),而Grp78与Bax表达与对照组相比差异不显著(P0.05)。综上表明:早期胚胎体外发育过程中,存在内质网应激反应;胚胎培养液中添加500μmol·L-1 TUDCA,可以降低内质网应激反应,有利于促进黄牛胚胎发育。     

表皮生长因子和胎牛血清对猪体细胞克隆胚胎发育的影响

为了研究胚胎培养液中添加表皮生长因子(EGF)和胎牛血清(FBS)对猪体细胞克隆胚胎发育的影响,试验将卵母细胞成熟培养42h后构建克隆胚,进行电融合激活,再使用6-DMAP(2mmol/L)进行化学辅助激活,然后移入NCSU-23培养基培养,激活后第2天添加0,10,20,30ng/mLEGF,7d后检查囊胚率、囊胚细胞数;激活后第0,2,4,6天添加10%FBS,7d后检查囊胚率、囊胚细胞数。结果表明:2～4细胞阶段添加EGF,添加20ng/mLEGF组的囊胚率显著高于对照组(P0.05)及其他处理,而囊胚细胞数与对照组无显著差异(P0.05);在第4天添加FBS组的囊胚率显著高于对照组(P0.05)和其他处理组,而囊胚细胞数与对照组无显著差异(P0.05)。结果说明添加20ng/mL的EGF能促进猪体细胞克隆胚胎的发育率,在第4天添加FBS更有利于胚胎的发育。     

虾青素对小鼠早期胚胎发育及相关基因表达的影响

试验旨在研究培养液中添加虾青素(AX)对小鼠胚胎体外发育和相关基因表达的影响。试验选用23～25 g的ICR系雌性小鼠,利用超数排卵,取卵母细胞进行体外受精,受精1 h后将受精卵随机分组、分别移入浓度为0、5、10、25、50μmol/L的虾青素培养液中进行体外发育培养,在培养24和96 h后分别观察并统计各组的卵裂率和囊胚率;体外培养至96 h后,对囊胚进行细胞计数,统计囊胚细胞数差异;提取各组囊胚总RNA,利用实时荧光定量PCR技术对各组胚胎的TGF-β和Bcl-2基因的相对表达量进行检测。结果显示,添加10μmol/L虾青素能够改善小鼠胚胎体外发育环境且显著提高胚胎卵裂率和囊胚率(P0.05);显著提高囊胚的细胞数(P0.05);极显著提高TGF-β基因表达量(P0.01)。结果表明,添加10μmol/L虾青素有利于小鼠胚胎体外发育,可用于改善小鼠胚胎体外发育环境;TGF-β和Bcl-2基因很可能参与了胚胎发育过程中的相关调控。     

虾青素对小鼠早期胚胎发育及相关基因表达的影响

试验旨在研究培养液中添加虾青素（AX）对小鼠胚胎体外发育和相关基因表达的影响。试验选用23~25 g的ICR系雌性小鼠,利用超数排卵,取卵母细胞进行体外受精,受精1 h后将受精卵随机分组、分别移入浓度为0、5、10、25、50 μmol/L的虾青素培养液中进行体外发育培养,在培养24和96 h后分别观察并统计各组的卵裂率和囊胚率;体外培养至96 h后,对囊胚进行细胞计数,统计囊胚细胞数差异;提取各组囊胚总RNA,利用实时荧光定量PCR技术对各组胚胎的TGF-β和Bcl-2基因的相对表达量进行检测。结果显示,添加10 μmol/L虾青素能够改善小鼠胚胎体外发育环境且显著提高胚胎卵裂率和囊胚率（P<0.05）;显著提高囊胚的细胞数（P<0.05）;极显著提高TGF-β基因表达量（P<0.01）。结果表明,添加10 μmol/L虾青素有利于小鼠胚胎体外发育,可用于改善小鼠胚胎体外发育环境;TGF-β和Bcl-2基因很可能参与了胚胎发育过程中的相关调控。     

