J、K亚群禽白血病病毒的分离和囊膜蛋白(gp85)基因序列分析

为了解现阶段我国禽白血病病毒(ALV)的流行特征和演化趋势,本试验于2021—2022年从国内某鸡场采集蛋清ALV衣壳蛋白(p27)抗原阳性的鸡血浆,接种鸡胚成纤维细胞(DF-1)分离病毒并进行亚群鉴定;采用聚合酶链式反应(PCR)技术扩增分离株的囊膜蛋白(gp85)基因片段,并对其进行测序,将基因序列与ALV不同亚群毒株进行比对和遗传进化分析;选取氨基酸变化差异较大的分离毒株进行间接免疫荧光鉴定。结果显示,共分离到7株ALV毒株(3株J亚群,4株K亚群),ALV-J分离毒株CAU4932、CAU4860和CAU2259的gp85基因片段长度为918 bp,编码306个氨基酸,分离毒株之间gp85基因核苷酸同源性为90.5%～95.2%,gp85蛋白氨基酸同源性为95.1%～99.3%;ALV-K分离毒株CAU7049、CAU5006、CAU7176和CAU7168的gp85基因片段长度为1 008 bp,编码336个氨基酸,分离毒株之间gp85基因核苷酸同源性为89.4%～92.3%,gp85蛋白氨基酸同源性为94.0%～99.7%。gp85蛋白氨基酸序列同源性比对发现,分离株gp8...     

广西麻鸡感染A亚群与J亚群禽白血病病毒的诊断

对疑似患有禽白血病的广西麻鸡进行病理剖检、接种DF-1细胞进行病毒分离以及对细胞培养上清进行p27抗原检测、细胞培养物进行PCR扩增,并对分离到病毒的gp85基因进行测序和分析比较。结果表明,从该病鸡同时分离到了A亚群禽白血病病毒(ALV-A)与J亚群禽白血病病毒(ALV-J),分别命名为ZS14-A株、ZS14-J株。对ALV-A gp85、ALV-J gp85基因的遗传变异分析结果显示,ZS14-A与6株国内外A亚群参考毒株之间的氨基酸同源性为86.3%~87.8%,其中与国外株MAV-1同源性最高,为87.8%。ZS14-J与7株国内外J亚群参考毒株之间的氨基酸同源性为83.4%~96.1%,其中与J亚群原型株HPRS103同源性最高,为96.1%。     

三黄鸡临床血管瘤病例中分离出A亚群与J亚群禽白血病病毒

为了解禽白血病病毒在广西鸡群中流行情况,采用DF-1细胞接种、细胞培养上清p27抗原检测、PCR扩增,对临床血管瘤型禽白血病的三黄鸡病料进行了病毒分离,并对分离病毒gp85基因进行测序和序列比较。结果表明,从1只病鸡同时分离到了一株A亚群禽白血病病毒(ALV-A)与一株J亚群禽白血病病毒(ALV-J),分别命名为HG01-A株和HG01-J株。ALV-A gp85与7株A亚群氨基酸同源性为85.8%~87.5%,与A亚群美国株MQNCSU同源性最高为87.5%,与A亚群原型株RSA同源性为86.9%。而ALV-J gp85与7株毒株核酸序列同源性为84.0%~93.8%,与广东株XX2-08以及四川株SCSM01同源性最高为93.8%,与英国原型株HPRS103同源性为90.2%。进化分析进一步表明,HG01-A与各参考株亲缘关系较远,HG01-J与SCSM01亲缘关系最近。本研究首次从同一只广西三黄鸡中同时分离到ALV-A及ALV-J,进一步完善了我国地方品种鸡群中禽白血病的流行病学信息。     

禽B型白血病病毒的分离及分子分型鉴定

从送检的骨石症蛋用种鸡中分离出一株禽白血病病毒(ALV)。剖检骨石症发病鸡,采集病变的肝脏、脾脏组织,提取病毒基因组,并利用针对ALV群特异性抗原P27基因设计的引物进行PCR快速检测确定为ALV感染。将病变组织接种SPF鸡胚绒毛尿囊膜,连续传代3次。进一步针对亚群间特异性抗原gp85区设计一对引物进行PCR扩增并酶切分析。结果确认分离到的1株病毒为ALV-B亚型。     

