细粒棘球绦虫原头蚴microRNA表达谱分析

旨在解析miRNA在细粒棘球绦虫原头蚴中的表达谱特性,为进一步揭示miRNA在细粒棘球绦虫原头蚴发育中的作用及调控机制提供理论依据。从患病绵羊肝无菌采集细粒棘球绦虫原头蚴,提取总RNA,构建原头蚴miRNA文库,利用RNA sequencing技术进行测序分析。结果表明,本研究从细粒棘球绦虫原头蚴中分离得到109个已知的miRNA分子,同时得到189个新的miRNA发夹前体分子。靶基因的预测结果显示,已知miRNA共有132个靶基因,而新发现的miRNA共有3 152个靶基因。进一步的研究发现这些miRNA分子广泛参与虫体生长发育相关的关键信号通路,诸如wnt、cAMP、Hedgehog、NF-κB、Notch以及胆酸盐等信号通路,研究又进一步采用实时荧光定量PCR以及原位杂交技术对虫体经典wnt信号通路相关的miRNA分子以及其靶标基因进行了差异表达以及组织定位研究。结果提示,HG328413.1_36258和β-catenin、HG328414.1_36364*和dis以及HG328399.1_25846和axin可能存在潜在的调控关系。综上所述,本研究在细粒棘球绦虫原头蚴中发现了大量的新的miRNA分子,丰富了原头蚴miRNA的数据,为进一步解析miRNA在细粒棘球绦虫原头蚴发育中的作用奠定了基础。     

细粒棘球绦虫TSP33基因的克隆、生物信息学及表达分析

旨在分析细粒棘球绦虫TSP33基因的结构及其在细粒棘球绦虫不同发育阶段的表达情况,预测其作为细粒棘球绦虫诊断抗原的潜在价值。从GenBank中获得Eg-TSP33的cDNA序列并设计特异性引物,提取原头蚴总RNA,反转录cDNA,以cDNA为模板进行PCR扩增,将PCR产物克隆到大肠埃希菌中,测序并进行生物信息学分析。TSP33cDNA全长864bp,编码277个氨基酸,Eg-TSP33的预测分子质量为32.11ku,预测等电点为8.62。RT-PCR结果显示,Eg-TSP33在细粒棘球绦虫成虫、包囊壁及原头蚴中均有表达,且在包囊壁中表达量较多。结果说明,Eg-TSP33可能在细粒棘球绦虫发育过程中可能具有重要作用,为Eg-TSP33分子的诊断价值研究奠定了基础。     

细粒棘球绦虫基因型与抗原研究进展

细粒棘球绦虫（Echinococcus granulosus,坛）是一种重要的人兽共惠寄生虫。现已报道细粒棘球绦虫有10个基因型（G1～G10）,我国仅发现G1和G6。细粒棘球绦虫六钩蚴阶段的Eg95,原头蚴阶段的EgFABP,成虫阶段的EgM9和Eg31分别被认为是最有前途的用于免疫保护的抗原。其中Eg95基因工程疫苗已经商业化生产,对羊免疫保护率达到了95％以上。     

细粒棘球绦虫原头蚴lncRNA表达谱分析

本研究旨在解析lncRNA在细粒棘球绦虫原头蚴中的表达谱特性,为进一步揭示lncRNA在细粒棘球绦虫原头蚴发育中的作用及调控机制提供理论依据。从患病绵羊肝无菌采集细粒棘球绦虫原头蚴,提取总RNA,构建原头蚴lncRNA文库,利用RNA sequencing技术进行测序分析。结果表明,首次从细粒棘球绦虫原头蚴中鉴定出609个新的lncRNA分子。其中intergenic lncRNA有431个,intronic lncRNA有11个,anti-sense lncRNA有68个,sence lncRNA有99个。GO分析表明,其表达量前200的lncRNA分子主要与MAP激酶的负调控、SMC结合复合物、IMP的生物合成以及乙酰转移酶激活剂活性相关。KEGG分析结果表明,其表达量前200的lncRNA分子主要与细胞凋亡、萜类骨架生物合成、碳代谢以及背腹轴形成相关。cis分析结果表明,在这609个新的lncRNA分子中,与虫体Wnt信号通路、Hedgehog信号通路、NF-κB信号通路、cAMP信号通路、Notch信号通路、胆酸盐信号通路以及背腹轴信号通路相关的lncRNA分子分别有79、31、10、128、43、84和73个。qRT-PCR的验证结果表明,表达量前10的lncRNA分子与测序结果一致。RNA荧光探针原位杂交结果表明,高表达的lncRNA分子在细粒棘球绦虫原头蚴吸盘以及表皮均有表达。综上所述,本研究首次解析了细粒棘球绦虫原头蚴中lncRNA的表达谱特性,丰富了细粒棘球绦虫lncRNA的数据,为进一步解析lncRNA在细粒棘球绦虫原头蚴发育中的作用奠定了基础。     