细胞松弛素B对猪孤雌胚胎和体外克隆胚胎发育能力的影响

为探讨细胞松弛素B(cytochalasin B,CB)对猪孤雌胚胎和克隆胚胎发育能力的影响,本研究通过在猪体外胚胎培养基中添加不同浓度CB以及不同孵育时间的处理,筛选出CB对猪早期胚胎发育的最适浓度和最佳孵育时间,同时通过Hoechst33342染色检测猪体外囊胚孵化期的细胞数差异,进一步研究CB对孤雌胚胎和克隆胚胎发育的影响。结果显示,培养基中添加CB浓度为7.5μg/mL时孤雌胚胎和克隆胚胎的卵裂率分别为85.00%和90.23%,囊胚率为35.68%和42.58%,均显著高于其他各组(P0.05);采用7.5μg/mL CB处理电激活后的孤雌胚胎和克隆胚胎,孤雌胚胎孵育4 h组的卵裂率(83.80%)和囊胚率最高(35.39%),与其他各组差异显著(P0.05),而克隆胚胎孵育6 h组的卵裂率(83.98%)和囊胚率最高(55.62%),与其他各组差异显著(P0.05)。此外,Hoechst33342染色结果显示,未添加CB处理的孤雌胚胎在囊胚孵化期的细胞平均数为28个,CB处理组的孤雌胚胎和克隆胚胎细胞平均数分别为36和52个,处理组和未处理组细胞数差异显著(P0.05)。结果表明,猪体外孤雌胚胎用7.5μg/mL CB处理4 h可获得较高的卵裂率和囊胚率;体外克隆胚胎用7.5μg/mL CB处理6 h卵裂率及囊胚率最高,且囊胚期内细胞团细胞总数最多。CB处理有利于体外胚胎早期发育,提高克隆胚胎移植受孕率。     

小鼠四倍体囊胚凋亡及凋亡基因的表达

为了更全面的对四倍体胚胎的发育能力进行评估,本研究利用原位末端标记(TUNEL)法检测了电融合生产的小鼠四倍体囊胚细胞凋亡情况,同时用实时定量PCR方法检测了促凋亡基因Bax和抑凋亡基因Bcl-2在四倍体囊胚中的表达。结果显示:四倍体与体外二倍体胚胎发育到囊胚的比率没有显著差别(P0.05);四倍体囊胚无论是内细胞团细胞数、滋养层细胞数还是内细胞团/总细胞数比率都显著低于体内与体外二倍体囊胚(P0.05);四倍体囊胚细胞凋亡指数显著高于体内与体外二倍体囊胚细胞凋亡指数(P0.05);促凋亡基因Bax在四倍体囊胚中的表达显著高于体内与体外二倍体囊胚中的表达(P0.05),而抑凋亡基因Bcl-2在四倍体囊胚中的表达同体内与体外二倍体囊胚中的表达没有显著差异(P0.05)。因此,四倍体囊胚质量比体内与体外二倍体囊胚质量都差,这可能是四倍体胚胎不能发育到足月的原因之一。     

Scriptaid对猪移植体细胞核在胚胎外发育的影响

组蛋白去乙酰化酶(histone deacetylases,HDACs)是调控基因的关键蛋白酶,乙酰化是一种可逆的蛋白共价修饰。组蛋白去乙酰化酶可以改变特定基因的转录和表达水平,诱导细胞的分化和凋亡。为了检测一种低毒新型的组蛋白去乙酰化酶抑制剂Scriptaid对克隆猪胚胎发育的影响,进行了不同浓度和不同时间的处理,并在体外检测了胚胎分裂率和囊胚发育能力。研究以对照试验作为基础,以凌源禾丰种猪场长白猪胎儿成纤维作为供体细胞,然后通过体细胞核移植(SCNT)技术获得体外发育胚胎。将重构胚胎以不同浓度(0、200、500、700、900 nmol/L)Scriptaid处理后,并进行不同时间(0、15、36、72 h)的培养,然后通过观察不同处理浓度和处理时间下胚胎在2细胞阶段分裂率和囊胚发育率。再通过Real-time PCR检测2细胞阶段未处理组与Scriptaid处理组的Oct4、Sox2两个因子的相对表达变化。通过统计学分析发现,与未处理组相比,500 nmol/L Scriptaid处理15 h囊胚发育率显著增加(P0.05),但2细胞阶段分裂率基本不变,而未处理组克隆胚胎在囊胚期Oct4基因表达的倍数明显低于经过Scriptaid处理的克隆胚胎在囊胚期的表达倍数(P0.05),这说明经过500 nmol/L Scriptaid处理后,克隆胚胎的Oct4表达量明显提高。未经过处理的克隆胚胎在囊胚期Sox2基因的表达倍数和经过Scriptaid处理的克隆胚胎在囊胚期Sox2基因的表达倍数有差异但是差异不明显,这说明经过500 nmol/L Scriptaid处理之后,基因Sox2表达虽然有提高,但总体来说和未处理的胚胎相比差异不大(P0.05)。     