三株J亚群禽白血病病毒的分离及其gp85基因序列分析

本试验从湖北省分离到3株J亚群禽白血病病毒,并通过病理解剖、DF-1细胞培养和RT-PCR进行了鉴定,分别命名为HB1002、HB1003和HB1009。根据J亚群原型毒株HPRS-103序列设计引物,扩增gp85基因并测序。序列分析表明:基因片段大小均为921 bp,与预期一致;分离到的3株病毒之间核苷酸同源性在97.7%~99.7%,氨基酸同源性在95.1%~99.0%;与原型毒株HPRS-103核苷酸序列同源性在94.1%~94.8%;与其它ALV-J核苷酸同源性在87.6%~97.3%;进化树分析表明,分离到的3个毒株与JS09GY6同源性最近,在95.2%~97.3%。     

2009年我国部分地区禽白血病分子流行病学调查

为了解自2009年年初以来国内一些地区禽白血病流行情况及流行毒株的分子特征,我们从湖北、黑龙江、山东、辽宁、吉林、广东、宁夏、安徽8个省区39个鸡场采集疑似禽白血病病料样品178份,用ALV-A、ALV-B和ALV-J特异性引物,通过PCR方法进行检测。结果表明,8个省的35个鸡场的124份病料中检出了ALV-J(69.7%);25份病料中检出了ALV-A(13.9%);7份病料中检出了ALV-B(3.9%)。14个分离毒株env基因氨基酸同源性为84.3%～99%;与J亚群原型毒株HPRS-103的氨基酸序列同源性为87.3%～98.2%;与其它J亚群env基因氨基酸序列同源性为83%～97.4%。遗传进化分析表明,14个ALV-J分离株分别分属于不同的分支。其中,LJL09DH02分离株与其它分离株及参考毒株的的亲缘关系最远,与HPRS-103的氨基酸同源性仅为87.3%。另外4个分离株的env基因与HPRS-103的氨基酸同源性低于93%,其余9株与HPRS-103的同源性较高(96.6%以上)。该调查结果表明,我国目前ALV的感染主要以J亚群为主,ALV-A和B同时存在。     

广西凭祥斗鸡禽白血病病毒检测及分离株env基因分析

为了解广西凭祥市特有家禽品种斗鸡禽白血病病毒(ALV)的感染情况,采集了该市3个鸡场斗鸡的肛拭子、血清、血浆样品共344份,用禽白血病ELISA检测试剂盒进行检测。结果显示,斗鸡ALV感染情况严重,其中肛拭样品ALV-p27抗原阳性率高达39.13%,血清样品病毒分离阳性率为12.97%,ALV-J和ALV-A/B抗体阳性率分别为22.39%和7.46%;对从2只斗鸡获得的病毒分离株DJ-3-18和DJ-45进行病毒囊膜蛋白基因env的扩增、序列测定及比较分析,结果显示2株病毒的gp85基因与ALV-A亚群参考株之间氨基酸的同源性为88.2%~96.5%,gp37基因与ALV-A亚群参考株之间氨基酸的同源性为91.4%~98.0%,其中与台湾A亚群蛋鸡源分离株TW-3577的亲缘关系最近,而与ALV其他亚群毒株的同源性则较低。结果表明,首次获得的2株斗鸡源ALV分离株属A亚群。     

鸵鸟Ⅰ群禽腺病毒的分离鉴定、血清型鉴定以及Hexon蛋白基因序列分析

对3份来自不同地方的病死鸵鸟进行病理剖检、病原分离鉴定,确诊为Ⅰ群禽腺病毒感染,并成功分离到3株鸵鸟FAV-Ⅰ。采用PCR方法成功扩增2株临床分离株的Hexon基因,分别克隆于p MD20-T载体,对其进行了核苷酸序列测定、同源性比较及遗传进化分析。并运用Ⅰ群禽腺病毒12个标准毒阳性血清对其中2株毒进行了血清型鉴定。结果显示,分离株2014.07.10-HBHD-TN、2014.07.19-HBHS-TN与12个标准株之间的同源性在72.5%~98.0%之间,其中与FAV-4的同源性最高是98.0%。在系统进化树中,这两个分离株均位于FAV-I的大分支中,且与FAV-4位于同一小分支。这2个分离株经血清学鉴定均为血清4型的毒株。     