细粒棘球绦虫半胱氨酸蛋白酶抑制剂基因的克隆、表达及诊断价值的初步评价

探究细粒棘球绦虫半胱氨酸蛋白酶抑制剂的基本特性并初步评价其诊断价值,旨在为细粒棘球绦虫的防控提供依据。本研究原核表达出Eg-cystatin重组蛋白并对其进行生物信息学、免疫印迹分析,用荧光免疫定位的方法检测该蛋白质的分布情况,并以绵羊细粒棘球蚴阳性血清评价Eg-cystatin重组蛋白的诊断价值。结果如下:Eg-cystatin生物信息学分析结果显示,该蛋白质含有一个N端信号肽以及cystatin结构域,是典型的2型半胱氨酸蛋白酶抑制剂,进化树分析显示Eg-cystatin属于绦虫cystatinⅡ型,并且与其他绦虫的cystatin相似性为72.20%~80.66%,免疫荧光定位发现该蛋白质主要分布在原头蚴的表皮和顶突钩,生发层,成虫虫体内部和虫卵。基于Eg-cystatin建立的间接ELISA方法的特异性为79.1%,敏感性为83.3%,与剖检符合率为81.25%。Eg-cystatin在成虫和幼虫时期均有表达,提示该基因与虫体生命活动息息相关,但Eg-cystatin蛋白不适合作为绵羊细粒棘球蚴病的诊断抗原候选。     

基于转录组测序分析细粒棘球绦虫原头蚴与巨噬细胞RAW264.7免疫互作相关基因

旨在解析细粒棘球绦虫原头蚴与巨噬细胞RAW264.7免疫互作相关的基因,为进一步阐明细粒棘球绦虫原头蚴调控宿主免疫反应及寄生适应机制提供理论依据。将细粒棘球绦虫原头蚴和巨噬细胞RAW264.7共培养24 h,收集原头蚴和RAW264.7细胞,提取总RNA,构建cDNA文库,利用RNA sequencing技术进行转录组测序分析。当细粒棘球绦虫原头蚴与巨噬细胞RAW264.7共培养24 h后,和0 h对照组相比,原头蚴处理组分别有435个基因的表达出现显著差异变化,其中,上调表达的基因为227个,包括HSP70、HSP10、Eg95前体分子、AgB、FABP和囊泡运输蛋白SC22B等;下调表达的基因为208个,包括EF-hand蛋白、Cathepsin、跨膜蛋白144、内固醇类受体和MAPK7等。GO分析结果表明,差异表达的基因主要富集在血红素转运、铁配位实体运输、细胞外间质、核糖核酸酶MRP复合物、丝氨酸型内肽酶抑制剂活性以及α-半乳糖苷酶活性等过程。KEGG分析结果表明,差异表达的基因主要参与剪接体、内吞作用、内质网的蛋白质处理、吞噬体、MAPK信号通路以及钙信号通路等。当巨噬细胞RAW264.7与细粒棘球绦虫原头蚴共培养24 h后,和PBS对照组相比,原头蚴处理组的RAW264.7细胞共有3 745个基因的表达出现显著变化,其中,1 159个基因出现上调表达,2 586个基因出现下调表达。GO分析结果显示,差异表达基因主要富集在代谢过程、细胞内组分、细胞内、细胞器以及膜结构细胞器等。KEGG信号通路的分析结果表明,差异表达的基因主要参与代谢通路、核糖体通路、剪接体通路、RNA转运以及泛素介导的蛋白水解等通路。同时研究随机选取了部分差异表达的基因进行了qRT-PCR验证,结果表明,其表达趋势与RNA-seq结果一致。综上所述,当细粒棘球绦虫原头蚴面对宿主巨噬细胞免疫压力时,可引起其基因的差异表达,其中,原头蚴中的AgB、FABP1和Kunitz型丝氨酸蛋白酶抑制剂等具有免疫调节作用的分子表达明显上调,推测其可能参与宿主的免疫调控,进而有利于虫体在宿主的寄生和免疫逃避。     

