家蚕抗核型多角体病毒基因与蛋白的研究进展

追踪研究蚕体内的抗家蚕核型多角体病毒（Bombyxmori nuclearpolyhedrosis virus,BmNPV）基因与蛋白,了解家蚕抗BmNPV的机制,对减轻甚至解除血液型脓病、促进桑蚕产业发展具有重要意义。文章就家蚕抗BmNPV基因和蛋白的研究进展进行综述,提出今后对家蚕抗BmNPV的研究策略应是运用多种技术同时从DNA、RNA、蛋白质水平上进行研究,鉴定家蚕抗BmNPV基因或蛋白及其与抗BmNPV的相关性;再采用RNA干涉、转基因技术对家蚕进行基因操作,改变其对BmNPV的抵抗能力,确认这些基因、蛋白的抗病毒功能。另外,使用免疫组化、免疫共沉淀,ELISA等技术探索基因一蛋白、蛋白一蛋白间的相互作用,找到基因或蛋白的上、下游作用因子,解释清楚家蚕抗BmNPV的详细机制,为最终解除家蚕脓病危害、促进蚕业发展提供参考资料。     

家蚕IAP互作蛋白的筛选、鉴定及其对BmNPV增殖的影响

目的 细胞凋亡作为昆虫免疫应答的重要组成部分,在病毒与宿主相互作用的过程中扮演着重要角色,以细胞凋亡相关基因为研究对象对阐明其在病毒感染过程中的作用具有重要的参考价值。本研究旨在筛选家蚕凋亡抑制蛋白（Bombyx mori inhibitor of apoptosis protein,BmIAP）的相互作用蛋白,并验证其在家蚕核型多角体病毒（Bombyx mori nucleopolyhedrovirus, BmNPV）侵染过程中与Bmiap的相互调控关系及在BmNPV增殖过程中的作用,为探明宿主与BmNPV相互作用的分子机制提供理论依据。方法 利用免疫共沉淀技术筛选在BmNPV侵染家蚕细胞过程中与BmIAP相互作用的蛋白,对获得的特异性差异条带进行LC-MS/MS蛋白质谱分析,根据蛋白分子量大小并利用生物信息学方法对获得的蛋白进行鉴定,确定候选基因;通过分子克隆技术对候选基因进行克隆,利用SMART在线工具及BioEdit分别对候选基因的结构域进行预测及多序列比对分析;通过免疫荧光试验验证BmIAP和候选蛋白的细胞共定位情况,并进一步利用免疫共沉淀验证它们的相互作用;分别通过真核表达和基于CRISPR/Cas9的基因编辑系统对候选基因进行过表达和敲除,利用qRT-PCR技术检测相应基因的表达情况,以确定Bmiap和Bmpp5在BmNPV侵染过程中的调控关系;同样,在过表达和敲除Bmpp5后检测杆状病毒Vp39的表达量,以确定Bmpp5对BmNPV增殖的影响。结果 通过免疫共沉淀获得7个可能与BmIAP相互作用的宿主蛋白和1个BmNPV蛋白,进一步分析确定1个与凋亡相关的候选基因Bmpp5;Bmpp5的开放阅读框为1 473 bp,编码490个氨基酸,预测的蛋白分子量约为56 kD,含3个TRP结构域和1个PP2Ac结构域,在昆虫间具有较高的保守性;免疫荧光检测证明BmIAP和BmPP5共定位于细胞质中,免疫共沉淀结果表明两者可以相互作用;在BmNPV侵染过程中,过表达Bmiap后,Bmpp5的表达量显著上调,而敲除Bmiap后,Bmpp5的表达量显著下调,表明Bmiap能够促进Bmpp5的表达;同时,过表达Bmpp5后,Bmiap显著上调表达,而敲除Bmpp5后,Bmiap显著下调表达,表明Bmpp5同样能够促进Bmiap的表达;过表达Bmpp5能够促进BmNPV的增殖,敲除Bmpp5能够抑制BmNPV的增殖,表明Bmpp5的表达利于BmNPV的增殖。结论 鉴定了1个能够与BmIAP相互作用的蛋白BmPP5,且该蛋白在昆虫中高度保守;在BmNPV侵染过程中,Bmiap和Bmpp5能够相互促进,且Bmpp5能够促进BmNPV的复制增殖。     