PGI_2对缺少内源性PGs的绵羊早期胚胎体外发育的影响

试验旨在探讨添加外源Iloprost(PGI2的稳定类似物)对缺少内源性前列腺素(PGs)的绵羊早期胚胎体外发育的影响。常规体外受精,通过在体外培养液中单独或联合添加前列腺素合成限速酶COX-1和COX-2的特异性抑制剂SC560和NS398,观察COX-1和COX-2对绵羊早期受精胚胎体外发育的影响。添加抑制剂NS398后,再协同添加不同浓度Iloprost,观察PGI2对绵羊早期体外胚胎发育的具体作用,并对孵化囊胚的细胞数进行分析。结果显示,在卵裂率和囊胚率方面,单独添加NS398与同时添加SC560和NS398组间差异不显著(P0.05),而与对照组间差异显著(P0.05)。添加NS398后,再添加不同浓度的外源性Iloprost可代替胚胎内源性PGI2的作用,基本消除COX-2抑制剂对绵羊早期胚胎体外发育的不利影响。Iloprost的浓度以1×10-6 mol/L为宜,H33342染色结果差异不显著(P0.05)。本试验结果表明,胚胎内源性COX-2对绵羊早期胚胎中PGI2的合成起主要调控作用。外源添加Iloprost可补偿胚胎内源性PGI2的缺失作用,解除NS398对COX-2的特异性抑制作用,最终促进绵羊早期胚胎的体外发育。     

冷、热应激对猪孤雌胚胎体外发育的影响

为研究持续不同时间的冷、热应激对猪孤雌胚胎体外发育的影响,本研究以猪孤雌胚胎为材料,采用免疫荧光染色、实时荧光定量PCR技术检测不同时间的冷(31℃)、热应激(41℃)处理对猪孤雌胚胎发育后囊胚发育率、细胞数、细胞凋亡率、自噬相关基因及细胞凋亡相关基因mRNA转录水平的影响。结果显示,热应激12h后囊胚发育率显著低于对照组(P0.05),冷应激18h后囊胚发育率显著低于对照组(P0.05),而冷应激组囊胚发育率高于热应激组。热应激12h和冷应激18h后均导致囊胚内细胞数显著低于对照组(P0.05),细胞凋亡率显著高于对照组(P0.05),且冷应激组的细胞凋亡率低于热应激组。冷、热应激组自噬相关蛋白LC3的表达均高于对照组;冷、热应激中自噬相关基因Atg6和Atg8的表达均极显著高于对照组(P0.01),Lamp2基因的表达均显著高于对照组(P0.05),热应激组中的Atg6和Atg8基因的表达高于冷应激组。通过检测细胞凋亡相关基因mRNA的转录水平发现,冷、热应激组中细胞凋亡相关基因Bak、Casp-3、Fas的表达均极显著高于对照组(P0.01),Bcl-xl基因的表达均显著低于对照组(P0.05)。综上,猪孤雌胚胎对冷应激(31℃)的耐受性比对热应激(41℃)强,且热应激可诱导体外培养的猪孤雌胚胎自噬及凋亡相关基因的表达,从而降低孤雌胚胎发育的能力。     

