葡萄中糖基化花色苷研究进展

葡萄果实与葡萄酒的颜色由其所含花色苷的种类和含量决定,而花色苷是由花色素经过糖基化修饰转变而成,所以糖基化修饰在葡萄果实花色苷合成途径中起着重要作用。葡萄果实中的糖基化花色苷主要包括花色素的3–O–葡萄糖基和3,5–O–双葡萄糖基,即花色素单糖苷和花色素双糖苷,糖基化花色苷的组成是决定红葡萄酒品质的关键因素之一。对糖基化花色苷在葡萄果实中的组成及其对葡萄酒颜色和稳定性的影响进行了简要介绍,重点对花色素单糖苷和花色素双糖苷合成的关键酶基因以及转录因子进行了综述,以期为葡萄果实糖基化花色苷合成的调控机理的全面揭示和优质红色酿酒葡萄品种的选育提供信息。     

植物类黄酮生物合成相关UDP–糖基转移酶研究进展

类黄酮是人类膳食和观赏园艺植物中重要的多酚类物质,因其广泛的生物活性及重要的生物学功能而倍受关注。植物尿苷二磷酸糖基转移酶(Uridine diphosphateglycosyltransferase,UGT)催化类黄酮生物合成的最后一步从而形成多种多样的糖苷衍生物。近年来,大量UGT基因家族被分析,类黄酮合成相关糖基转移酶也陆续被鉴别报道。本文综述了植物类黄酮生物合成相关UGT的生物化学及分子生物学研究进展,重点对参与不同类黄酮糖基化的UGT体外重组蛋白活性及转基因功能分析等试验证据进行归纳,并介绍了相关的微生物工程,以期为植物类黄酮代谢和其调控原理及生物技术研究提供参考。     

滇牡丹类黄酮5-O-葡萄糖基转移酶基因的鉴定及表达分析

以野生黄花滇牡丹(Paeonia delavayi)为试材,采用RT-PCR技术,克隆得到一个具完整开放阅读框的类黄酮5-O-葡萄糖基转移酶(Pd5GT)基因,并对其进行生物信息学分析和转录模式分析,以期为研究滇牡丹花色素形成机理,滇牡丹糖基转移酶功能鉴定及花卉品质改良提供理论基础。结果表明:该基因全长1 410bp,编码469个氨基酸(GenBank登录号:ARA67364);生物信息学分析发现Pd5GT蛋白C末端含有PSPG盒子,其氨基酸序列为WCSQVEVLSHPSLGCFVTHCGWNSTTESLVCGVPVVAFPQWTDQGTNAKL,与已知功能的5GT蛋白序列聚为一类;该基因在茎、叶中微弱表达,在花中大量表达,在不同颜色的花瓣中均可大量表达。综上所述Pd5GT基因可能编码5-O-糖基转移酶,具有一定的组织特异性,花色特异性不明显。     

桑树类黄酮3–O–葡萄糖基转移酶基因的鉴定及主效基因功能分析

根据同源比对,从川桑(Morus notabilis)基因组数据库(morus.swu.edu.cn/morusdb/)中鉴定类黄酮3–O–葡萄糖基转移酶基因(MaUFGT)家族成员。采用实时荧光定量PCR(q RT-PCR)分析MaUFGT在桑树各组织和发育期的表达水平。随着果实发育成熟,MaUFGT1、MaUFGT2和MaUFGT3的表达模式相似,均呈上升趋势;在从顶芽依次向下不同叶位中,3个UFGT基因表达呈现先降低后升高,再降低又升高的趋势;在幼茎皮层和托叶中大量表达,幼茎表皮和木质部、叶柄中表达量较低,有的甚至不表达。MaUFGT2的表达量在3个基因中都是最高的,推测其是该基因家族的主效基因。从桑树品种‘嘉陵40’成熟果实中克隆了UFGT2基因,命名为MaUFGT2,登录号KP455729.1。其c DNA全长为1 386 bp,编码461个氨基酸,推测蛋白质分子量约为51 k D。序列比对结果发现所编码蛋白在不同物种间保守性不高。将MaUFGT2克隆到p ET-28a(+)原核表达载体后在大肠杆菌BL21(DE3)中进行诱导表达,表达产物经SDS-PAGE分析显示,融合蛋白大小约为55 k D,主要以包涵体形式表达,在上清液中也有少量表达。MaUFGT2蛋白经纯化和复性后,最后通过高效液相色谱(HPLC)分析该蛋白的酶活性,结果表明,体外酶活性鉴定MaUFGT2能够催化UDP葡萄糖转移至槲皮素形成槲皮素3–β–D–葡萄糖苷,验证了其具有糖基转移酶的功能。     

