山豆根多糖对PRRSV感染RAW264.7细胞存活率及分泌炎性因子的影响

[目的]探讨山豆根多糖(SSP)对猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)体外感染RAW264.7细胞存活率及分泌炎性因子水平的影响,为研发出治疗猪繁殖与呼吸综合征(PRRS)的新型兽药提供参考依据.[方法]以50、100、200和400 μg/mL SSP作用于PRRSV体外感染8h的RAW264.7细胞,通过MTT法评价SSP对PRRSV感染RAW264.7细胞存活率,ELISA检测SSP对PRRSV体外感染RAW264.7细胞培养上清液中的炎性因子TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-8、IL-10和MCP-1.[结果]PRRSV感染RAW264.7细胞8h极显著降低了细胞存活率(P<0.01,下同),而200~400 μg/mL SSP能极显著升高PRRSV感染RAW264.7细胞存活率.PRRSV感染RAW264.7细胞8h可极显著升高细胞分泌TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-8、IL-10和MCP-1水平,而SSP能有效降低PRRSV感染RAW264.7细胞分泌上述炎性因子水平,其中以200~400μg/mL SSP的抑制效果最佳.[结论]SSP通过提高炎症细胞存活率及抑制其分泌炎性因子水平,从而有效干预PRRSV感染免疫细胞的炎性反应.     

猪伪狂犬病毒体外诱导RAW264.7细胞炎症反应模型的建立

【目的】探讨猪伪狂犬病毒（Pseudorabies virus,PRV）感染对小鼠单核巨噬细胞（RAW264.7）炎症反应的影响,确定PRV的最佳感染剂量和感染时间,为建立RAW264.7细胞体外病毒感染炎症反应模型打下基础。【方法】PRV按10倍递增稀释成10-5~10-1 PRV稀释液,感染RAW264.7细胞并孵育1.5 h,弃病毒液后加入含5%胎牛血清的DMEM维持培养液继续培养,分别于继续培养2、4、8、12、24和48 h时收集细胞上清液,采用ELISA测定IL-6、IL-10、IL-1β、TNF-α、MCP-1和IFN-γ分泌水平及环氧合酶（COX-1和COX-2）活性,并以CCK-8法测定细胞活性。【结果】以PRV感染RAW264.7细胞4~48 h后均能通过PCR扩增获得PRV核酸的特异性条带,故选择4~48 h作为后续研究的PRV感染时间范围;10-2 PRV~10-1 PRV感染可显著降低RAW264.7细胞活性（P<0.05,下同）,10-3 PRV组仅在培养48 h时出现下降趋势,而10-5 PRV~10-4 PRV感染对RAW264.7细胞活性无显著影响。PRV感染RAW264.7细胞后,其胞内炎症因子IL-6、IFN-γ、TNF-α、IL-1β和MCP-1的分泌水平整体上呈升高趋势,其中10-3 PRV感染RAW264.7细胞12 h能显著或极显著（P<0.01）提高IL-6、IFN-γ、TNF-α、IL-1β和MCP-1的分泌水平;10-4 PRV~10-1 PRV感染组的IL-10分泌水平均呈升高趋势,而10-5 PRV感染组在感染8和24 h时IL-10分泌水平明显低于空白对照组,至感染48 h所有病毒感染组的IL-10分泌水平均降低;10-3 PRV~10-1 PRV感染8~24 h能有效提高RAW264.7细胞的COX-2活性,但对COX-1活性的影响不明显。【结论】PRV感染能诱导RAW264.7细胞发生炎症反应,其中10-3 PRV体外感染RAW264.7细胞8~12 h是建立RAW264.7细胞炎症反应模型的最佳条件。该模型可应用于PRV感染与RAW264.7细胞炎症反应相关干预药物的研究,为进一步揭示PRV感染机理及开发抗病毒感染药物提供理论依据。     

高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒在自然病例组织中的定位

猪繁殖与呼吸综合征（PRRS）是由猪繁殖与呼吸综合征病毒（PRRSV）引起,以怀孕母猪发生流产、早产和死胎等严重的繁殖障碍及仔猪和育肥猪发生呼吸道疾病为主要症状的传染病,是一种免疫抑制性疾病。猪感染PRRSV后的组织学病理变化主要集中在肺脏和淋巴结等器官;急性PRRS表现为败血症,全身性巨噬细胞和血管内皮细胞肿大、活化或增生,间质性肺炎,     