活性氧(ROS)对小鼠早期胚胎胚细胞分裂的影响

在体外CZB培养的不同时期添加过氧化氢(2.1μmol/L),发育至囊胚阶段,制作胚胎标本,观察其囊胚发育率、胚细胞数和分裂相数。结果显示:0~12 h组和0~72 h组的胚胎发育率显著低于其他几组(P<0.05),对照组、12~24 h组、24~36 h组、36~48 h组之间均差异不显著(P>0.05);各组之间的胚细胞数和分裂指数均无显著差异。说明胚胎在体外培养时,2细胞期胚胎对外源性H2O2最敏感,也最容易发生发育阻滞。但是经H2O2处理之后,度过2细胞期发育阻滞的胚胎能在以后的发育中发生补偿性生长,其胚细胞数和分裂指数都和体外正常发育的胚胎没有差异。     

Effects of cumulus cells on in vitro maturation of oocytes and development of cloned embryos in the pig

The purpose of this study was to investigate the role of porcine cumulus cells (CC) in oocyte maturation and somatic cell nuclear transfer (SCNT) embryo development in vitro. Denuded pig oocytes were co-cultured with CC or routinely cultured in maturation medium without a feeder layer. Porcine CC inactivated with mitomycin C or non-inactivated were used for the feeder layer in co-culture with porcine SCNT embryos to investigate comparatively the developmental competence of cloned embryos. The DNA damage aspects of apoptosis and expression pattern of genes implicated in apoptosis (Fas/FasL) as well as the mRNA expression of DNA methyltransferase (Dnmt1, Dnmt3a) of porcine SCNT embryos were also evaluated by comet assay or real-time RT-PCR, respectively. The results showed that co-culture with CC improved the extrusion rate of pbI (49.3% vs 31.5%, p<0.05) and survival rate (75.7% vs 53.3%, p<0.05) of denuded oocytes, but had no effects on blastocyst developmental rate or 2-cell-stage survival rate of in vitro fertilization embryos. Co-culture with CC inactivated by mitomycin C improved the blastocyst developmental rate (26.6% vs 13.0%, p<0.05) and decreased the apoptotic incidence (27.6% vs 46.2%, p<0.05) of porcine cloned embryos. Co-culture with inactivated CC reduced Fas and FasL mRNA expression of cloned embryos at the blastocyst stage compared with NT controls (p<0.05), but there were no differences in Dnmt1 and Dnmt3a mRNA expression among groups. Co-culture with inactivated cumulus cell monolayer significantly increased blastocyst formation and decreased the apoptotic incidence in porcine cloned embryos during in vitro development.     

冷、热应激对猪孤雌胚胎体外发育的影响

为研究持续不同时间的冷、热应激对猪孤雌胚胎体外发育的影响,本研究以猪孤雌胚胎为材料,采用免疫荧光染色、实时荧光定量PCR技术检测不同时间的冷（31℃）、热应激（41℃）处理对猪孤雌胚胎发育后囊胚发育率、细胞数、细胞凋亡率、自噬相关基因及细胞凋亡相关基因mRNA转录水平的影响。结果显示,热应激12 h后囊胚发育率显著低于对照组（P<0.05）,冷应激18 h后囊胚发育率显著低于对照组（P<0.05）,而冷应激组囊胚发育率高于热应激组。热应激12 h和冷应激18 h后均导致囊胚内细胞数显著低于对照组（P<0.05）,细胞凋亡率显著高于对照组（P<0.05）,且冷应激组的细胞凋亡率低于热应激组。冷、热应激组自噬相关蛋白LC3的表达均高于对照组;冷、热应激中自噬相关基因Atg6和Atg8的表达均极显著高于对照组（P<0.01）,Lamp2基因的表达均显著高于对照组（P<0.05）,热应激组中的Atg6和Atg8基因的表达高于冷应激组。通过检测细胞凋亡相关基因mRNA的转录水平发现,冷、热应激组中细胞凋亡相关基因Bak、Casp-3、Fas的表达均极显著高于对照组（P<0.01）,Bcl-xl基因的表达均显著低于对照组（P<0.05）。综上,猪孤雌胚胎对冷应激（31℃）的耐受性比对热应激（41℃）强,且热应激可诱导体外培养的猪孤雌胚胎自噬及凋亡相关基因的表达,从而降低孤雌胚胎发育的能力。     