家蚕热休克蛋白HSP60相互作用蛋白筛选与鉴定

【目的】 HSP60是热休克蛋白中重要的一员,在昆虫先天性免疫过程中起重要作用,同时也是昆虫生长发育的必要因子。前期研究证明家蚕BmHSP60参与家蚕核型多角体病毒（Bombyx mori nucleopolyhedrovirus,BmNPV）入侵细胞过程,本研究通过鉴定BmHSP60相互作用蛋白,为其在家蚕先天性免疫中作用机制研究打下基础。【方法】 利用免疫共沉淀和银联-质谱分析技术（LC-MS/MS）,首先构建BmHSP60过表达载体并融合Flag标签,转染到家蚕细胞中48 h后,收集蛋白,进行免疫共沉淀,用Flag抗体孵育磁珠调取相互作用蛋白,银染处理后,能够检测到明显的差异条带,把差异条带切胶保存在-80℃,然后质谱分析差异条带的多肽;根据质谱结果和差异条带的大小与NCBI数据库进行比对,筛选到候选相互作用蛋白。最后,构建候选相互作用蛋白的克隆载体并融合HA标签,分别和BmHSP60表达载体共转到家蚕细胞,免疫共沉淀和荧光共定位验证BmHSP60和候选蛋白之间的相互作用。并通过Mito-Tracker-Green分析BmHSP60候选相互作用蛋白与线粒体的共定位。【结果】 免疫共沉淀银染结果显示BmHSP60相互作用蛋白在110、90、75、60和35 kD附近有5条明显的差异条带,将这5条条带混成蛋白池进行质谱分析,通过银联-质谱分析结果和家蚕基因组数据库以及NCBI数据库进行比对分析共鉴定到32个差异蛋白,根据多肽数量和蛋白分子量的大小共筛选到5个相互作用候选蛋白与银染结果差异条带一致,分别为ADP/ATP translocase(ANT)、Actin、Alpha-tubulin、Elongation factor 1-alpha(EF1α)和HSP90。构建BmHSP60候选相互作用蛋白克隆表达载体并融合HA标签,与BmHSP60共同转染到家蚕细胞,免疫共沉淀immunoprecipitated（IP）用α-Flag抗体孵育,immunoblotting（IB）再用α-Flag抗体孵育,均能够检测到BmHSP60表达。而IB用α-HA抗体孵育显示只有BmANT和BmHSP90能够检测到相应的条带,而Alpha-tubulin和EF1α与BmHSP60没有检测到相应的条带,说明只有BmANT和BmHSP90与BmHSP60具有直接的相互作用,而Alpha-tubulin和EF1α与BmHSP60没有相互作用。通过荧光共定位进一步分析表明BmANT和BmHSP90能够与BmHSP60共定位在细胞质中。线粒体标记物Mito-Tracker-Green共定位结果显示BmHSP60、BmANT和BmHSP90均能够与线粒体共定位到一起。【结论】 鉴定到家蚕热休克蛋白BmHSP60能够与BmANT和BmHSP90相互作用,并共定位于线粒体,可用于研究BmHSP60在家蚕抗病毒免疫中的作用机制。     