5株禽新城疫病毒新疆分离株F基因序列测定与遗传进化分析

从新疆乌鲁木齐市郊区养禽场发病禽群中分离到4株鸡源新城疫病毒（Newcastle disease virus,NDV）和1株鸽源 NDV。经血凝HA试验鉴定,NDV分离株均具有血凝性,5个毒株的血凝特性均可被NDV阳性血清所抑制,而不能被禽流感病毒(H5亚型与H9亚型)阳性血清抑制。本试验通过RT-PCR扩增了5株NDV全长F基因并进行了序列测定。序列分析表明,5 株 NDV 的核苷酸序列分别为1662、1589、1676、1589和1662 bp,均含有1个开放阅读框,分別编码 553、528、553、520 和 553个氨基酸;根据基因裂解位点的氨基酸序列分析表明,鸡源XJ/10/08株属于强毒株, XJ/3/07株、XJ/7/07株、XJ/9/08株和XJ/11/08株属于弱毒株;同源性分析表明,5 个 NDV新疆分离株与 La Sota 疫苗株的核苷酸同源性在 83.7%～99.8% 之间,与 TaiWan95 株核苷酸同源性在 84.7%～93.3% 之间;遗传发育进化树分析表明, 分离到的4个弱毒株与LaSota、Clone30、B1、BEA-45在同一亚群,属基因Ⅱ型,强毒分离株与TaiWan95、广东株(GD-1-98)、江苏株(JS-5-1)在同一进化分支内,属基因Ⅶ型。     

不同时期NDV地方株F基因的克隆及序列分析与基因型研究

利用RT-PCR技术对1998-2002年闯洛阳地区新城疫典型发病禽群中所分离到的15个毒株的F基因主要功能区片段进行了克隆和序列分析，并根据其47～435位核苷酸序列构建了系统进化树，确定了其毒力强弱和基因型。结果显示，依据核苷酸和推导的氨基酸同源性的不同，15个地方毒株可分为3群，群内各毒株同源性较高，群间差异较大，未发现有因分离禽品种不同所引起的明显的株间差异。其中第1群9株，涉及到各时间段分离的毒株和所有分离禽品种，属典型的基因Ⅶ型强毒株，高度集中于进化树的基因Ⅶ型C亚型区；第2群4株，属传统的基因Ⅵ型强毒株。分散于进化树的基因Ⅵ型区；第3群2株，属古典基因Ⅱ型的弱毒株，分散于进化树的基因Ⅱ型区。结果表明，近年来该地区流行的新城疫病毒以新的基因Ⅶ型为主，同时兼有传统的基因Ⅵ型和古老的基因Ⅱ型；并提示基因Ⅶ型各毒株在该地区流行的时间较短，株间差异不大。     

5株禽新城疫病毒新疆分离株F基因序列测定与遗传进化分析

从新疆乌鲁木齐市郊区养禽场发病禽群中分离到4株鸡源新城疫病毒(Newcastle disease virus,NDV)和1株鸽源NDV.经血凝HA试验鉴定,NDv分离株均具有血凝性,5个毒株的血凝特性均口J被NDV阳性血清所抑制.而不能被禽流感病毒(H5亚型与H9亚型)阳性血清抑制.本试验通过RT-PCR扩增了5株NDV全长F基因并进行了序列测定.序列分析表明,5株NDV的核苷酸序列分别为1662、1589、1676、1589和1662 bp,均含有1个开放阅读框,分别编码553、528、553、520和553个氨基酸;根据基因裂解位点的氨基酸序列分析表明.鸡源XJ/10/08株属于强毒株.XJ/3/07株、XJ/7/07株、XJ/9/08株和XJ/11/08株属于弱毒株;同源性分析表明,5个NDV新疆分离株与La Sota疫苗株的核苷酸同源性在83.7%～99.8%之间,与TaiWan95株核苷酸同源性在84.7%～93.3%之间;遗传发育进化树分析表明,分离到的4个弱毒株与La-Sota、Clone30、B1、BEA-45在同一亚群,属基因Ⅱ型,强毒分离株与TaiWan95、广东株(GD-1-98)、江苏株(JS-5-1)在同一进化分支内,属基因Ⅶ型.     

地方特色蛋鸡母本群禽白血病病毒感染的鉴定

研究采用ELISA、病毒分离和PCR方法对地方特色蛋鸡配套系母本鸡群的ALV抗体、抗原和核酸等进行了检测,结果显示受检种鸡群泄殖腔棉拭p27抗原阳性率为47.8％,A/B抗体阳性率为4.3％,未检测到J亚群抗体阳性个体,表明鸡群感染ALV-A/B,同时分离出两株外源性禽白血病病毒并命名为JS12JD01和JS12JD02.PCR扩增其囊膜蛋白基因并测序分析,结果显示JS12JD01株与A亚群参考株的gp85氨基酸序列同源性较高,与B、C、D、E和J亚群参考株同源性仅为32.5％～82.8％;JS12JD02分离株与B亚群参考株的gp85氨基酸序列同源性较高,而与A、C、D、E和J亚群参考株的同源性仅为34.6％～88.7％.表明这两株分离株分属于A、B两个不同亚群,该鸡群存在A、B亚群ALV的混合感染.     

