农杆菌介导向玉米茎尖导入HAL1基因的初步研究

选用玉米优良自交系郑58的茎尖为受体,研究以玉米茎尖为受体进行农杆菌转化体系的可行性。用农杆菌介导法将耐盐碱基因HAL1转入玉米中,获得70株转化苗,经过300 mg/L的除草剂(Basta)筛选,共获得9株转基因植株。进一步进行 PCR检测,其中6株表现阳性,转化率达8.57%。初步证明外源基因已经整合到玉米基因组中,以玉米茎尖作为受体孢子体的转化系统可用于基因转化。     

重组人血清白蛋白在紫花苜蓿中的转基因表达

为获得高产重组人血清白蛋白的转基因紫花苜蓿"游客"(Medicago sativa L. cv.‘Eureka’)株系用于规模化生产rHSA,构建了rHSA植物表达载体。以紫花苜蓿子叶愈伤组织为受体,通过农杆菌介导法进行遗传转化,筛选出潮霉素抗性植株,提取抗性再生紫花苜蓿植株基因组DNA做PCR鉴定,结果表明重组人血清白蛋白基因片段已整合到紫花苜蓿基因组中;提取转基因植株总蛋白,Western blotting检测结果表明rHSA在转基因植株中成功表达。此结果表明转基因紫花苜蓿可稳定表达rHSA。      

农杆菌介导的大豆植株整体转化

农杆菌介导的植物整体转化法主要以植物的分生组织和生殖器官作为外源基因导人的受体,通过真空渗透法、浸蘸法及注射法等方法使农杆菌与受体材料接触,以完成可遗传细胞的转化,通过抗生素筛选和分子检测鉴定转基因植株后代.以大豆幼苗的顶端生长点和叶腋生长点为靶点,通过农杆菌介导的整体转化法--注射法进行转录因子DREB1C基因的遗传转化,最终获得6株T0代PCR阳性转基因植株,转化率为9.2%.T1代植株的PCR、Southern blot和RT-PCR鉴定结果表明获得1株阳性植侏,DREB1C基因以单拷贝形式整合于大豆基因组中,在200 mmol·L-1NaCl胁迫条件下在转录水平得到成功表达.该方法克服了大豆组织培养再生难、转化率低的缺点,是一种高频、简单、快捷的非组培遗传转化途径.     

农杆菌介导法向小麦茎尖导入DREB1A基因的研究初报

为了研究以小麦茎尖为受体进行农杆菌转化的可行性,选用小麦品种H6756,以茎尖为受体进行了农杆菌转化.构建了含有拟南芥逆境诱导转录因子DREB1A及除草剂bar基因的表达载体pC3300IS-DREB1A,酶切鉴定此载体,结果证明其连接完全正确,具有转录和表达的功能.农杆菌介导法向小麦茎尖导入DREB1A基因,共获得247株转化苗.转化苗经除草剂筛选,获得66株抗性苗,对抗性苗进一步进行PCR检测,有30株抗性苗扩增出特异性片段,转化率达到12.1%,初步说明本试验中以小麦茎尖为受体的转化系统用于基因转化是可行、高效的.     

大豆生物工程研究进展

90年代以来，大豆的生物工程研究重点放在建立遗传转化和再生体系上，随着遗传转化和再生技术的发展，我国已获得了抗病、抗虫转基因大豆植株，取得突破性进展。目前，大豆遗传转化主要采用农杆菌介导法、花粉管通法、基因枪及PEG法。农杆菌介导的遗传转化是以大豆子叶、胚轴为外植体，通过卡那霉素筛选，器官发生再生转化植株；花粉管介导法是以植株整体为受体导入外源原因，获得稳定遗传品系；基因枪介导的遗传转化是以大豆幼胚的胚轴、用基因枪轰击生长点，可以从任意一个基因型获得转基因植株；PEG介导的遗传转化是将质粒导入大豆原生质体，通过潮霉素进行筛选，获得转基因植株。     

转NPR1和CHR3抗病基因提高大豆对疫霉根腐病抗性研究

为检测GmCHR3和广谱抗病基因NPR1双抗基因转化到大豆吉林30中的遗传稳定性和抗病能力,从而为培育出抵抗疫霉根腐病大豆新品种提供有效参考,以大豆品种吉林30转CHR3抗病基因转化品系JL30+GmCHR3为目标受体材料,以吉林30为对照受体材料,利用农杆菌介导法将NPR1导入受体中.利用常规PCR检测基因转化情况,利用Southern杂交和qRT-PCR技术分别鉴定JL30+GmCHR3受体和双抗基因转化株系T1和T2代中两个基因的整合和表达情况,采用下胚轴侵染法鉴定转基因大豆植株对疫霉根腐病的抗性.PCR研究结果显示:转化元件的启动子35s、终止子Nos、筛选标记基因Bar以及目的基因NPR1全部转入到受体基因组中;NPR1基因以单拷贝的形式在转化植株中完成整合;NPR1基因在大豆植株根、茎和叶中均有表达,其中T1代株系在3个部位的相对表达量分别是2.732,1.614和3.316,T2代株系的相对表达量分别是2.936,2.084和3.864;NPR1基因在各组织中的相对表达量为茎＜根＜叶.CHR3和NPR1双抗基因转化株系对疫霉根腐病表现为高抗,NPR1单抗基因转化株系表现为中抗,非转基因吉林30植株表现为感病.结果说明大豆吉林30转入双价抗病基因GmCHR3和NPR1可以增强其对疫霉根腐病的抗性.     