姜黄素对过氧化氢诱导的罗非鱼肝细胞热休克蛋白基因表达的影响

【目的】探究热休克蛋白基因在氧化应激和姜黄素作用下的表达差异，了解姜黄素药效的发挥与热休克蛋白基因表达变化的关系，进一步探讨热休克蛋白对氧化应激条件下鱼类肝细胞中的功能，为鱼类氧化应激的毒理学机制及姜黄素的药理学机制提供理论资料。【方法】对24 h姜黄素预处理(保护组)与无姜黄素预处理(对照组)的罗非鱼肝细胞分别进行0、1、2.5 h的H₂O₂应激，并对肝细胞5种高分子热休克蛋白基因(HSP70、HSP90α、HSP90β、HSP60、HSP75)和5种小分子热休克蛋白基因(HSP30、HSPB1、 HSPB7、HSPB8、HSPB11)的表达水平进行qPCR检测。【结果】与不经H₂O₂处理(0 h)相比，H₂O₂作用1 h能显著提升HSPB1表达量，降低HSP30表达量；H₂O₂作用2.5 h能显著提升HSP90a、 HSPB1的表达量。姜黄素预处理24 h能显著提升HSP70、 HSP90α、HSP30、HS...     

蚯蚓提取液对家蚕热激蛋白水平及免疫功能的影响

为探讨蚯蚓提取液对家蚕热激蛋白的表达及免疫功能的影响,家蚕5龄幼虫饲喂蚯蚓提取液(50、100和200倍原液稀释)处理的桑叶,饲喂6 d后解剖获取家蚕中肠及血淋巴组织,利用实时荧光定量PCR检测中肠组织中HSP70和HSP90基因的表达;利用ELISA试剂盒检测中肠和血淋巴中HSP70、HSP90、溶菌酶(lysozyme)和抗菌肽(attacin)的水平。结果表明:1/100和1/200稀释组家蚕中肠组织中HSP70基因表达分别是对照组的2.97和1.86倍(P<0.05),1/100稀释组家蚕中肠组织中HSP90基因表达是对照组的2.2倍(P<0.05);1/50稀释组中肠HSP70和血淋巴抗菌肽显著高于对照组(P<0.05);各处理组中肠和血淋巴中HSP90差异不显著(P>0.05)。由此可见,桑叶中添食蚯蚓提取液可促进热激蛋白的表达,提高抗菌肽的水平,进而提高蚕体的抗性和免疫功能。     

应激过程中骨骼肌内热休克蛋白(HSPs)的变化及其调控机制

在应激反应时,细胞可快速产生一系列蛋白质,这些蛋白质即被称为热休克蛋白(HSP)。人们认为HSPs是一种分子伴侣,在保持细胞稳态当中起着十分广泛的作用。骨骼肌中所表达的HSPs包括小分子HSP家族(泛素、alpha B-晶体蛋白、HSP20、HSP27),HSP70、HSP60、HSP90等。骨骼肌是一个非常复杂的系统,其中的收缩蛋白是由各种不同的肌肉纤维类型所组成,每一种肌纤维均具有其各自的生化组成和功能特征。HSPs 的表达与肌纤维的类型有关。在肌病或体育锻炼过程中HSPs有明显的变化,然而HSP的诱导及调控的分子机制以及它在维持肌肉功能方面的作用尚未完全明了。本文主要阐述了骨骼肌中HSP的变化及其调控的分子生物学机制。     

家蚕Gloverin 2克隆、高效表达及其抗核型多角体病毒感染作用研究

为获得家蚕抗菌肽葛佬素2(BmGloverin 2)，并研究其在家蚕抗核型多角体病毒（BmNPV）感染过程中的作用，以经BmNPV诱导的3龄3日家蚕中肠cDNA为模板，根据GenBank上BmGloverin 2基因序列设计特异性引物，克隆出去除信号肽部分（1—18 aa）的BmGloverin 2基因，与表达载体pET-28a（+）连接构建pET28a(+)-BmGloverin 2，对含有pET28a(+)-BmGloverin 2重组质粒的菌株诱导表达，然后对抗菌肽重组蛋白进行Ni-IDA亲和层析、透析及浓缩过滤以获得高浓度目的蛋白；并采用抑菌试验检测BmGloverin 2重组蛋白生物活性；最后，将具有生物活性的BmGloverin 2重组蛋白和BmNPV混合处理4 h后喂食家蚕，并以直接喂食BmNPV和无菌水处理为对照组，以检测BmGloverin 2对BmNPV感染家蚕的影响。结果显示，成功克隆BmGloverin 2基因，并构建重组pET28a(+)-BmGloverin 2；在37℃、0.5 mmol/L IPTG条件下诱导表达可获得大量BmGloverin 2重组蛋白...     