福建地区猪瘟病毒流行株基因分型及E2基因遗传变异分析

为了解福建地区2013—2014年猪瘟病毒(CSFV)流行毒株的分子生物学特性与变异规律,采集了福建地区多个猪场的40份疑似猪瘟样品,应用RT-PCR技术对E2基因的主要抗原编码区进行扩增及序列分析,其中31份为猪瘟阳性。序列分析结果表明,31株CSFV流行毒株之间核苷酸与氨基酸的同源性分别为78.5%~100.0%和82.2%~100.0%,与国内外分离株的核苷酸同源性为81.1%~98.9%,氨基酸同源性为79.8%~95.6%;遗传进化树分析表明,31株CSFV属于1.1和2.1亚群,其中23株为1.1亚型,8株为2.1b和2.1c亚群,没有发现2.2和2.3亚群毒株。氨基酸序列分析表明,流行株在免疫逃逸相关位点705,713,729和734位氨基酸发生变异,FJ02毒株B细胞表位关键位点771位氨基酸发生变异,表明福建地区CSFV流行毒株呈现遗传变异多样性。     

黄羽肉鸡J亚群禽白血病病毒分离鉴定与全基因组序列分析

为了解J亚群禽白血病在黄羽肉鸡中的流行状况,采用病料研磨液接种DF-1细胞、ELISA p27抗原检测、PCR扩增等方法,从广东某鸡场送检疑似禽白血病的黄羽肉鸡病料中分离鉴定出1株J亚群禽白血病病毒,命名为GDLZ0715。为进一步了解该病毒分子学特性,对其进行全基因组测序,并与其他ALV-J毒株进行比较。结果表明,GDLZ0715分离株整个基因组中gag、pol、env基因和LTR相对保守,与各参考ALV-J毒株序列同源性分别达93.5%~95.9%、96.8%~97.3%、89.6%~94.6%和90.8%~95.1%;3′UTR变异较大,与各ALV-J参考毒株序列同源性仅为80.5%~93.4%,其中rTM和E元件大量碱基缺失;进一步分析表明3′UTR中rTM区和E元件大量碱基缺失正成为我国肉鸡ALV-J毒株的变异趋势。     

广西猪源H9N2亚型流感病毒的分离与鉴定

用SPF鸡胚从广西地区猪群中分离到1株H9N2型猪流感病毒(SIV),经鸡胚接种3代后出现稳定的鸡血红细胞凝集效价为27,且凝集性能被H9亚型阳性血清抑制,而不被其他亚型流感病毒阳性血清所抑制.分离株的HA基因及NA基因扩增结果显示,该毒株HA基因与流感病毒H9亚型同源性最高,NA基因与流感病毒N2亚型同源性最高,说明...     

6株K亚群禽白血病病毒分离株的全基因组测序及遗传进化分析

为研究目前中国临床流行的ALV毒株特征,我们采集临床上ALV P27阳性的鸡的血浆,接种DF-1细胞进行病毒分离,分离出6株外源性ALV毒株,并进一步对分离毒株进行前病毒全基因组测序。结果表明,6个ALV分离株的基因组结构均为典型的复制完整型C型逆转录病毒,缺乏病毒致癌基因,分离株DT190901基因组全长为7473 bp;DT190902和DT190905为7467 bp;DT190903和DT190906为7481 bp;DT190904为7493 bp,分离株间基因组序列同源性较高（98.6%～99.9%）。对6个ALV分离株与其他ALV毒株进行序列比较和遗传进化分析,结果表明,分离株的LTR、gag、pol及gp37基因与内源性ALV相比具有较高同源性（>93.8%）,gp85基因与ALV-K一致性较高（>95.4%）,属于新型ALV亚群（K亚群）遗传分支。分离株的LTR序列与内源性ALV相似,比其他外源性ALV亚群缺少一个CAAT Box、PRE Box、Y Box及CArG Box等转录调控元件。结果表明这6个分离株属于ALV-K亚群,为ALV-K与内源性ALV...     