高效快速甘蔗转基因方法探索

甘蔗遗传背景复杂,转基因技术是甘蔗品种遗传改良的重要途径。甘蔗转基因遗传改良主要是通过基因枪法和农杆菌介导法来实现,但目前我国的甘蔗转基因技术,普遍存在转基因效率偏低,获得的转基因株系偏少,难以筛选到目的基因稳定表达、有利用价值的转基因株系等问题。本实验室通过多年的经验积累,建立了一种高效快速的农杆菌介导法的甘蔗转基因方法。转化效率为20%,筛选效率达到90%,转化时间为4个月,操作简单,成本较低。     

未成熟种子子叶节转化体系优化及转EPSPS/GAT基因大豆新材料创制

以丛生芽率为指标,将农杆菌介导的大豆未成熟种子子叶节转化与成熟种子转化体系进行比较,明确了诱导过程中草甘膦筛选浓度、未成熟种子生理状态,改进大豆外植体的获得方式并减少了组培环节,建立了未成熟种子子叶节转化体系。利用Jack黄熟后期的种子作为受体材料,在15 mg·L-1的草甘膦筛选浓度下获得了9株PCR检测阳性植株并且生长正常可育,T0代经测序及Southern Blot分析,进一步证明外源基因已整合进大豆基因组中,其中2个株系的T1代植株经PCR检测符合3∶1的分离比,且表型鉴定筛选出抗性转基因植株,为抗草甘膦转基因大豆育种提供了新材料。     

根癌农杆菌介导的马铃薯高效遗传转化体系的研究

通过根癌农杆菌介导的遗传转化方法,建立了马铃薯栽培品种“费乌瑞它(Favorita)”茎段和试管薯的遗传转化体系,其转化频率分别可达25.6%和36.8%。实验结果表明,玉米素有助于茎段和试管薯转化再生芽的分化,乙酰丁香酮可以提高茎段的转化率,但对试管薯的转化作用效果不明显。卡那霉素生根筛选和PCR鉴定结果显示,在分化培养基上再生的转化植株假阳性率较高,在遗传转化工作中要加大转基因植株的数量,才有可能获得所期望的转基因植株群体。     

半夏凝集素基因对小麦的遗传转化研究

为了拓宽农杆菌介导的小麦遗传转化的受体基因型,同时改良小麦品种的抗蚜特性,以甘肃省主推春小麦品种陇春22和优良品系9614的幼胚为转基因受体材料,以预培养4d的幼胚愈伤组织为受体,以含有半夏凝集素基因的C58c1农杆菌菌株为供体,将重组质粒pBI pta导入小麦,建立了农杆菌介导的小麦遗传转化体系。经G418 25mg.L-1抗性筛选、PCR检测共获得转基因植株7株,其中9614的4株,陇春22的3株;采用荧光定量PCR分析得出转基因植株中单拷贝的有1株,2个拷贝的1株,3个拷贝和4个拷贝的各有2株,1株没有得到扩增。对整合有2个拷贝半夏凝集素基因的陇春22-20转基因小麦的T1代植株进行了PCR检测,其中有50%的植株扩增出目的基因,50%没有扩增出目的基因,初步说明T1代植株中外源基因得到了遗传。     

农杆菌介导的大豆子叶节遗传转化技术流程及操作要点

大豆遗传转化效率低,是大豆转基因育种亟待解决的重要问题。以大豆子叶节为外植体采用农杆菌介导法,系统地研究了大豆子叶节遗传转化各技术环节的操作要点,包括工程菌液制备、无菌苗获得及外植体制备、农杆菌的侵染及共培养、不定芽诱导、不定芽伸长、根诱导、驯化与移栽、抗性植株的获得及转基因植株的检测等,建立了一套较稳定、高效的大豆子叶节遗传转化体系。并利用该体系,将野生大豆耐盐碱相关基因A1对大豆品种绥农28、合丰50、合丰55、东农50进行遗传转化,系统地探讨了大豆基因型、影响T-DNA的转移效率的各环节、筛选剂浓度及不同基因型转化效率等几个重要因素。     