银杏类黄酮糖基转移酶基因全长序列克隆及表达分析

 以银杏（Ginkgo biloba L.）雄株叶片为试材,采用同源基因克隆及RACE-PCR方法,克隆到了类黄酮糖基转移酶（UDP-glycose：flavonoid glycosyltransferase,UFGT）基因GbUFGT的全长cDNA序列,其在GenBank中的注册号为JN640564.2。该基因编码区长1 491 bp,编码496个氨基酸。GbUFGT蛋白具有保守的PSPG基序、UDP–葡萄糖基转移酶和UDP–葡萄糖醛酸基转移酶结构域,与其他植物中的UFGT蛋白同源性较高。GbUFGT基因组序列与其cDNA序列相同,无内含子。半定量RT-PCR结果表明,GbUFGT在整个银杏叶片发育期均可较高水平的表达,且不同发育期表达水平无明显变化,属非发育时期特异性基因。     

苹果细胞分裂素O–糖基转移酶基因MdZOG1的分离与功能鉴定

以‘嘎拉’苹果为材料,采用同源克隆和PCR技术分离了苹果细胞分裂素O–糖基转移酶基因MdZOG1。MdZOG1的开放阅读框(ORF)长度为762bp,编码含有253个氨基酸的蛋白。系统进化树分析显示,MdZOG1与PbZOG1亲缘关系最近。基因表达分析显示MdZOG1主要在苹果根和茎中表达,在花和果实中的表达量较低。通过农杆菌介导的遗传转化获得转MdZOG1拟南芥和烟草。干旱处理试验结果显示:超量表达MdZOG1显著提高拟南芥和烟草植株的抗旱能力,表明苹果细胞分裂素O–糖基转移酶在植物抗旱胁迫中发挥重要作用。     

金花茶和白色山茶及其3个杂交品种类黄酮成分与花色的关系

以金花茶(Camellianitidissima,深黄色)和山茶(C.japonica,白色)及其杂交品种(淡黄色)为试验材料,按照CIE L~*a~*b~*表色系法测量其花色,利用超高效液相色谱—四极杆—飞行时间质谱(UPLC-Q-TOF-MS)联用技术定性定量分析其类黄酮成分与含量,运用多元线性回归方法研究其花色与类黄酮成分之间的关系。在金花茶和白色山茶及其3个杂交品种中共检测到10种类黄酮成分,其中天竺葵素–3–O–葡萄糖苷(Pg3G)、木犀草素–7–O–芸香糖苷(Lu7R)、圣草素(Er)和染料木苷(Gin)为金花茶中首次发现,而在白色山茶品种‘银白查理斯’和‘白凤’中未检测到Pg3G、Er和Gin,Lu7R含量极低。金花茶中主要成分为槲皮素–3–O–葡萄糖苷(Qu3G)、槲皮素–3–O–芸香糖苷(Qu3R)、槲皮素–7–O–葡萄糖苷(Qu7G)、山萘酚–3–O–葡萄糖苷(Km3G)、Pg3G和Lu7R。杂交品种中木犀草素(Lu)、山萘酚(Km)和Er含量高于双亲,其余成分及类黄酮总量介于双亲之间。Qu3G和Qu3R是决定金花茶及其与白色山茶杂交的品种花瓣呈现黄色的主要成分,Qu3G和Qu3R含量的增加导致花色显著变黄;Qu3G含量的积累显著增加了花色鲜艳程度,Pg3G影响色调。     