阿魏酸抗LPS诱导的奶牛子宫内膜上皮细胞炎性作用

[目的]为了探明阿魏酸的抗炎机制.[方法]采用组织块培养法获得奶牛子宫内膜上皮细胞.用噻唑蓝(MTT法)检测细胞活力.采用荧光定量PCR方法,分别对对照组、模型组、药物作用高、中、低剂量组在LPS作用3h、6h炎症基因IL-1β、IL-6、IL-8和TNF-α的mRNA变化进行检测.[结果]阿魏酸在一定浓度范围内对细胞增殖无显著影响.药物预处理细胞能够显著降低LPS诱导的IL-1β、IL-6、IL-8和TNF-α的mRNA表达.[结论]阿魏酸能够显著降低LPS刺激细胞后炎症细胞因子的表达,说明阿魏酸是通过抑制炎症因子的表达发挥其抗炎作用.     

猪细环病毒1型感染与猪繁殖与呼吸综合征的相关性分析

[目的]分析猪细环病毒1型(TTSuVl)感染与猪繁殖与呼吸综合征(PPRS)的发生是否存在相关性.[方法]采集40头临床疑似PRRS病猪血清和40头同群健康猪血清,确认PRRS病猪与猪繁殖与呼吸综合征病毒(PPRSV)亚临床感染猪,用荧光定量PCR方法检测TTSuV1和PRRSV载量,进行差异比较和相关性分析.[结果]常规PCR结合荧光定量PCR检测确认有31头PRRS病猪和27头PPRSV亚临床感染猪,前者PRRSV载量极显著(P＜0.01)高于后者;虽然PRRS病猪的TTSuV1载量高于PRRSV亚临床感染猪,但其差异不显著.PRRSV感染猪的血清中的TTSuV1载量与PRRSV载量之间无显著(P＞0.05)相关性.[结论]TTSuV1感染与PRRS发生之间可能没有相关性.     

呼吸道综合症病猪群病原检测与分析

应用PCR技术和免疫荧光试验对福建省某猪场以呼吸道症状为主的发病猪群进行多重病原检测和人工感染病猪肺脏淋巴结等器官的病理组织学观察。结果显示:病猪肺脏和淋巴结等病料匀浆的RT-PCR检测为PRRSV变异株阳性,但PRV、CSFV、PCV2及SIV均为阴性;免疫荧光试验结果与RT-PCR一致;将阳性病料接种Marc-145分离到1株病毒,人工感染断奶仔猪能复制出与临床自然病猪相同的临床症状和病理变化,并能回收到病毒;病理组织学观察显示人工感染濒死猪肺脏呈间质性肺炎病变。综合分析上述结果初步表明该猪群暴发的呼吸道疾病主要是由高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)变异型引起。     

马尾藻多糖对PCV-2体外感染3D4/2细胞活性及炎症相关因子的影响

首先通过MTT法检测马尾藻多糖对3D4/2细胞活性的影响,然后用ELISA法检测炎症相关因子。试验结果,PCV-2感染3D4/2细胞后明显降低细胞活性,马尾藻多糖25、50、100、200、400μg/m L处理后,均能提高感染细胞的活性;PCV-2感染3D4/2细胞后均能显著提高TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-8、IL-10、MCP-1等炎症因子的水平,马尾藻多糖处理后,25、50、100、200、400μg/m L均能在一定程度上降低TNF-α、IL-1β、IL-8、IL-10、MCP-1的分泌水平,且其中25、50μg/m L的效果最明显。结果表明,马尾藻多糖具有较好的体外抗炎作用,且其抗炎作用机制可能与其抑制炎症因子IL-1β、IL-8、IL-10、TNF-α、MCP-1等的分泌有关。     

人工感染高致病性PRRSV肺脏的病理学观察和扫描电镜的形态学变化

通过人工感染高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)察猪肺脏的组织病理学变化以及扫描电镜下的形态学变化.将14头健康猪分成试验组和对照组,用高致病性PRRSV变异株感染试验组10头猪.组织病理学变化表明,攻毒猪在第9天以渗出性炎症为主,第14天出现典型的间质性肺炎变化,第28天肺脏间质性肺炎病变基本消失.扫描电镜观察表明攻毒猪第9天肺泡壁破坏严重,肺泡腔内有大量细胞成分;第14天肺泡壁增厚,肺泡间隔出现大量增生的细胞成分,肺泡内壁粗糙并粘附着许多细胞成分.结合组织病理学和扫描电镜同步观察猪高致病性PRRS肺组织的结构变化为研究高致病性PRRSV侵害肺脏组织的机理开辟了一条新途径.     