利用家蚕生物反应器生产有用蛋白的研究

就家蚕/BmNPV表达系统的原理及生产流程、外源基因在该系统中的表达及表达产物的药物开发作了较为详细的阐述,介绍了利用家蚕大量生产有用蛋白的技术开发状况,展望了家蚕生物反应器的发展前景。     

龟鳖类动物热休克蛋白研究进展

介绍了热休克蛋白(HSP)的分类、特点及生物学功能,总结了近年来龟鳖类动物HSP在抗缺氧机制、性别决定机制、组织表达特异性及免疫调节方面的研究进展,并讨论了中华鳖HSP研究的意义和前景。     

家蚕核型多角体病毒IE1的多克隆抗体制备及鉴定

家蚕核型多角体病毒(BmNPV)ie1 基因是BmNPVDNA复制的必需基因,其编码的IE1蛋白能够反式转录 激活杆状病毒早期基因的表达.为了进一步研究IE1蛋白在家蚕核型多角体病毒感染宿主过程中具体的功能,研究 通过PCR扩增BmNPVie1 基因片段,亚克隆到原核表达载体pET32,获得重组质粒pET32-IE1,经测序正确后, 转化至大肠杆菌BL21(DE3)表达菌株.通过IPTG诱导融合蛋白原核表达后,初步纯化收集抗原,免疫新西兰大白 兔,制备IE1多克隆抗体.应用制备的免疫兔血清进行Western-blot分析,结果显示多克隆抗体能特异识别BmNPV 的IE1和IE0蛋白.免疫荧光结果同样显示IE1蛋白定位于宿主细胞核病毒复制中心.IE1抗体制备的成功为进 一步研究IE1在病毒感染家蚕中的作用机理奠定了基础.     

家蚕整合素β2的表达、纯化及其免疫功能

【目的】 分析家蚕（Bombyx mori）整合素β2的序列和结构特征及其在家蚕感染病原菌后血细胞中的表达变化,检测其重组蛋白对不同病原相关模式分子识别和病原菌的凝聚作用,为进一步探究家蚕整合素β2的蛋白功能打下基础。【方法】 利用生物信息学对整合素β2的序列和结构特征进行分析,利用实时荧光定量PCR检测家蚕分别注射大肠杆菌（Escherichia coli）和金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）后整合素β2在血细胞中的表达变化。通过PCR技术扩增获得整合素β2完整的胞外域片段,构建至pET22b原核表达载体后转化至E.coli Rosetta(DE3)表达菌株。经IPTG诱导获得重组蛋白,利用Ni-NTA亲和层析得到纯化的体外重组蛋白,利用SDS-PAGE和Western blot对纯化获得的体外重组蛋白的纯度和质量进行检测。利用ELISA检测重组蛋白与两种不同病原相关分子模式LPS和PGN的结合情况,运用Western blot检测重组蛋白与不同病原微生物的结合情况,通过凝集试验检测重组蛋白对金黄色葡萄球菌的凝集能力,最后在个体水平探索重组蛋白在体内细菌清理中的作用。【结果】 家蚕整合素β2具有典型的β整合素亚基保守结构特征,即由一个较长的胞外域、一个单次跨膜结构域和一个较短的胞内域构成。家蚕整合素β2具有金属离子结合位点MIDAS、EGF结构域、半胱氨酸重复基序和NPxY等整合素典型的结构特征。实时荧光定量PCR检测结果表明家蚕在受到细菌感染后,整合素β2的表达发生显著变化。通过原核表达和蛋白纯化获得纯度较高的重组蛋白,SDS-PAGE和Western blot检测结果表明纯化的重组蛋白纯度较高,可以用于后续试验。ELISA试验表明重组蛋白对LPS和PGN等病原相关分子模式具有较强的结合能力。细菌结合试验结果显示重组蛋白能够结合多种细菌,但与革兰氏阳性菌的结合能力要高于革兰氏阴性菌。细菌凝聚试验结果显示重组蛋白在Ca ²⁺的存在下对金黄色葡萄球菌具有较强的凝聚作用。细菌清除试验证实重组蛋白可以有效促进机体对外源入侵细菌的清理作用。【结果】 整合素β2具有典型的整合素β亚基的结构特征,可能具有识别病原相关分子模式,如LPS和PGN等的能力,通过与细菌的直接结合而实现对入侵病原微生物的凝聚作用,从而增强有机体的免疫能力,推测在家蚕免疫反应中发挥重要作用。     