细粒棘球绦虫原头蚴蛋白表达谱分析

旨在探索细粒棘球绦虫原头蚴蛋白表达特性,揭示在此发育阶段虫体主要的功能蛋白以及信号通路,为揭示虫体的发育调控、筛选疫苗以及药物靶标奠定基础。本试验采用LC-MS/MS技术对虫体原头蚴表达的蛋白质进行研究,然后对获得数据进行GO、KOG以及KEGG等分析;最后采用qRT-PCR和原位杂交技术对鉴定得到的Wnt信号通路的关键基因β-catenin进行了差异表达和组织定位研究。结果显示,本研究共鉴定得到7 172个肽段,1 197个蛋白质,其中包括多个潜在的抗原蛋白质,如四跨膜蛋白超家族、6-磷酸葡萄糖酸脱氢酶、表皮抗原蛋白和烯醇酶等。信号通路分析结果显示其中632个蛋白参与276个调控通路,诸如与虫体发育紧密相关的Wnt、Notch、Hedgehog、NF-κB、cAMP以及胆酸盐信号通路。对β-catenin的验证结果显示,此基因分布于细粒棘球绦虫原头蚴顶突的小刺以及散在的细胞中,同时其相对转录量在体外培养0~10d的过程中呈递减趋势。综上,本研究解析了细粒棘球绦虫原头蚴的蛋白质表达元件,揭示了原头蚴主要的调控信号通路,为虫体的生长发育机制以及包虫病的有效防控提供了理论依据。     

细粒棘球绦虫EgM123基因序列分析及EgM家族基因在虫体不同发育阶段的差异表达分析

对细粒棘球绦虫EgM123基因进行分子克隆和生物信息学分析,同时对EgM家族基因在虫体不同发育阶段的mRNA转录水平进行初步研究。采集绵羊肝脏包囊中原头蚴,提取总RNA,通过RT-PCR获取EgM123纯化的PCR产物,克隆到pGEM-T载体并测序,对测序结果进行结构和功能的预测分析。以Actin基因为内参基因,采用SYBR Green real-time RT-PCR技术,对不同发育阶段,即其原头蚴和成虫的EgM4、EgM9、EgM123的表达量进行检测。结果表明,EgM123基因ORF为594bp,编码197个氨基酸,蛋白分子质量为21.959ku,等电点为7.94。EgM123蛋白无信号肽、跨膜螺旋区和卷曲螺旋结构,是一种亲水性的可溶性蛋白质,存在23个磷酸化位点。根据亚细胞定位预测显示,EgM123蛋白主要位于细胞核内。二级结构预测含α-螺旋9.64%、β-折叠22.84%、无规则卷曲62.94%。EgM123氨基酸序列中有6个潜在的抗原表位。RT-qPCR结果显示,成虫阶段EgM家族基因表达量极显著高于原头蚴阶段。在发育的同一阶段,EgM123基因极显著高于EgM4、EgM9基因的表达量。通过EgM家族基因在虫体不同发育阶段的mRNA转录水平,EgM123基因在虫体成虫阶段高表达,以期为筛选细粒棘球绦虫终末宿主疫苗候选基因提供理论依据。     