猪繁殖与呼吸障碍综合征的诊治

一、病原 猪繁殖与呼吸障碍综合征（PRRS）是由猪繁殖与呼吸障碍综合征病毒（PRRSV）引起的母猪繁殖障碍和仔猪呼吸道症状的一种传染病。特点是受感染的猪厌食、发热,怀孕后期母猪流产、早产、死胎率可达20％以上．仔猪发生呼吸道症状．新生仔猪和断奶仔猪死亡率可高达80％,育肥猪的发病率高而死亡率低。     

抗猪FcγRⅡb多抗阻断猪繁殖与呼吸综合征病毒抗体依赖增强作用研究

为验证猪FcγRⅡb在抗体依赖增强(ADE)作用中的功能,从猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)阳性血清中提取IgG并制备F(ab′)2片段,将104 TCID50的PRRSV病毒与80μg/mL的F(ab′)2片段或抗PRRSV阳性血清(中和效价1/5.9,经128倍稀释)混合,共同感染猪肺泡巨噬细胞(PAM)和Marc-145细胞,发现亚中和滴度的阳性血清能显著增强病毒对PAM的感染,但不能增强病毒对Marc-145细胞的感染;而F(ab′)2片断不能增强病毒感染;用兔抗猪FcγRⅡb多抗孵育PAM细胞,再用上述病毒与阳性血清复合物感染PAM,结果阳性血清对病毒感染的增强作用受到明显抑制。表明猪FcγRⅡb能够介导PRRSV ADE作用。     

Evaluation of the Pathogenicity of a Highly Pathogenic Porcine Reproductive and Respiratory Syndrome Virus Variant in Piglets

Since May 2006,a highly pathogenic porcine reproductive and respiratory syndrome virus (HP-PRRSV) variant characterized by 30 amino acids deletion within its NSP2-coding region emerged and caused extensive economic losses to China's pig industry.To investigate the in vivo pathogenicity and immune responses of the newly emerging PRRSV,3 groups of 60-d-old conventional piglets were inoculated intranasally with a representative strain of the HP-PRRSV variant HuN4 with 3 different infection doses (3× 103-3× 105 TCID50).The results revealed that the virus variant caused severe disease in piglets and the significant clinical characteristics consisted of persistently high fever (41.0-41.9℃) and high morbidity and mortality (60-100％),the marked clinical signs of PRRS and severe histopathogenic damages in multiple organs.It induced rapid and intense humoral immune responses and seroconversion was detected in most infected pigs at 7 d post-infection (DPI).The virus vigorously replicated in vivo and the highest virus average titer was 9.7 log copies mL-1 serum at 7 DPI.Elevated levels of IFN-y and IL- 10 cytokine production in serum in this study were also observed.Taken together,our results demonstrated that the HP-PRRSV variant HuN4 strain is highly pathogenic for piglets and suitable to be a reference strain of highly virulent PRRSV for evaluating the efficacy of the new vaccines.     

红车轴草提取物对脂多糖应激断奶仔猪生长性能和炎性介质的影响

为研究红车轴草提取物(RCE)对脂多糖(LPS)应激的断奶仔猪生长性能和炎性介质的影响,本试验选用30头健康、平均体重为(6.86±0.14)kg的(21±1)日龄(杜×长×大)断奶仔猪,按照随机区组设计设5个处理,每个处理6个重复,每个重复1头仔猪.5个处理组仔猪分别饲喂基础日粮(非应激空白对照组)、基础日粮+LPS(LPS组)、基础日粮+LPS+0.05%RCE(0.05%RCE组)、基础日粮+LPS+0.10%RCE(0.10%RCE组)、基础日粮+LPS+0.20%RCE(0.20%RCE组).试验期21 d.在试验第7、14天,LPS组和0.05%、0.10%、0.20%RCE组仔猪每千克体重注射80μg LPS,空白对照组注射等量的生理盐水.结果表明:(1)试验第1-7天(即LPS应激前),与空白对照组、LPS组相比,0.10%RCE组仔猪的日增重显著升高(P<0.05),料重比显著降低(P<0.05),而0.05%和0.20%RCE组的日增重和料重比与空白对照组、LPS组相比无显著差异(P>0.05);试验第7-21天(即注射LPS两次之后),与空白对照组相比,LPS组的日增重和日采食量显著降低(P<0.05),料重比显著提高(P<0.05),而0.05%、0.10%和0.20%RCE组的日增重和日采食量有所下降,但差异不显著(P>0.05).(2)在第7、14天注射LPS后,与空白对照组相比,LPS组仔猪血清中的IgG含量显著降低(P<0.05),血清中白介素-6(IL-6)和肿瘤坏死因子TNF-α的含量均显著提高(P<0.05).与LPS组相比,0.05%RCE组的IgG、IL-6和TNF-α含量差异不显著(P>0.05);0.10%和0.20%RCE组的IgG含量均显著提高P<0.05),IL-6和TNF-α含量均显著降低(P<0.05);以添加0.10%RCE缓解仔猪应激效果最为明显,与LPS组相比,IgG含量提高38.65%(P<0.05),IL-6含量降低32.81%(P<0.05),TNF-α含量降低24.68%(P<0.05).可见,日粮中添加RCE可在一定程度上缓解LPS刺激导致的断奶仔猪生长性能和炎性细胞因子分泌的改变,以添加0.10%RCE效果最好.     