欧洲葡萄VvMYB6正向调控花青素合成

从欧洲葡萄‘粉红亚都蜜’中克隆到1个MYB转录因子基因VvMYB6。VvMYB6蛋白定位在细胞核,其N端包含1个保守的R2R3结构域。在葡萄中,VvMYB6主要在在根、花器官及果实发育早期表达。在烟草中异位表达VvMYB6,显著促进花瓣和雄蕊中花青素的积累;代谢组分析发现,相比野生型,转基因植株花中累积高含量的飞燕草色素和矢车菊色素。转基因烟草植株中查尔酮合酶(CHS)、查尔酮异构酶(CHI)、黄烷酮4–还原酶(DFR)、花青素合酶(ANS)和UDP葡萄糖–类黄酮–O–葡萄糖基转移酶(UFGT)基因表达显著上调。结果表明VvMYB6正向调控花青素合成。     

鱼腥草糖基转移酶基因UGT75C1 的克隆及原核#br# 表达

 根据已经获得的鱼腥草UGT75C1 转录本序列设计1 对引物,采用RT-PCR 方法获得UGT75C1 基因cDNA 序列,并对UGT75C1 蛋白进行理化性质分析,并预测该蛋白功能;利用实时荧光定量PCR 方法检测了UGT75C1 基因在鱼腥草的地下茎、地上茎、叶、花中的表达情况,将克隆得到的UGT75C1 基因完整开放阅读框连接到原核表达载体pGEX4T-1 上,转化大肠杆菌E. coli BL21（DE3）,通过IPTG 诱导表达,SDS-PAGE 检测表达产物。克隆获得的UGT75C1 基因长为1 787 bp,开放阅读框1 461 bp, 编码486 个氨基酸。生物信息学预测UGT75C1 蛋白含跨膜区,不含信号肽,具有糖基转移酶的PSPG motif。 UGT75C1 在鱼腥草的叶片中表达丰度最高,其他器官中表达量相对较低,花中表达量最低;该基因原核 表达产物与预期大小一致,显示原核表达成功,为下一步研究其功能奠定了基础。     

鱼腥草糖基转移酶基因UGT75C1的克隆及原核表达

根据已经获得的鱼腥草UGT75C1转录本序列设计1对引物,采用RT-PCR方法获得UGT75C1基因cDNA序列,并对UGT75C1蛋白进行理化性质分析,并预测该蛋白功能;利用实时荧光定量PCR方法检测了UGT75C1基因在鱼腥草的地下茎、地上茎、叶、花中的表达情况,将克隆得到的UGT75C1基因完整开放阅读框连接到原核表达载体pGEX4T-1上,转化大肠杆菌E.coli BL21(DE3),通过IPTG诱导表达,SDS-PAGE检测表达产物。克隆获得的UGT75C1基因长为1 787 bp,开放阅读框1 461 bp,编码486个氨基酸。生物信息学预测UGT75C1蛋白含跨膜区,不含信号肽,具有糖基转移酶的PSPG motif。UGT75C1在鱼腥草的叶片中表达丰度最高,其他器官中表达量相对较低,花中表达量最低;该基因原核表达产物与预期大小一致,显示原核表达成功,为下一步研究其功能奠定了基础。     

利用VIGS技术研究草莓FaMYB5的功能

以‘丰香’草莓(Fragaria×ananassa‘Toyonaka’)为材料,采用病毒诱导的基因沉默技术(Virus-induced Gene Silencing,VIGS)对果实中类黄酮化合物代谢相关转录因子基因FaMYB5进行沉默,并对沉默后果实类黄酮化合物代谢途径相关的结构基因和其他转录因子基因表达量进行半定量RT-PCR及RT-qPCR分析。并分别采用HPLC和香草醛—硫酸比色法对沉默后果实中花青素苷和原花青素含量进行测定。成功构建了pTRV2-FaMYB5的VIGS沉默载体,并建立了草莓果实VIGS沉默体系,FaMYB5基因沉默效率达60%;FaMYB5基因沉默处理与阴性对照相比,草莓类黄酮化合物代谢途径相关结构基因和转录因子表达量均发生改变,其中FaMYB9、FaLAR、FaDFR、FaANR表达量显著增加,从而导致果实中原花青素含量增加;而花青素合成相关基因FaANS的表达量减少1/2,FaMYB10表达量变化并不显著。此外,bHLH家族的转录因子基因FabHLH3和FabHLH3Δ随着FaMYB5的沉默表达量显著下降,而FaGL3显著升高。结果进一步证明FaMYB5转录因子对草莓类黄酮化合物代谢途径中的原花青素合成途径起负调控作用。     