包虫病的防治效果

<正>危害牛羊的包虫病主要有细粒棘球蚴病、多头蚴病、细颈囊尾蚴病(也称三蚴病)。成虫隶属带科的细粒棘球绦虫、多头带绦虫和泡状带绦虫的中期绦虫体,即包虫囊,终宿主感染原头蚴发育为     

细粒棘球绦虫免疫相关抗原基因的筛选及原核表达

为了筛选获得细粒棘球绦虫的免疫相关抗原基因,试验采用SEREX技术对细粒棘球绦虫cDNA文库进行相关抗原筛选,并对获得的细粒棘球绦虫特异性基因进行原核表达与鉴定。结果表明:共获得149个阳性噬菌斑,对其进行PCR扩增和序列分析得到与棘球绦虫属相关的基因序列10个,其中有864 bp的开放性阅读框序列;编码288个氨基酸;经NCBI BLAST氨基酸同源性分析,与多房棘球绦虫诊断抗原gp50的氨基酸序列的同源性为92%,是一个未知的新基因,命名为Ediag A864;经原核表达得到大小约为51 ku的重组蛋白,经Western-blot分析具有良好的反应原性。     

羊源D型多杀性巴氏杆菌的分离鉴定及毒力基因检测

为了确定石河子地区规模化羊场出现呼吸道症状死亡羊的细菌性病原,采用常规细菌分离鉴定方法、细菌16SrRNA序列分析以及多杀性巴氏杆菌特异性基因kmt,从病变肺组织分离鉴定细菌,利用5个荚膜血清型特异性基因确定其血清型,扩增分离株的16个毒力相关基因,分析分离菌致病性和对常用抗菌药物的耐药性。结果表明,从病羊的病变肺组织中分离鉴定到一株血清D型多杀性巴氏杆菌,具有较强的致病性;携带8个毒力相关基因,其片段序列与NCBI上己公布的多杀性巴氏杆菌参考株同源性在99%以上;分离株对青霉素、林可霉素、庆大霉素、复方新诺明耐药,对其他23种药物敏感。     

致动物脑膜炎粪肠球菌人工感染小鼠脑部模型的建立

为了构建粪肠球菌人工感染小鼠脑部损伤模型,以清洁级昆明小鼠为实验动物,将实验室保存的致羔羊脑膜炎粪肠球菌进行复苏,用寇氏法测定小鼠半数致死量(LD50),并以LD50剂量、1/2 LD50的剂量、2/3 LD50剂量感染小鼠,观察临床症状,选择2、4、8、12、24、36、48、60、72、84 h共10个时间点,无菌取其脑部、内脏组织进行细菌的分离鉴定,并观察病理组织学变化。结果显示,粪肠球菌的LD50为7.59×10^8CFU;感染小鼠后,其致死率1/2 LD50剂量组为3.7%,小于2/3 LD50剂量组的13.0%;1/2 LD50剂量组脑组织开始出现病理变化是在感染后12 h,晚于2/3 LD50剂量组(6 h),病理变化与后者相比较轻。结果表明,选择以2/3 LD50剂量为小鼠感染模型的最佳剂量。该动物模型的建立为进一步研究粪肠球菌感染小鼠导致脑炎奠定了基础。     

子宫内膜中TLR4的定位及pcDNA3.1-TLR4载体的构建

试验旨在研究TLR4(Toll like receptor4)蛋白在子宫内膜组织中具体的分布与表达,从而构建TLR4真核表达载体,为TLR4在细胞水平上的功能研究提供一种技术手段.选择早期妊娠绵羊(9d、13d、17d、21d、25d)子宫组织,采用免疫组织化学和细胞免疫学抗体着色法检测各阶段子宫组织中TLR4蛋白的分布与表达,确定受体蛋白的表达部位.同时将构建的pcDNA3.1-TLR4质粒转染到确定的受体细胞,检测TLR4蛋白的表达水平.结果表明:TLR4蛋白在子宫内膜各部位均有表达,呈一定的动态时空模式,且第17d胚胎附植后主要表达于内膜基质细胞;重组质粒转染到基质细胞后,TLR4蛋白的表达水平明显增强.此研究成功构建pcDNA3.1-TLR4表达载体,为TLR4在生殖细胞免疫学功能的研究奠定了一定的理论基础.     

