鸭坦布苏病毒E蛋白结构域III原核表达产物诱导中和抗体的研究

黄病毒E蛋白结构域Ⅲ能够介导病毒与宿主受体结合以及诱导产生中和抗体,本研究利用原核表达系统表达了鸭坦布苏病毒E蛋白结构域Ⅲ,并研究了其免疫原性。按照大肠杆菌偏好性密码子对鸭坦布苏病毒E蛋白结构域Ⅲ核苷酸序列进行优化并合成后,克隆至pCold-TF载体构建重组质粒pCold-TF-optiEDIII。Western blot证实重组蛋白能与鸭坦布苏病毒特异性血清发生反应。用纯化的重组蛋白免疫BLAB/c小鼠3次,间接ELISA和间接免疫荧光实验证实E蛋白结构Ⅲ诱导了鸭坦布苏病毒特异性的体液免疫反应。中和实验证实鸭坦布苏病毒E蛋白结构域Ⅲ可诱导产生中和抗体。本研究为进一步研制鸭坦布苏病毒诊断抗原和亚单位疫苗奠定了基础。     

鸭坦布苏病毒E蛋白原核表达及反应原性分析

参照Gen Bank已发表的鸭坦布苏病毒序列,采用生物信息学分析并利用PCR方法从鸭坦布苏病毒湖北分离株(JL2011株)扩增出E基因全长片段(E1)及E基因截短片段(E2),将含有双酶切位点的目的片段连接p ET-28a(+)载体,成功构建出重组表达质粒p ET28a-E1和p ET28a-E2。将p ET28a-E转化BL21(DE3)后,经IPTG诱导可表达出约54.3 ku和44.8 ku的蛋白,但E2的表达量明显高于E1,故将筛选的E2包涵体进行纯化后,用坦布苏病毒阳性血清进行Western blot分析表明纯化后的重组蛋白具有良好的反应原性。研究为进一步阐明鸭坦布苏病毒E蛋白的功能及建立快速灵敏的鸭坦布苏病毒检测方法奠定基础。     

鸭坦布苏病毒RT-PCR检测方法的建立

为快速检测鸭坦布苏病毒(DTMUV),根据鸭坦布苏病毒E蛋白的基因序列设计一对特异性PCR引物,并以鸭坦布苏病毒基因组为模板,建立了鸭坦布苏病毒的特异性RT-PCR检测方法,进行了特异性和敏感性试验,并用该方法对采自江苏地区的疑似病料进行了检测。结果表明:该方法可以特异性地扩增出鸭坦布苏病毒E蛋白基因保守区514 bp的序列,和对照的其他鸭病毒无交叉反应;敏感性较好,最低可检测到1 fg的基因组;临床样品的检出率为100%。说明所建立的RT-PCR检测方法特异性强、敏感性高,可用于临床快速诊断鸭坦布苏病毒。     

鸭混合感染病例中鸭坦布苏病毒的分离鉴定与E基因序列分析

对山东省滨州某鸭场2013年送检的疑似鸭瘟或鸭坦布苏病毒感染的临床病料,通过PCR检测进一步确诊为鸭瘟与鸭坦布苏病毒混合感染,并分离到了鸭瘟与鸭坦布苏病毒混合感染毒,为获得单一的鸭坦布苏病毒,利用鸭瘟阳性血清对分离病毒连续进行2次中和试验,接种10日龄SPF胚并连续传3代,收获尿囊液,通过PCR鉴定获得了单一的鸭坦布苏病毒。对分离毒进行ELD50及血凝性等相关测定,并RT-PCR扩增全长E基因,进行序列分析。研究成功得从鸭瘟与鸭坦布苏病毒混合感染的病料中分离到鸭坦布苏病毒,为鸭坦布苏病毒的致病机理等基础性研究以及相关疫苗与诊断试剂的研制奠定了基础。     

鸭坦布苏病毒E蛋白抗原表位的鉴定及其表位交叉反应性分析

为鉴定鸭坦布苏病毒(DTMUV)E蛋白的抗原表位,本研究以纯化的抗DTMUV E蛋白单克隆抗体(MAb)3B6为固相筛选分子,对噬菌体随机12肽库进行淘选,通过对阳性噬菌体克隆测序分析,确定DTMUV E蛋白的模拟表位氨基酸序列,将模拟表位序列与GST蛋白融合表达并进行western blot验证。利用DNAStar对表位序列进行同源性分析,并通过dot blotting方法分析抗原表位在黄病毒阳性血清间的交叉反应性。结果鉴定了DTMUV E蛋白的一个线性抗原表位EVEPPFG,并且该表位在DTMUV与其它黄病毒中均具有高度的保守性。Dot blotting结果显示抗原表位EVEPPFG在黄病毒阳性血清间具有交叉反应性。因此,EVEPPFG为黄病毒共享型的抗原表位,这对于黄病毒E蛋白的抗原结构功能的研究以及研制表位疫苗和诊断抗原等具有重要意义。     