柑橘CHS基因序列多态性及表达水平对类黄酮生物合成的影响

查尔酮的合成是类黄酮生物合成途径中的一个关键节点。从10个柑橘种质中克隆了查尔酮合成酶(chalcone synthase,CHS)基因,并对其不同时期的果实和叶片中的类黄酮含量进行了测定,分析了CHS基因的序列多态性与类黄酮含量之间的关系;同时通过qRT-PCR检测了CHS基因在不同种质之间以及同一种质的不同组织间的表达差异。结果表明,柑橘CHS基因的核苷酸序列高度保守,相似度达98%以上。聚类分析表明,CHS氨基酸序列的多态性有物种特异性,而且与类黄酮含量有一定的相关性。CHS基因的表达水平在不同种质、部位及生长发育时期有显著差异,这些差异与类黄酮的含量有显著的相关性,说明CHS基因对类黄酮的生物合成有明显影响。     

‘纽荷尔’脐橙与‘尤力克’柠檬种间体细胞杂种的代谢特征分析

利用GC–MS(气相色谱—质谱)测定柑橘种间体细胞杂种——‘纽荷尔’脐橙(Citrus sinensis Osbeck)+‘尤力克’柠檬[Citrus limon(L.)Burm. F.]和其两个融合亲本果实的初生代谢物含量,包括可溶性糖、有机酸、氨基酸和脂肪酸;利用LC–MS(液相色谱—质谱)测定果实类黄酮含量,综合评估体细胞杂种果实的代谢特征。结果表明,体细胞杂种初生代谢物组成总体偏向‘尤力克’柠檬,苹果酸、柠檬酸和脂肪酸含量均高于两亲本,大多数氨基酸含量介于两亲本之间。体细胞杂种中共检测到48种类黄酮,整体偏向柠檬亲本;其中有33种物质含量介于两亲本之间,15种高于或低于两亲本。     

Glucuronidation of emodin in human liver and intestinal microsomes

AIM:To investigate the glucuronidation of emodin in human liver and intestinal microsomes, and to elucidate the UDP-glucuronosyltransferase(UGT) isoforms involved in emodin glucuronidation. METHODS:After incubation of emodin using in vitro human liver or intestinal microsomal system,ultra-performance liquid chromatography(UPLC) was utilized to determine the glucuronides of emodin. Mass spectrum(MS) and nuclear magnetic resonance(NMR) were employed to elucidate the structures of metabolite. Screening assays with recombinant human UGTs were used to identify the UGT isoforms involved in the glucuronidation of emodin. RESULTS:Only one metabolite was identified and elucidated to be emodin-O-monoglucuronide. The metabolic behavior of emodin was followed typical monophasic Michaelis-Menten kinetics. Except UGT1A4 and UGT2B17, the other 10 UGTs were determined to participate in the glucuronidation of emodin. CONCLUSION:Emodin-O-monoglucuronide is the only metabolite of emodin in the incubation system of human liver and intestinal microsome. Different microsomes are responsible for the metabolism of emodin in different organs/regions of the digestive system. The glucuronidation of emodin in the intestine contributes significantly to that of emodin in the liver.     

依据多倍体形态特征快速高效发掘柑橘四倍体

基于柑橘多胚性品种存在珠心细胞自然加倍的特点，建立了基于种子催芽、生长室实生播种、幼苗“观根辨叶看油胞”形态初选和流式细胞仪倍性鉴定的发掘柑橘四倍体的快速方法。采用该方法，分别从无酸甜橙、红江橙、贡柑、年橘、新会柑、滑皮金柑的432、506、1 356、1 870、2 749和685株实生苗中，发掘出疑似四倍体5、6、5、17、45、7株；通过倍性检测，从上述6个品种分别获得四倍体4、5、5、14、39、5株，形态初选准确率分别为80.0%、83.3%、100.0%、82.4%、86.7%和71.4%。与之前的四倍体发掘方法相比，本方法四倍体初选准确率高，并且从种子播种到获得四倍体植株耗时不超过40 d。SSR分子鉴定表明，所鉴定的四倍体均来自其二倍体品种珠心细胞自然加倍形成的双二倍体，为柑橘三倍体无核育种提供了珍贵的四倍体亲本资源。     