J亚群禽白血病病毒GDHX01株分离与基因序列分析

为了解胡须鸡中是否存在禽白血病病毒(ALV)感染,从广东某胡须鸡养殖场中无菌采集胡须鸡血样,采用DF-1细胞培养、ELISA抗原检测、PCR扩增等方法,成功分离鉴定出一株J亚群禽白血病病毒(ALV-J),命名为GDHX01株。测序结果显示GDHX01株病毒基因组DNA序列全长为7616 bp,gp85基因全长919 bp。通过与其他禽白血病病毒参考毒株的基因组DNA序列进行比对分析,发现GDHX01与国内外J亚群禽白血病参考毒株同源性85.3%～95.7%之间。进一步比对发现,GDHX01毒株的gp85基因序列与国内外ALV-J参考株CAUGX01的同源性最高为95.8%。结果表明,在胡须鸡群中存在J亚群禽白血病病毒的感染。     

广东地方品种鸡J亚群禽白血病病毒分离鉴定及遗传进化研究

为了解广东地方品种鸡J亚群禽白血病病毒(ALV-J)净化情况,利用ALV-p27特异性抗原检测、病毒分离、PCR扩增和全基因组测序分析等方法,从广东某地方品种鸡群中分离鉴定出1株ALV-J,命名为GDYH-Y1。全基因组序列分析表明,GDYH-Y1分离株的LTR、gag和pol基因相对保守,而3′UTR和gp85基因变异较大,其中gp85基因与ALV-J参考毒株序列同源性仅为87.5%~92.8%,3′UTR区的rTM出现大量碱基缺失,遗传进化分析表明GDYH-Y1分离株与美国白羽肉鸡源分离株ADOL-7501亲缘关系最近。研究为广东地方品种鸡ALV-J净化效果提供数据参考,为分析广东地方品种鸡ALV-J毒株的分子特征和变异趋势提供了重要的数据资料。     

吉林省猪圆环病毒3型的分子流行病学调查及遗传演化分析

为了解猪圆环病毒3型(porcine circovirus type 3,PCV3)在吉林省的流行情况和分子生物学特性,本研究通过PCR方法对吉林省2015-2017年的484份血清样品进行PCV3检测,将PCV3检测阳性的样品进行ORF2基因扩增和测序,并利用生物信息学软件DNAStar和Mega 6.06对ORF2基因的分子生物学特性进行分析。结果显示,吉林省2015-2017年PCV3样品总感染率和猪场感染率分别为28.1%(136/484)和65.8%(25/38),且呈逐年上升趋势。同源性分析结果表明,本研究获得的4株PCV3 ORF2基因的核苷酸和氨基酸序列同源性分别为98.3%～98.9%和97.7%～99.5%,4株PCV3 ORF2基因与国内外参考毒株ORF2基因的核苷酸和氨基酸序列同源性分别为97.7%～99.7%和96.7%～100%。遗传进化分析表明,PCV3存在2个亚群:PCV3a和PCV3b。本试验分离的PCV3毒株分别位于2个亚群上,1株属于PCV3a亚群,3株属于PCV3b亚群。PCV3毒株Cap蛋白第24(A、V)和27位(R、K)氨基酸的不同可能与PCV3毒株的进化相关。本试验结果表明,PCV3在吉林省猪群和猪场中存在很高的感染率,PCV3毒株之间高度保守,本研究结果为PCV3的分子特性研究提供了参考依据。     

1株诱发血管瘤的ALV-J的分离鉴定及其囊膜基因的进化分析

【目的】了解湖北某黑羽蛋鸡场J亚群禽白血病(J-avian leukosis)的来源及其囊膜基因进化趋势,为湖北地区禽白血病流行病学调查提供资料。【方法】运用病理学、ELISA和Multi-PCR方法对疑似血管瘤型J亚群禽白血病病毒(J-Avian leucosis virus, ALV-J)病例进行实验室诊断,制备病毒液接种DF-1细胞进行病毒分离及间接免疫荧光试验(indirect immunofluorescence assay, IFA)检测,并通过DNAStar等软件分析该毒株囊膜蛋白编码基因。【结果】病例呈现典型血管瘤病变,p27抗原检测呈阳性,Multi-PCR出现ALV-J特异性条带,IFA结果显示特异性荧光,表明分离到1株ALV-J,命名为HB2021017。分离株HB2021017囊膜蛋白ENV、膜表面糖蛋白SU、跨膜蛋白TM与所引用的ALV-J毒株中的髓细胞瘤型毒株、髓细胞瘤和血管瘤混合型毒株、血管瘤型的ALV-J毒株的氨基酸序列相似性逐步升高。系统进化树分析显示,分离株HB2021017的env基因与中国地方品种鸡群中分离的诱发血管瘤的ALV-J毒株亲缘关系最近...