病例教学法在兽医临床诊断学教学中的探索与实践

兽医临床诊断学是动物医学专业重要的专业基础课,具有很强的实践性。通过病例教学法的实施,有效的激发了学生学习兴趣,培养了学生临床思维的能力,提高了教学效果。本文结合兽医临床诊断学的特点,总结近年来的教学成果,介绍了病例教学法在课程教学中的意义、实施方法及注意事项等,以期进一步提高兽医临床诊断学的教学效果。     

新疆昭苏牧区放牧绵羊硒元素营养状况调查

为了解新疆昭苏牧区牧草中硒含量以及放牧绵羊硒的营养状况,分别于春、夏、秋、冬四季,选择3块地势平坦、具代表性样地,采用模拟采食法留茬3 cm采集羊只所食牧草,同时选取成年母羊和育成母羊各10只,测定羊毛、血清、肝脏、心肌、肾脏、脾脏和肌肉及牧草中硒含量。结果:四季牧草中硒含量分别为2.23、3.51、3.05和2.04μg/kg,各季节间差异不显著(P>0.05);成年母羊羊毛、血清、肝脏、心肌、肾脏、脾脏和肌肉中硒含量四季平均值分别为1.738μg/kg、0.039 mg/L、0.453 mg/kg、0.024 mg/kg、0.367 mg/kg、0.050 mg/kg和0.017 mg/kg;育成母羊分别为1.888μg/kg、0.034 mg/L、0.260 mg/kg、0.028 mg/kg、0.318 mg/kg、0.029 mg/kg和0.020 mg/kg。分析结果表明,昭苏牧区放牧成年母羊与放牧育成母羊处于缺硒状态,放牧过程中需要补饲硒。     

围产期低能饲粮添加过瘤胃赖氨酸对初乳质量、断奶前犊牛生长性能的影响

本试验旨在研究围产期低能饲粮添加过瘤胃赖氨酸(RPL)对初乳质量、断奶前犊牛生长性能和瘤胃发酵的影响。试验采用2×2析因试验设计,即能量(产奶净能)水平设为6.40、5.73 M J/kg DM和RPL添加水平设为0、40 g/(d·头)。选取体况和预产期相近的52头第3胎荷斯坦奶牛,分为4组,分别为基础饲粮(B)组、低能饲粮(L)组、基础饲粮+RPL(BL)组和低能饲粮+RPL(LL)组,每组13头牛。试验从预产期前21天至产后犊牛断奶结束。奶牛产后第1次泌乳时采集初乳,测定初乳中总固形物、蛋白质、脂肪和乳糖、免疫球蛋白(Ig) G、IgM和IgA含量;犊牛出生当天(1日龄)、60日龄测定体重和体尺;犊牛60日龄采集瘤胃液,测定pH、氨态氮(NH3-N)和挥发性脂肪酸(VFA)浓度。结果表明:1)围产期低能饲粮显著降低了初乳总固形物、乳糖和IgM含量(P<0.05);围产母牛饲粮添加RPL对初乳乳糖含量有提高的趋势(P=0.068 2),对其他初乳指标无显著影响(P> 0.05)。2)围产期低能饲粮显著降低了母犊60日龄体重、体高、体斜长和胸围(P<0.05),显著降低了公犊60日龄体斜长和初生胸围(P<0.05)。围产母牛饲粮添加RPL有降低公犊60日龄体重的趋势(P=0.073 0)。3)围产期低能饲粮显著降低了母犊初生体躯指数(P<0.05),对母犊60日龄体躯指数有升高的趋势(P=0.059 6),对公犊初生体躯指数有降低的趋势(P=0.099 1),提高了公犊60日龄体躯指数(P<0.05),降低了公犊60日龄体长指数(P<0.05)。围产母牛饲粮添加RPL对公、母犊体尺指数没有显著影响(P>0.05)。4)围产期低能饲粮显著降低了犊牛瘤胃液中总挥发性脂肪酸、乙酸、丙酸、异丁酸、丁酸、异戊酸和戊酸浓度(P<0.05)。围产母牛饲粮添加RPL对犊牛瘤胃发酵指标无显著影响(P>0.05)。5)围产母牛饲粮能量水平与添加RPL对奶牛初乳质量指标、断奶前犊牛体重、体尺指标、体尺指数和瘤胃发酵指标均不存在交互作用(P>0.05)。综上所述,围产期低能饲粮降低了奶牛初乳质量、断奶前犊牛体重、体尺及体尺指数和瘤胃发酵指标;围产期母牛饲粮添加RPL对奶牛初乳质量和断奶前犊牛体重、体尺及体尺指数和瘤胃发酵无不利影响;围产期低能饲粮中添加RPL并不能替代正常标准能量水平饲粮。     