柑橘中类黄酮的组成与代谢研究进展

柑橘是人类膳食中类黄酮的主要来源之一。类黄酮对人体健康有多方面的生理功能,且其抗癌、抗病毒、抗炎及抑菌效果可能基于其强抗氧化活性。柑橘中的类黄酮类物质分为黄烷酮、黄酮、黄酮醇、二氢黄酮醇和花色苷等几类,且以黄烷酮糖苷类含量最为丰富。柑橘中类黄酮组成和含量因种质和组织部位而异,柚果实中含有大量苦味的新橘皮糖苷类,而甜橙和橘果实中以无苦味的柚皮芸香糖苷类为主。目前,对类黄酮代谢途径的认识主要局限于其主通路上,但对类黄酮糖基化、酰基化以及甲基化等相关的基因和酶类研究较少。随着柑橘类黄酮代谢研究的深入,其积累和分布的遗传机理将逐渐得以揭示,这将会为培育功能性柑橘新种质提供理论依据。     

Expression of chalcone synthase and chalcone isomerase genes and accumulation of corresponding flavonoids during fruit maturation of Guoqing No. 4 satsuma mandarin (Citrus unshiu Marcow)

Chalcone synthase (CHS) and chalcone isomerase (CHI) are two key genes involved in flavonoid biosynthesis. They were both cloned from Guoqing No. 4 satsuma mandarin (Citrus unshiu Marcow), and their relative expression and accumulation of corresponding flavonoid components during fruit maturation were investigated by real-time PCR and HPLC techniques, respectively. During fruit maturation, expression of CHS and CHI genes declined gradually in peels, as well as the concentrations of total flavonoids, trans-chalcone, narirutin and hesperidin; in pulps, however, expression of both genes showed an approximately uptrend, and the concentrations of total flavonoids and those three components were detected in a lower level without significant changes among different developmental periods (P < 0.05). This research confirmed that expression of CHS and CHI genes was positively correlated with flavonoid accumulation and overexpression of them could be a potential approach to produce massive desired flavonoids in citrus fruits.     

避雨栽培对金柑留树保鲜果实品质的影响

以阳朔金柑为试材,从2010年12月20日至2011年4月15日进行了盖膜避雨栽培处理,以露地栽培为对照,分析阳朔金柑留树保鲜期间果实品质动态变化,以探讨避雨栽培对金柑留树保鲜过程中果实品质的影响。结果表明:采用避雨栽培留树保鲜技术,可以延长果实采收期至翌年4月中旬,留在树上的好果率仍有98.9%,避雨栽培不但能缓解留树保鲜金柑果实硬度的降低,保持后期较高的VC含量,而且能有效增加果实可溶性固形物含量、固酸比和糖酸比。在整个留树保鲜过程中,盖膜处理的果实硬度比露地栽培的高10.08%～14.26%,可溶性固形物比对照高2.12%～5.86%,可滴定酸比对照低13.64%～14.29%;盖膜处理的金柑果实可溶性糖、固酸比和糖酸比均高于对照。留树保鲜的金柑果实VC含量呈现先升后降的趋势,留树保鲜第2个月达到最大值,第2个月后金柑果实VC含量迅速下降,但盖膜处理的金柑果实VC含量比对照高8.69%～14.73%。     

Flavonoid composition in frost-resistant Rhododendron cultivars grown in Poland

A relationship was found between flavonoid concentration in rhododendron (Rhododendron L.) leaves and their frost resistance. The flavonoid content in various taxons of rhododendrons bred in Poland was compared with the extent of injury caused by the action of sub-zero temperatures. High performance liquid chromatography (HPLC) was used to analyze flavonoids and their glycosides. The results suggest that flavonoid concentrations in rhododendron tissues can be a measure of their resistance to low temperatures and can be used as a criterion in breeding.