脂多糖对猪肺泡巨噬细胞分泌IL-1β及TNF-α的影响

研究了脂多糖的浓度、刺激时间对猪肺泡巨噬细胞分泌IL-1β、TNF-α的影响。分别用不同浓度的脂多糖和不同的刺激时间处理猪肺泡巨噬细胞,收集细胞,提取RNA,用实时荧光定量PCR方法检测IL-1β、TNF-αmRNA表达水平;同时收集培养上清,用ELISA检测试剂盒检测IL-1β、TNF-α蛋白表达水平。结果表明,脂多糖浓度(1~1000ng/mL)对IL-1β、TNF-α影响显著(P<0.05);刺激时间(1~24h)对IL-1β、TNF-α影响显著(P<0.05),且蛋白的表达水平迟于mRNA的表达水平。脂多糖诱导猪肺泡巨噬细胞分泌IL-1β、TNF-α具有剂量、时间依赖性。     

弓形虫代谢分泌抗原对仔猪IL-2、IL-4、IFN-γ和TNF-α表达水平的影响

通过免疫后攻毒的方法研究了弓形虫代谢分泌抗原(E/SA)免疫后对不同免疫组仔猪机体白细胞介素-2(IL-2)、白细胞介素-4(IL-4)、干扰素-γ(IFN-γ)和肿瘤坏死因子-α(TNF-α)含量的影响.结果表明:免疫后各免疫组仔猪的IL-2、IL-4、IFN-γ含量均不同程度的升高;其中E/SA组IL-2、IL-4和IFN-γ的水平显著升高,与对照组差异显著(P0.05),其含量分别由免疫前的105.05、105.33、67.50pg.mL-1升高到免疫后的194.03、342.50、296.50pg.mL-1;TNF-α水平变化不显著.试验证实弓形虫代谢分泌抗原疫苗能够促进仔猪IL-2、IL-4、IFN-γ的分泌,并引起宿主抗弓形虫感染的免疫应答.     

山东部分地区猪瘟与蓝耳病的流行病学调查

[目的]对山东部分地区进行猪瘟与蓝耳病的流行病学调查。[方法]采取血清学检测方法和问卷调查的方式,对山东6个地区养殖场的猪瘟(CFS)与蓝耳病(PRRS)感染情况进行流行病学调查,同时进行现场临床调查和病例剖检。[结果]在检测的598份病猪血清中,有463份为阳性,感染率为77.42%,其中377份为CFSV感染,感染率为63.04%;274份为PRRSV感染,感染率为45.82%;188份为PRRSV和CFSV混合感染,感染率为31.44%。在198份问卷调查中,44个兽医站、112个村级兽医和42个养殖场确定了CSF与PRRS的存在,并且通过现场临床调查和剖检诊断,进一步证实了2种疾病的存在。[结论]CSF和PRRS仍然是危害山东养猪业发展的主要疾病,应加强对该种病的防控工作。     

高致病性猪繁殖与呼吸综合征（PRRS）的研究

高致病性猪繁殖与呼吸综合征（PRRS）俗称蓝耳病,是由猪繁殖和呼吸综合征病毒变异株引起的一种急性高致死性疫病,该病是一种免疫抑制病,其感染宿主唯一,且常常继发其他病原感染。PRRS发病时间间隔为2～37d,一般为5d左右,任何年龄、品种猪只均可发病。猪对很多PRRSV的感染途径敏感,包括口腔、鼻腔、肌肉、腹腔和生殖道。该病传染性高,并且只要有10个或者更少的病毒粒子,就可发生PRRS。疫苗免疫是预防PRRS的重要手段之一,目前有灭活疫苗和弱毒疫苗可供使用。针对高致病性猪蓝耳病的有效防控研究正在许多科研机构深入开展,能引起猪体对PRRSV产生保护性抗体的免疫原性基因的筛选、改造和利用等相关研究正加紧进行,以期研制一种安全高效的PRRS疫苗。     