奶牛活体采卵-体外受精效率的影响因素研究

为建立稳定高效的活体采卵-体外受精技术体系,提高体外胚胎生产效率,本研究先利用屠宰场采集的新鲜卵巢卵母细胞进行体外受精,通过胚胎发育潜力来筛选最佳的体外胚胎培养液;再进一步研究不同种公牛精液和供卵母牛对活体采卵-体外受精效率的影响。结果显示,CR1aa培养液和mCR1aa培养液卵裂率差异不显著（P>0.05）,但mCR1aa组的囊胚发育率显著提高（28.1% vs 20.6%,P<0.05）;选取的3头荷斯坦种公牛精液的活体采卵-体外受精胚胎的卵裂率差异不显著（P>0.05）,但1号种公牛精液体外受精后囊胚率（38.7%）显著高于2号和3号（23.8%&22.9%）（P<0.05）;随机选择的3头活体采卵供体母牛（H1、H2、H3）获得的头均可用卵母细胞数无显著差异,但H1和H2供体母牛体外受精胚胎的卵裂率和囊胚率均显著高于H3供体牛（P<0.05）,且H1供体牛体外受精囊胚率显著高于H2供体牛（P<0.05）。结果表明,mCR1aa培养液能显著提高体外受精囊胚发育率,适用于体外胚胎生产;种公牛精液和供体母牛个体差异会直接影响活体采卵-体外受精胚胎的生产效率,为奶牛活体采卵-体外受精生产技术体系的优化提供参考。     

猪植入前胚胎体外培养条件的优化

探讨了更换胚胎培养液及添加FBS、高渗透压和不同浓度VE对猪卵母细胞体外受精(IVF)和孤雌激活(PA)胚胎体外发育的影响,进一步优化了猪植入前胚胎体外培养体系。试验一：在第2天、第4天更换新的培养液(换液组),在换液基础上第4天更换为添加10%FBS的培养液(FBS组)。试验二：胚胎分别在0.05 mol/L蔗糖(蔗糖组)和138 mmol/L氯化钠(氯化钠组)的PZM-3(300～320 mOsmol)中培养2 d后移至PZM-3(288 mOsmol)中培养5 d。试验三：在培养液中分别添加50、100和200 μmol/L VE。对照组均在PZM-3(288 mOsmol)中培养7 d。结果表明：试验一,IVF和PA胚胎FBS组囊胚率显著高于对照组和换液组(P<0.05);试验二,IVF胚胎氯化钠组卵裂率、囊胚率均显著高于对照组与蔗糖组(P<0.05);试验三,IVF胚胎添加100 μmol/L VE组囊胚率显著高于对照组(P<0.05)。结果提示,在换液的基础上添加FBS有利于猪IVF和PA胚胎的体外发育;氯化钠调节的高渗透压可以促进猪IVF胚胎的早期发育;添加100 μmol/L VE可以改善猪IVF胚胎的体外发育体系。     

Effects of ghrelin on in vitro development of porcine in vitro fertilized and parthenogenetic embryos

The objective of the present study was to investigate the effect of addition of ghrelin to in vitro culture medium on preimplantation development of porcine in vitro fertilized and parthenogenetic embryos. In Experiment 1, we sought to compare the in vitro developmental competence of IVF and parthenogenetic embryos. No significant (P<0.05) differences were detected for cleavage rate or blastocyst rate between the in vitro fertilization (IVF)- and parthenogenetic activation-derived embryos. In Experiment 2, parthenogenetic embryos were cultured in Porcine Zygote Medium-3 containing various concentrations of ghrelin. The blastocyst rate was remarkably (P<0.05) increased when 5 ng/ml (PA-5) and 500 ng/ml (PA-500) of ghrelin was added to in vitro culture medium compared with the other groups. Total cell number per blastocyst was slightly promoted in the ghrelin treatment groups compared with the controls. However, the ratio of inner cell mass (ICM) cell number/total cell number was significantly reduced in the PA-50 group compared with the controls (P<0.05). In Experiment 3, we cultured in vitro fertilized embryos in Porcine Zygote Medium-3 supplemented with ghrelin at different dosages. The rate of blastocyst formation was markedly (P<0.05) elevated when 500 ng/ml ghrelin was added to culture medium (IVF-500) compared with the controls. Increased total cell numbers (P<0.05) were observed when in vitro fertilized embryos were cultured in IVF-50 and IVF-500 compared with the controls. However, the ratio of ICM cell number/total cell number was decreased in the ghrelin treatment groups compared with the controls (P<0.05). Taken together, the results suggest that ghrelin can enhance blastocyst formation of porcine in vitro fertilized and parthenogenetic embryos while exerting a negative effect on the structural integrity of the blastocysts.     