鸭坦布苏病毒SC2013株的分离鉴定

利用RT-PCR从疑似鸭坦布苏病毒感染的致死产蛋鸭的肝、脾和卵泡膜等组织中扩增出鸭坦布苏病毒E基因,并利用10日龄鸭胚分离出病毒SC2013株。该毒株对氯仿和胰蛋白酶敏感,不凝集鸡红细胞;E基因核苷酸序列与坦布苏病毒GX2013G(Gen Bank:KM275941.1)的相似性在99%以上;对10日龄鸭胚的半数致死量为10-4.59/0.2 m L,人工接种能引起2日龄雏鸭发病死亡并呈现典型的临床症状与病理变化。以上结果表明,分离病毒SC2013株为致病性的鸭坦布苏病毒,在今后养鸭业中除注重鸭坦布苏病毒对产蛋鸭的危害外,也应加强防止幼龄鸭感染。     

鸭坦布苏病毒RT-PCR检测方法的建立及应用

为建立一种能快速检测鸭坦布苏病毒（Tembusu virus,TMUV）的分子生物学方法,从GenBank中下载了51个具有代表性的黄病毒全基因组序列及白洋淀病毒等5个禽源黄病毒株E基因序列,进行了黄病毒E基因序列分析,应用Primer 5.0软件设计了一对引物,扩增目的片段为549 bp,进行了TMUV RT-PCR检测方法的特异性、敏感性、重复性试验,建立了TMUV RT-PCR检测方法应用该方法对收集的14份临床疑似蛋鸭鸭坦布苏病毒病发病样品进行了检测,共检出6份TMUV核酸阳性样品,检出率达42.86％。结果表明,该方法可用于水禽坦布苏病毒病的临床快速诊断、检测及流行病学调查。     

基于宏基因组学的鸭源样本中坦布苏病毒检测方法的建立

利用二代高通量测序技术建立检测鸭源样品中坦布苏病毒的方法。首先将样品过滤和经核酸酶处理,再利用等温链位移扩增(SPIA)技术快速制备样品总cDNA,最后经磁珠纯化和文库构建后,通过Ion Torrent进行高通量测序获得基因组信息。结果显示,通过SPIA扩增和核酸文库制备的优化,可从微量病原样本中获得327pmol/μL的核酸文库样本。Ion Torrent测序共获得1 725 436条reads,约6.2M数据,平均109bp。数据拼接并Blast发现,病原样品的核酸序列可注释鸭坦布苏病毒全部基因组数据,与首次发生在我国的鸭坦布苏病毒BYD-1株参考序列的同源性为100%。将所测病毒序列与其他5种黄病毒科成员进行同源性比对,发现与近3年发生在我国的鸭坦布苏病毒同源性最高,在98%以上。且NS基因进化树分析与鸭坦布苏病毒处于同一分支上,符合鸭坦布苏病毒特征。本研究建立的基于未知病原SPIA扩增结合高通量测序检测方法,可同步获知坦布苏病毒基因的核酸信息。     

1株麻雀源坦布苏病毒的分离鉴定及全基因组序列分析

从山东地区某发病鸭场周围的麻雀体内分离到1株坦布苏病毒,命名为SDS株,并对分离毒株进行毒力测定。应用RT-PCR技术对分离株全基因组进行扩增并测序,将获得的SDS株坦布苏病毒全基因组序列与已在Gen Bank发表的24株坦布苏病毒和6株其他黄病毒属病毒全基因组序列进行遗传进化分析。结果表明,该株坦布苏病毒的基因组全长为10 990 nt,包含94 nt的5'端非编码区、618 nt的3'端非编码区和一个开放阅读框(3 425个氨基酸),编码11种病毒蛋白;与Gen Bank已发表的坦布苏病毒的核苷酸序列同源性为98.2%~99.5%,氨基酸序列同源性为98.1%~99.4%,其中与鸭源WFZ株(KC990545.1)的核苷酸序列同源性最高为99.5%,与鹅源坦布苏病毒(duck eggdrop syndrome virus strain goose,JQ920424.1)和鸡源坦布苏病毒(CJD50,JF926699)的核苷酸序列同源性较低为98.9%。用Net NGlyc 1.0 Server在线软件对病毒蛋白潜在糖基化位点进行预测,结果表明在SDS株病毒多聚蛋白中共有13个潜在的糖基化位点,分别位于5个不同病毒蛋白中。     