寒冷环境下阿勒泰羊血常规指标检测

为了探讨寒冷环境下对阿勒泰羊血常规指标的影响,本试验于冬季采集30只阿勒泰羊颈静脉血进行血常规检测。结果表明,阿勒泰羊在寒冷环境下白细胞、中间细胞、粒细胞数目上升;红细胞总数、血红蛋白含量有所下降。此结果说明寒冷环境会导致阿勒泰羊体内有炎症发生,还会导致阿勒泰羊出现贫血的情况,为冬季饲养阿勒泰羊提供技术支持.     

Zfy干扰基因对荷斯坦牛性别控制的效果

为了控制犊牛的性别,提高母犊率,通过生物技术方法,运用Zfy干扰基因载体对荷斯坦种公牛睾丸进行连续处理后,采集其精液制成性控冻精。通过小规模试验和大群中试应用,情期受胎率分别达到72.2%、65.4%,母犊率分别达到76.9%、71.6%,与普通冻精比较,母犊率分别高出29个百分点和23.7个百分点。后裔13月龄测试,其体重、胸围、体斜长等与普通冻精后裔基本一致(P>0.05)。说明这种性别控制的方法可行。     

家兔Zfx基因shRNA干扰载体构建及验证

研究主要是为了构建出针对家兔Zfx基因的shRNA重组载体及效果验证。根据家兔Zfx基因mRNA序列特征,设计出3条shRNA片段,再与线性化的pLL 3.7载体进行连接重组,最后经过qRT-PCR检测Zfx基因mRNA表达量筛选出有效重组表达载体并通过体内试验进行效果验证。结果表明:试验组shRNA-c和shRNA-f干扰效率分别为74%和67%,与空白对照组相比差异极显著(P<0.01);试验组shRNA-e干扰效果为17%,与空白对照组相比差异不显著(P>0.05)。用shRNA-c和shRNA-f进行体内试验,结果显示,两试验组雄性率分别为44.92%(P>0.05)和33.16%(P<0.01)。本试验成功构建针对家兔Zfx基因的重组载体,体内试验显示子一代出现性别偏移,说明Zfx基因对动物的性别决定有一定作用,关于导致体内验证出现反转的原因仍需进一步验证。     

驴内脏组织中脂肪沉积相关基因的差异表达

脂肪沉积相关基因在动物内脏中的异常表达与某些疾病相关。应用RT-qPCR技术分别检测2岁~3岁健康公、母新疆驴内脏器官心、脾、肾、肝、小肠、大肠和肺中脂肪沉积相关基因H-FABP、PLIN1、LPL、HSL、PPARγ和FASN的表达差异。结果显示,新疆驴内脏器官中脂肪沉积相关基因的表达,性别对基因的差异表达影响较小;在各组织间,H-FABP基因在心脏、PLIN1基因在肝脏组织中的表达都显著的高于其他组织;LPL、HSL基因在心脏、肾脏的表达量较高;PPARγ基因在脾、肺中表达最高,而FASN基因在心、脾中表达最低。研究结果可为新疆驴内脏器官有关疾病的监测与预防提供一定的参考。