ICSI受精卵胞质注射生产转基因猪胚胎的初步研究

试验旨在探讨单精子胞浆内注射（intracytoplasmic sperm injection,ICSI）法生产猪体外受精卵和应用猪ICSI受精卵进行胞质注射生产转基因胚胎的可行性。首先对比了猪体外受精（in vitro fertilization,IVF）受精卵与ICSI受精卵的胚胎发育效率;然后观察了猪ICSI受精卵的双原核形成时间及效率,对精子注射到胞质后6~18 h分6个时间段进行地衣红染色,对比精子进入卵胞质后的状态及原核形成;最后对猪IVF受精卵受精后8~10 h及ICSI受精卵受精后12~14 h进行EGFP-N1质粒（20 ng/μL）胞质注射,观察胚胎发育效率及转基因效率。结果表明,ICSI受精卵的胚胎发育率（卵裂率89.4%和67.9%、囊胚率36.5%和16.1%）显著优于IVF组（P<0.05）,适合用于猪的体外受精卵试验;猪ICSI受精卵双原核在精子注射到卵胞质后12~14 h形成,双原核形成率为54.90%,显著高于其余5个试验组（P<0.05）;ICSI受精卵胞质注射组胚胎卵裂率（86.2%和66.3%）、囊胚率（30.0%和13.6%）及转基因效率（18.5%和0）均显著高于IVF受精卵胞质注射试验组（P<0.05）。本试验结果为采用ICSI受精卵进行胞质注射生产转基因猪的研究奠定了基础。     

猪孤雌激活早期胚胎线粒体分布及mtDNA拷贝数变化的研究

本研究通过线粒体分子探针标记技术检测孤雌激活早期胚胎线粒体的分布变化,运用实时荧光定量PCR技术检测mtDNA拷贝数的变化,揭示早期胚胎发育过程中线粒体分布、mtDNA拷贝数变化趋势。结果表明,成熟卵母细胞电激活后,由2-细胞胚胎开始,卵裂球内线粒体分布均匀且密集,每个细胞均有分布,卵裂球之外的空隙未见线粒体分布,直到囊胚形成,线粒体均有分布。孤雌激活4-细胞胚胎mtDNA拷贝数显著高于8-细胞胚胎mtDNA拷贝数(907210.77±145520.77,186224.33±103308.00,P<0.05),但显著低于2-细胞胚胎、桑椹胚、囊胚的mtDNA拷贝数(1563422.54±224666.51、1697626.25±176999.53和1752301.29±101146.64,P<0.05)。孤雌激活扩张囊胚mtDNA拷贝数最高,为2812545.67±156819.31,显著高于其他发育时期胚胎的mtDNA拷贝数(P<0.05)。由此可见,孤雌激活早期胚胎发育进程中线粒体分布及mtDNA拷贝数会发生变化。     

甲基-β-环化糊精对猪体外受精及早期胚胎发育的影响

为了优化猪体外受精技术体系,本试验探索了甲基-β-环化糊精(methyl-beta-cyclic dextrin,MBCD)对猪体外受精以及早期胚胎发育的影响。在体外受精0和4 h向受精液(modified Tris-buffered medium,mTBM)中添加不同浓度(0,0.5,1,2,5,10,15,20μmol/mL)的MBCD,受精孵育结束后转至PZM-3培养液中进行胚胎培养。对各处理组卵母细胞的受精情况以及胚胎发育能力进行了系统的检测,并用金霉素(chlortetracycline,CTC)染色法评估了MBCD处理后精子获能状态。结果显示:1)体外受精0 h添加5μmol/mL MBCD组的卵裂率、囊胚率、囊胚细胞数显著高于(P<0.05)对照组和除10μmol/mL MBCD组之外的其他试验组。2)体外受精0 h添加5和10μmol/mL MBCD组、单精入卵率显著高于(P<0.05)对照组和其他试验组,而多精入卵率显著低于(P<0.05)对照组和其他试验组。3)添加5μmol/mL MBCD组,0～1 h,F型精子迅速减少(78.56～19.43),B型精子迅速增加(10.79～69.86);1～4 h,F型精子和B型精子基本保持不变(B型:69.86～78.78,F型:19.43～9.11)。上述结果表明在体外受精0 h向mTBM中加入5μmol/mL MBCD可以显著提高获能精子比例,减少多精受精发生,提高早期胚胎发育潜能。     