以六倍体（AnAnCnCnCoCo）为桥梁创制抗旱新型甘蓝型油菜（AnArCnCo）

【目的】作为甘蓝型油菜的祖先种之一,白菜型油菜具有遗传多样性丰富、耐干旱、耐土壤瘠薄等优良特性。分析白菜型油菜的抗旱性,并以六倍体为桥梁,创造导入白菜型油菜优良抗旱性的新型甘蓝型油菜。【方法】以甘蓝型油菜和甘蓝为亲本,经杂交、胚挽救、染色体加倍,获得六倍体材料（AⁿAⁿCⁿCⁿC^oC^o）。以六倍体（AⁿAⁿCⁿCⁿC^oC^o）与白菜型油菜（A^rA^r）为亲本,杂交获得新型甘蓝型油菜（AⁿA^rCⁿC^o）;以PEG-6000溶液于萌发期模拟干旱处理新型甘蓝型油菜、白菜型油菜,测算种子萌发抗旱指数、相对萌发率、相对萌发势、相对根长和相对胚轴长,评价其抗旱性,并运用隶属函数法对抗旱性鉴定指标进行分析,筛选具有优良抗旱性的新型甘蓝型油菜。【结果】以11份六倍体材料和68份白菜型油菜为亲本,创建了124份新型甘蓝型油菜。新型甘蓝型油菜苗期表型介于六倍体和白菜型油菜之间。所选六倍体材料的染色体数目为56条,花粉育性约90%,合成的新型甘蓝型油菜的染色体数目为38条,花粉育性约80%。选取59份长势优良的新型甘蓝型油菜、7份六倍体材料、10份白菜型油菜以及20份自然甘蓝型油菜,进行主成分分析,四类材料分成三类,即六倍体材料、自然甘蓝型油菜和新型甘蓝型油菜、白菜型油菜,但自然甘蓝型油菜和新型甘蓝型油菜明显分开。以PEG-6000溶液模拟干旱,测定抗旱性指标,确定了用于白菜型油菜和新型甘蓝型油菜模拟干旱处理的PEG-6000溶液浓度,分别为200和250 g·L^-1。从59份新型甘蓝型油菜中选取9份进行抗旱性鉴定,发现其中有3份新型甘蓝型油菜的抗旱性优于对照甘蓝型油菜中双11号,而且这三份新型甘蓝型油菜的抗旱性与各自的父本白菜型油菜的抗旱性呈正相关性。【结论】以具备优良抗旱性的白菜型油菜为亲本,以六倍体材料为桥梁,可创制具备优良抗旱性的新型甘蓝型油菜。     

白僵菌和绿僵菌对棉铃虫的室内防控效果评价

【目的】研究白僵菌和绿僵菌在不同侵染方式下对棉铃虫幼虫致死效应的差异。【方法】室内配置不同浓度白僵菌和绿僵菌孢悬液,采用浸渍法和饲喂法对棉铃虫三龄幼虫进行处理,统计死亡率及体重。【结果】白僵菌和绿僵菌孢子悬浮液经体壁侵染对棉铃虫最大校正死亡率分别为63%和73%,经消化道侵染对棉铃虫最大校正死亡率为38%和65%,与对照相比,体重有不同程度的下降。【结论】室内条件下白僵菌和绿僵菌两者的分生孢子悬浮液均是,浓度越高对棉铃虫的致死效率和体重控制效果越好,且4×10⁷ 孢子 /mL浓度的绿僵菌和1.5×10⁸ 孢子/mL的白僵菌是防治棉铃虫幼虫的经济有效浓度。     