鸭坦布苏病毒E基因重组杆状病毒的构建与间接ELISA检测方法的建立

研究旨在建立基于真核表达的鸭坦布苏病毒(DTV)E蛋白的诊断鸭坦布苏病毒病的间接ELISA方法。利用Bac-to-Bac杆状病毒昆虫表达系统,构建含有DTV E基因的重组杆状病毒。用重组病毒感染昆虫细胞后,SDS-PAGE鉴定出55 ku左右的表达蛋白,Western blot检测该蛋白具有很好的反应原性。以重组Bacmid DTV E蛋白作为包被抗原,建立间接ELISA检测方法。利用该方法对135份来自江苏省的樱桃谷鸭血清样品进行检测,发现其血清阳性率达79.3%。表明建立的间接ELISA检测方法特异性强、重复性好、敏感性高,可以用于鸭坦布苏病毒病的临床诊断。     

癸氧喹酯干混悬剂含量测定的改进

采用高效液相色谱法测定癸氧喹酯干混悬剂的含量,在2-250μg/mL范围内,峰面积的常用对数与进样量浓度的常用对数呈良好的线性关系,R^2=1(n=5),平均回收率为99.24%~99.51%,RSD在0.05%~0.28%。此方法分析时间短,样品前处理简便、定量结果准确,重现性好,结果满意,为其质量控制提供了依据。     

商会自治的基石——商会自治规范研究

在现代法律秩序中,商会自治规范是制定法的基础和必要的补充,甚至在某些方面替代了制定法;商会自治规范主要包括商会组织规范、行为规范、惩罚规范以及争端解决规范等;其效力仅及于其内部成员;商会自治规范和制定法之间存在冲突,但也存在整合的基础。     

猪毛色遗传的研究进展

本文概述了猪的毛色类型、猪的毛色遗传模式,着重综述了猪毛色基因分子基础的研究进展,指出存在问题并就未来发展方向做了思考。     

中华人民共和国农业部公告 第267号

为贯彻落实《兽药生产质量管理规范》(简称《兽药GMP》),进一步推动兽药GMP实施进程,我部制定了《兽药生产质量管理规范检查验收办法》,现予公告。本公告自2003年6月1日起施行。附件:兽药生产质量管理规范检查验收办法二○○三年四月十日第一章 总则 第一条 为推动《兽药生产质量管理规范》(以下简称兽药GMP)的实施,规范兽药GMP检查验收工作,制定本办法。 第二条 农业部负责全国兽药GMP管理和检查验收工作;负责制修订兽药GMP检查验收管理规定;负责兽药GMP检查员队伍建设和监督管理工作,负责国际兽药贸易中GMP互认工作。 …     

鸡败血支原体垂直传播模式及其阻断方法

以国际标准强毒Ｒ株人工感染非免疫产蛋鸡,定时扑杀,分别从鼻窦、眶下孔、气管、肺、气囊、卵巢和输卵管分离ＭＧ,并收集感染鸡所产蛋分离ＭＧ。结果表明,人工感染４８小时后上、下呼吸道及肺已被全面感染,９６小时气囊已被感染,１２０小时输卵管已能分离到ＭＧ,卵巢始终分离不到ＭＧ。人工感染鸡自１４４小时便能在其所产蛋中分离出ＭＧ。药物治疗能在７２小时内消除感染,油乳剂苗则需２４天后逐渐降低蛋内ＭＧ分离率,药物卵内注射、种蛋药浴、高温处理均能杀死卵内ＭＧ,但以研制的种蛋浸泡剂药浴效果为最好。     

Comparison of 2 methods of centesis of the bursa of the biceps brachii tendon of horses