单宁酸对猪卵母细胞体外成熟及胚胎发育能力的影响

研究旨在探讨单宁酸对猪卵母细胞体外成熟质量及其胚胎发育能力的影响。在猪卵丘卵母细胞复合体（COCs）体外成熟培养液中添加不同浓度（0、1、10、100 μg/mL）单宁酸培养42 h后,检测COCs的扩散程度和卵丘细胞扩散指数,统计COCs的体外成熟率,检测成熟卵母细胞内谷胱甘肽（glutathione,GSH）、活性氧（reactive oxygen species,ROS）和生长分化因子9（growth differentiation factor 9,GDF9）的水平,并统计孤雌激活及体外受精胚胎48和168 h的卵裂率、囊胚率及囊胚总细胞数。结果显示,与对照组相比,10 μg/mL单宁酸组卵丘细胞扩散指数显著提高（P<0.05）,100 μg/mL单宁酸组显著降低（P<0.05）;1和10 μg/mL单宁酸组卵母细胞成熟率差异不显著（P>0.05）,100 μg/mL单宁酸组卵母细胞成熟率显著降低（P<0.05）;1和10 μg/mL单宁酸组GSH和GDF9水平显著提高（P<0.05）,ROS水平显著降低（P<0.05）。孤雌胚胎和体外受精胚胎发育能力结果显示,与对照组相比,各单宁酸组卵裂率差异不显著（P>0.05）,10 μg/mL单宁酸组孤雌胚胎囊胚率及体外受精胚胎囊胚率显著提高（P<0.05）,100 μg/mL单宁酸组孤雌胚胎囊胚细胞数及体外受精胚胎囊胚细胞数均显著低于其他各组（P<0.05）。以上结果表明,10 μg/mL单宁酸可通过提高卵丘细胞扩散能力及GSH和GDF9水平、降低卵母细胞内ROS水平,改善猪卵母细胞成熟质量,提高孤雌胚胎及体外受精胚胎的发育能力。     

Effect of Oocytes in vivo and in vitro on the Developmental Potential of Porcine Somatic Cell Cloned Embryos

To investigate the impact of porcine oocytes in vivo and in vitro maturation (IVM) on the development of porcine somatic cell cloned embryos,the somatic cell cloned embryos cultured in vitro and the sows were treated with hormones to collect mature oocytes in vivo,and the cleavage rate, blastocyst rate and embryo implantation were compared. The results showed that the average number of ovulation in PGC+PMSG+HCG group was significantly higher than that of PGC+HCG,PMSG+HCG and the natural estrus groups (P<0.05). The oocytes collected in vivo could be used for the construction, and the available oocytes rate reached more than 90%,and there was no significant difference among the four groups (P>0.05),which indicated that groups treated by hormone could obtain more available oocytes and the quality of oocytes was not significant different. In vivo and in vitro matured oocytes were used as nuclear transfer embryos of recombinant receptor,the fusion efficiency (80.31% and 79.29%) and cleavage rate (90.40% and 86.51%) were not significant different (P>0.05), but the proportion of in vivo matured oocytes cloned embryos developed into the blastocyst stage was significantly higher (P<0.05). The reconstructed embryos made from in vivo and in vitro matured oocytes were transplanted into surrogate sows (transferred 30 or 60 embryos),10 piglets were born in in vivo maturation of cloned embryo transfer group,while there was no implantation in in vitro maturation of cloned embryo transfer group. The results showed that high quality oocytes obtained by superovulation could significantly increase the blastocyst rate of embryos,reduce the number of embryos transferred and improve the pregnancy rate of surrogate sows.