猪繁殖与呼吸综合症免疫学研究

猪繁殖与呼吸综合症是由猪繁殖与呼吸综合症病毒引起的高度传染性病毒病。笔者就呼吸综合症病毒的理化特性、生物学特征、基因组构成、病毒复制、免疫学特征以及疫苗等作一简述     

猪促炎细胞因子多重TaqMan荧光定量RT-PCR检测方法的建立及应用

为建立及应用定量检测猪促炎细胞因子mRNA表达水平的方法,从分子水平研究脑心肌炎病毒(EMCV)的致病机制,分别构建含有猪促炎细胞因子IL-1β、IL-6、TNF-α以及管家基因β-actin基因片段的重组质粒标准品,建立了检测IL-1β/β-actin、IL-6/β-actin、TNF-α/β-actin的多重TaqMan real-time PCR检测方法。标准曲线的相关系数均达到0.998以上;初始模板的检出下限均达到10拷贝/μL;只有以目标cDNA为模板,并加入特异性引物和探针的反应才能检测到荧光信号;组内与组间的变异系数均小于2%。应用所建立的检测方法,对猪源EMCV GXLC株感染仔猪心肌中IL-1β、TNF-α、IL-6mRNA的表达水平进行检测。结果表明,所建立的多重TaqMan real-time PCR检测方法灵敏度高、特异性强、重复性好,可以用于猪IL-1β、IL-6、TNF-α基因的检测及定量分析。     

CD163双等位基因编辑猪的制备及传代

【目的】猪繁殖与呼吸综合征（porcine reproductive and respiratory syndrome, PRRS）,俗称“蓝耳病”,是由猪繁殖与呼吸综合征病毒（porcine reproductive and respiratory syndrome virus, PRRSV）引起的一种高致死性传染病,对世界养猪业造成了巨大的经济损失。由于PRRSV遗传变异性较大,因此国内外并未有理想疫苗能够对此病进行有效防制。Cluster of differentiation 163（CD163）是PRRSV感染猪肺泡巨噬细胞（porcine alveolar macrophage, PAM）的受体之一,研究旨在利用CRISPR/Cas9技术结合体细胞核移植技术制备CD163基因编辑的大白猪。【方法】针对猪CD163基因的第7外显子设计构建CRISPR/Cas9基因编辑载体;转染大白猪胎儿成纤维细胞,获得基因编辑阳性细胞克隆;以基因编辑细胞为核供体、体外成熟的猪卵母细胞为核受体构建克隆胚胎;胚胎移植到受体母猪生产CD163基因编辑猪,并进行后续的扩繁试验。【结果】设计的gRNA能够高效的识别靶位点。对获得的127个细胞单克隆进行PCR和测序显示,共有21个克隆发生突变,其中14个克隆为单等位基因突变或双等位基因杂合突变,7个克隆为双等位基因纯合突变。通过体细胞核移植技术,成功获得了CD163双等位基因编辑的纯合大白猪;并获得首批F₁代CD163基因编辑仔猪,目前健康状态良好。随后将有更多的F₁代CD163基因编辑猪陆续出生。【结论】制备的无抗性筛选标记的CD163双等位基因编辑猪,能够安全并快速地为培育抗PRRSV新品种猪提供育种材料。     

猪繁殖与呼吸综合征病毒非结构蛋白2研究进展

猪繁殖与呼吸综合征(porcine reproductive and respiratory syndrome,PRRS)是由PRRS病毒(PRRSV)引起的以母猪繁殖障碍和仔猪呼吸困难、病毒血症为典型症状的一种传染性疾病,给世界养猪业带来巨大的经济损失。深入研究PRRSV的相关致病机制可为该病防控奠定理论依据。在对PRRSV的研究中,非结构蛋白2(non-structural protein 2, Nsp2)一直是研究的热点,文章综述了Nsp2与遗传变异、病毒致病性、病毒复制、免疫调控和重组疫苗与分子标签等相关的研究进展。Nsp2基因序列在对疫苗毒株的鉴别诊断中发挥重要作用。