REASONS FOR PERFORMING STUDY: Centesis of the bicipital bursa using an 8.9 cm long spinal needle has been reported but the alternative of employing a 3.8 cm long hypodermic needle requires validation. OBJECTIVE: To compare the efficacy of 2 different methods of centesis of the bicipital bursa and to evaluate the usefulness of ultrasonographic imaging to determine the location of solution administered when centesis of the bursa is attempted. METHODS: For Trial 1, 6 clinicians, who had no previous experience of centesis of the bicipital bursa, attempted to inject a solution composed of an aqueous radiopaque contrast medium and physiological saline solution (PSS) into the bicipital bursae of 2/12 horses using the previously described distal approach to inject one bursa and a proximal approach to inject the contralateral bursa. The bicipital tendon and bursa were examined ultrasonographically before and after injection; and both shoulders were examined radiographically to identify the location of the medium. In Trial 2, another 6 clinicians, also with no previous experience of centesis, repeated Trial 1, using 6 horses, but the radiopaque contrast medium was mixed with air instead of PSS. RESULTS: Accuracy of centesis using the proximal approach was 39% and that of the distal approach 28%. Ultrasonographic examination of the shoulder allowed the location of solution and air to be accurately predicted in all 12 shoulders examined. CONCLUSIONS: Clinicians who have had no previous experience performing centesis of the bicipital bursa are unlikely to be successful in centesis using either approach. Radiographic examination after injecting a radiopaque contrast medium may be necessary to assess the success of centesis especially if bursal fluid is not obtained during centesis. Injecting air along with the radiopaque contrast medium provides more accurate ultrasonographic confirmation of centesis and better radiographic definition than does injection without air.     

不同样本商品蜂蜜中硒含量的测定

用硝酸和高氯酸消化蜂蜜,使硒游离出来,在微酸性环境下,硒和2,3-二氨基萘(DAN)生成有较强荧光的物质,用环己烷萃取,在激发波长378nm,荧光波长518nm处测定其荧光强度。蜂蜜中硒含量范围:0.10～0.82μg/g。表明:蜂蜜应视为天然富硒营养品。     

乳酸杆菌益生作用机制的研究进展

乳酸杆菌作为益生菌广泛用于人和动物。本文综述了乳酸杆菌改善宿主健康的机制。乳酸杆菌可通过产生抗菌物质如乳酸、过氧化氢、细菌素,或者通过竞争营养或肠道黏附位点来抑制致病菌;通过诱导黏附素的分泌或阻止细胞凋亡而增强肠道的屏障功能,从而保护肠道。文章重点讨论了乳酸杆菌表面成分（表面蛋白、脂磷壁酸和肽聚糖）与肠道受体（Ｃ型凝集素受体、Ｔｏｌｌ样受体和 Ｎｏｄ样受体）,阐述了他们结合后启动免疫调节信号,调控肠道免疫功能以发挥改善健康作用的机制。     

Effects of size of ingestively masticated fragments of plant tissues on kinetics of digestion of NDF

Ingestively masticated fragments were collected and sized via sieving. Different sizes of esophageal masticate and ruminal digesta fragments, and ground fragments of larger masticated pieces were incubated in vitro, and undigested NDF remaining at intervals of up to 168 h of incubation was determined. The ruminal age-dependent time delay (tau) for onset of digestion of NDF was positively correlated (P < 0.004) with the mean sieve aperture estimated to retain 50% of the fragments between successive sieve apertures (MRA). Degradation rate of potentially degradable NDF (PDF) and level of indigestible NDF were not related (P > 0.10) to MRA of masticated and ground fragments. Estimates of tau were positively related to MRA, with slopes of bermudagrass < corn silage < ruminal fragments of corn silage. It was concluded that fragment size-, and consequently, ruminal age-dependent onset of PDF degradation of a mixture of different fragment sizes results in an age-dependent rate of degradation of the more rapidly degrading of two subentities of PDF. Models are proposed that assume a tau before onset of simultaneous degradation of PDF from two pools characterized as having gamma-modeled age-dependency and age-constant rates. The ruminal age-dependent pool seems to be associated with the faster-degrading pool, and its rate parameter increases with range in MRA in the population of fragments. Conceptually, the ruminal age-dependent rate parameter for PDF degradation seems to represent a composite of several effects: 1) effects of the size-dependent tau; 2) range in MRA of the population of ingestively masticated fragments; and 3) subentities of PDF that degrade via more rapid age-dependent rates compared with subentities of PDF that degrade via age-constant rates. The estimated fractional rates of ruminative comminution of ingestively masticated fragments (0.060 to 0.075/h) were of a magnitude similar to the mean fractional rates of PDF digestion (0.030 to 0.085/h), which implies that ruminative comminution may be first-limiting to fractional rate of PDF digestion. The in vivo roles of ingestive and ruminative mastication of fragments on PDF degradation must be considered in any kinetic system for estimating PDF digestion in the rumen. These results and others in the literature suggest that the rate of surface area exposure rather than intrinsic chemical attributes of PDF may be first-limiting to degradation rate of PDF in vivo.