棉田烟粉虱的为害及其经济阈值分析

【目的】 研究烟粉虱对棉花为害性及棉田烟粉虱的防治指标,为棉田烟粉虱防控提供理论依据。【方法】 采用田间试验、田间烟粉虱虫量系统调查、棉花产量测定的方法,分析烟粉虱对棉花为害性及防治数据,建立棉田烟粉虱的经济阈值。【结果】 烟粉虱对棉花单株结铃数、单株籽棉重、皮棉单产等均有明显的影响,但对单铃重没有明显的影响;虫口密度(x)与棉花单株结铃数(Y₁)、单株籽棉重(Y₂)、皮棉单产(Y₃)等指标的回归方程分别为:Y₁= 12.242 e^{-0.008 x} (r = 0.912 7^**),Y₂= 29.07e^{-0.009 6x} (r=0.894 4^**),Y₃= 29.07 e^{-0.009 6x}(r=0.894 4^**),虫口密度与棉花单株铃重、衣分没有明显的相关关系。烟粉虱对棉花纤维长度有明显影响,虫量与棉花纤维长度(Y₄)回归方程为:Y₄ = -0.004 6x + 28.409 r=0.607^*。【结论】 烟粉虱影响棉花产量和品质。棉田烟粉虱的经济和阈值以若虫计为1.9头/cm²。     

小麦蛋白激酶TaMAPK2互作蛋白的筛选与验证

【目的】利用构建的干旱胁迫处理的小麦cDNA文库,通过酵母双杂系统筛选与小麦TaMAPK2互作的蛋白,并对其进行验证分析。【方法】以小麦cDNA为模板克隆得到TaMAPK2,构建pGBKT7-TaMAPK2诱饵载体,将诱饵载体pGBKT7-TaMAPK2质粒以及pGADT7和小麦cDNA文库共转化酵母AH109菌株感受态细胞,在SD/-Trp/-Leu/-His/-Ade营养缺陷型培养基上30℃培养3-5 d,挑选单克隆于YPDA培养基中培养,吸取1 μL各候选克隆的菌液点至于SD/Raf/Gal/x-gal平板上培养,筛选蓝色单克隆。将筛出的单克隆经测序、序列比对分析,初步获得与TaMAPK2互作的候选蛋白。采用双酶切的方法构建pGADT7-HSP90以及pSPYNE-TaMAPK2和pSPYCE-HSP90双分子荧光互补表达载体,将重组载体质粒pGADT7-HSP90和pGBKT7-TaMAPK2共转化AH109酵母感受态细胞,利用酵母双杂交的方法验证TaMAPK2与候选蛋白HSP90的相互作用;采用PEG-Ca2+介导法将双分子荧光互补表达载体pSPYNE-TaMAPK2和pSPYCE-HSP90共转化小麦原生质体细胞,激光共聚焦显微镜下观察相互作用产生的YFP荧光信号。根据HSP90的保守序列设计特异引物,在SYBR Green Ⅰ的检测模式基础上,构建HSP90的实时荧光定量PCR检测体系,检测HSP90在不同胁迫处理以及不同组织的小麦植株中的表达量。【结果】通过对候选蛋白的初步分析表明这些候选蛋白主要参与植物体的信号转导或免疫过程,表明TaMAPK2在植物的逆境信号转导、基因转录调控过程中发挥着重要作用。通过酵母双杂交显蓝系统和双分子荧光互补技术（BiFc）进一步确认HSP90与TaMAPK2的互作关系。HSP90定位在细胞核、细胞膜以及细胞质中,且在植物的根茎叶中均有表达,在根中的表达量最高。通过实时荧光定量PCR分析显示,HSP90基因受到高温、低温、高盐和ABA胁迫后表达量上调。【结论】HSP90作为分子伴侣,在降解这些受损或异常蛋白以及调控抗逆相关转录因子表达的过程中发挥着重要的作用。非生物胁迫会引起植物体内一些受损或异常蛋白聚合物的积累,HSP90能通过折叠已损坏的蛋白底物以及构象的维持来保持细胞的完整性。表明在植物逆境信号转导过程中,TaMAPK2功能的发挥可能需要HSP90蛋白的参与。     