利用改良的草丁膦筛选系统快速而有效筛选转基因大豆

为提高大豆(Glycine max(L.)Merrill)遗传转化效率建立了一种快速而有效的草丁膦筛选系统.将刺伤的子叶节外植体接种于含有pCAMBIA3201载体的LBA4404农杆菌溶液.目前利用草丁膦筛选转基因大豆的常规方法是在含有5 mg/L草丁膦的芽诱导培养基和含有3～5 mg/L草丁膦的芽伸长培养基上进行筛选.利用此常规筛选方法所获得的大多数植株是非转化体,从而导致转化效率变低,为1.6%;而且这种方法极大地延迟了芽的伸长过程,使多数不定芽的伸长发生在农杆菌处理后的21～41周.为此,对常规草丁膦筛选方法进行了改良.首先将外植体放置在不含有除草剂的芽诱导培养基上培养3周,然后转到含有4 mg/L草丁膦的芽伸长培养基上进行筛选.此时,多数不定芽仅在7～12周内便可伸长.当芽长到3～5 cm时,从外植体上切下来转到含有1～5 mg/L草丁膦的根诱导培养上进行进一步的筛选.结果表明,在添加有3 mg/L草丁膦根培养基上,转化效率达到最大值为6.7%.不定芽对根培养基中的除草剂反应迅速,仅在10d天内所有非转化体都变枯死亡.利用这种改良的筛选系统,大多数转基因植株仅在8～16周内便可获得.Southern杂交结果证实了外源基因稳定地整合在大豆基因组中.GUS检测和除草剂抗性分析结果表明,被整合的外源基因在大豆细胞中得到了稳定的表达.     

基于不定芽原位诱导的大豆转基因方法

建立了一种新型农杆菌介导的大豆转基因方法(专利公开号:102181479A),以萌发大豆为外植体,最大限度地保持了大豆植株的完整性,在非无菌环境下进行转化,利用草丁膦筛选阳性植株。该方法不需要组织培养,脱离了传统组培的限制。对16个大豆基因型进行转化,经PCR、RT-PCR、qPCR和GUS染色鉴定转基因株系,平均转化率为23%。获得当代转基因植株接近实生苗,收获种子仅需3～4个月。该方法将有利于促进大豆基因功能研究和规模化转化。     

根癌农杆菌介导的大豆子叶节转化体系的优化

以13种不同基因型的大豆为材料,研究了大豆外植体再生过程中不同大豆基因型对丛生芽数目的影响,选取优势基因型为受体材料,比较了在草丁膦和潮霉素筛选压力下外植体的再生情况,并确定其合适的筛选浓度,在对农杆菌介导的子叶节转化体系优化的基础上进行了大豆转化效率的研究。结果显示:在相同的芽诱导条件下,山宁14产生的丛生芽最多,更适合于大豆子叶节转化;与其它筛选剂相比,采用潮霉素的梯度筛选更有利于抗性苗的成活,其最适筛选浓度为8 mg.L-1;通过检测GUS基因的表达和分子鉴定证明外源的GUS基因已插入到转基因植株的基因组中,转化效率达到3.2%。     

Bt基因导入马铃薯品种大西洋的研究

通过基因工程手段,利用农杆菌介导法,将Bt基因导入马铃薯品种大西洋,同时对马铃薯品种大西洋的叶片再生体系进行优化,探讨了影响植株再生频率和遗传转化效率的因素,确立了最佳植株再生体系和遗传转化条件,获得了转基因植株。     

玉米高效农杆菌转化体系的研究进展及其影响因素分析

转基因技术作为植物分子育种的重要手段之一,具有许多不同于传统育种技术的独特优点,受到了国内外科研工作者的高度重视。目前转基因玉米的商业化种植已经获得了巨大成功。玉米遗传转化的受体主要是幼胚或幼胚诱导的愈伤组织,由于受到基因型、生长季节、取材时间等因素制约,大大限制了转基因技术在玉米育种上的产业化应用。总结对农杆菌介导的玉米高效遗传转化体系的研究进展,对影响转化效率的关键因素进行分析,并对玉米遗传转化的产业化应用前景进行讨论和展望。     

根癌农杆菌介导的水稻转化系统的优化及转反义Wx基因植株的获得

以具不同直链淀粉含量的籼粳稻品种为受体材料,试验了适宜于根癌农杆菌介导转化的水稻愈伤组织诱导培养基及其诱导培养的时间。结果表明,一种基于MS基本培养基的商品培养基较适合作为籼粳稻幼胚愈伤组织的诱导培养基;对于籼型杂交稻亲本协青早B,转化前幼胚较适合的愈伤组织诱导培养天数为8 d左右。在此基础上,将反义蜡质（Wx）基因分别导入上述受体亲本中,获得了一批转基因水稻植株。PCR和Southern杂交分析表明反义Wx基因已经整合进了转基因水稻的基因组中。遗传分析表明外源基因在转基因水稻后代中的分离符合3∶1的理论比例。