利用野生甘蓝改良油菜Ogu CMS恢复材料的菌核病抗性

【目的】 油菜生产受菌核病危害严重,但油菜中缺乏抗源,严重限制了油菜抗菌核病育种进程。萝卜胞质不育系（Ogu cytoplasmic male sterility,Ogu CMS）是生产油菜杂交种最好利用的授粉控制系统之一,但目前还没有抗菌核病油菜Ogu CMS恢复系选育的报道。野生甘蓝中存在高抗菌核病的资源,以抗病野生甘蓝为抗源,拟将野生甘蓝的菌核病抗病遗传成分转入Ogu CMS材料中,发展优质抗菌核病的油菜Ogu CMS恢复材料,为进一步发展抗菌核病的油菜Ogu CMS恢复系提供资源。【方法】 首先采用抗菌核病野生甘蓝Brassica incana与白菜种间杂交,经胚挽救及染色体加倍技术发展人工合成甘蓝型油菜;然后将人工合成甘蓝型油菜与含Ogu CMS的油菜杂交,后代自交,并利用与甘蓝抗病QTL连锁的marker进行分子标记辅助选择（marker-assisted selection,MAS）,筛选携带主效抗病位点C1-QTL和C9-QTL的材料;MAS选中的材料通过侧枝离体接种鉴定评价其菌核病抗性,选择相对感病度S（susceptibility）显著低于甘蓝型油菜中双9号（耐病对照）的材料进行籽粒硫苷和芥酸含量测定,选择籽粒品质相对较好的材料进行恢保测定,筛选含抗病位点、抗菌核病、且结实率较好的Ogu CMS恢复材料。【结果】 成功获得抗病甘蓝与白菜杂交发展的人工合成甘蓝型油菜AC1-4,其菌核病抗性显著高于甘蓝型油菜中双9号;AC1-4与Ogu CMS甘蓝型油菜4Q292杂交产生了146个F₁单株,从中选择到含有甘蓝C1-QTL和C9-QTL、结实正常、相对感病度S分别为0.66和0.40的2个单株4C99和4C115发展F₂世代;并从124个F₂植株中筛选出8份材料自交发展了982个F_2:3单株,并从中筛选到50株含有抗病位点C1-QTL和C9-QTL的植株,其相对感病度S介于0.34—0.89;其中有2份籽粒品质接近单低的材料5X82-2（硫苷含量为45.38 μmol·g^-1饼粕）和5X82-7（芥酸含量为6.5%）。【结论】 改良了油菜Ogu CMS恢复材料的菌核病抗性。     

梨幼果FWL1膜系统酵母双杂交三框cDNA文库构建及互作蛋白的筛选

【目的】筛选与FWL1互作的蛋白,为研究FWL1基因调节果实大小机理提供依据。【方法】以杜梨、库尔勒香梨、鸭梨、早美香为材料,提取4个梨品种果实细胞分裂关键时期的果肉组织混样RNA。构建梨幼果FWL1膜系统酵母双杂交三框cDNA文库,并鉴定文库质量。构建诱饵载体并转化酵母菌,筛选与FWL1互作的蛋白,对初步筛选出的阳性酵母克隆进行测序并在NCBI中进行Blast比对,确定候选互作蛋白。【结果】文库库容约为3×10⁷ CFU,大于1×10⁷ CFU,平均插入片段大于1 000 bp,阳性率为≥98%。诱饵载体无自激活功能,利用共转化方法,筛选出272个与FWL1互作的蛋白质。【结论】梨幼果膜系统酵母双杂交三框cDNA文库符合酵母双杂文库的基本条件,适用于后期筛选相互作用的蛋白。筛选出的272个互作蛋白在果实发育过程中表达不同,其中collagen and calcium-binding EGF domain-containing protein 1和metallothionein-like protein可能与梨果实大小发育有关。