超氧化物歧化酶在酿酒酵母碱胁迫抗性中的功能研究

[目的]研究酿酒酵母超氧化物歧化酶与其碱胁迫抗性的相关性。[方法]采用可见分光光度法,测定碱胁迫条件下酵母菌超氧化物歧化酶活性（SOD）指标;采用平板滴定生长试验,检测酿酒酵母铜/锌超氧化物歧化酶缺失菌株（sod1Δ）和锰超氧化物歧化酶缺失菌株（sod2Δ）的碱胁迫抗性;采用台盼蓝染色,检测碱胁迫条件下酵母细胞的存活率。[结果]在pH值为7.9条件下处理2h可明显诱导酵母细胞内SOD活性升高;与野生型酵母菌株相比,sod1Δ和sod2Δ基因缺失菌均表现碱胁迫敏感表型,并且碱胁迫条件下细胞存活率明显下降。[结论]超氧化物歧化酶在调控酿酒酵母碱胁迫抗性中发挥重要作用。     

YDL080 c基因缺失的低异戊醇酿酒酵母菌构建

[目的]构建YDL080c基因缺失的低异戊醇生成的酿酒酵母菌。[方法]利用Cre-lox P重组系统与酵母电转化法敲除酿酒酵母中编码类丙酮酸脱羧酶的基因YDL080c,切断酿酒酵母代谢中的异戊醇生成,从而构建一株低异戊醇生成的酿酒酵母菌株。[结果]成功构建出YDL080c基因缺失的工程酵母菌Y1,Y1酿造酒中相对异戊醇含量为0.81 g/L,比初始菌降低28.3%。[结论]利用基因敲除YDL080c的工程酵母菌能够有效减少酿造酒中异戊醇的生成量。     

酿酒酵母抗氧化酶系统对NaCl和Na_2CO_3胁迫的生理响应

[目的]研究酿酒酵母SOD和CAT对NaCl和Na2CO3胁迫的生理响应。[方法]采用分光光度法,测定不同浓度NaCl和Na2CO3胁迫条件下酵母菌SOD和CAT的活性指标;采用比浊法,测定不同浓度NaCl和Na2CO3胁迫对酵母铜/锌超氧化物歧化酶缺失菌株（sod1Δ）和过氧化物酶缺失菌株（ctt1Δ）生长的影响。[结果]随着NaCl和Na2CO3胁迫浓度的升高,酵母细胞内SOD和CAT活性呈现上升趋势;与野生型菌株相比,NaCl和Na2CO3胁迫对sod1Δ和ctt1Δ基因缺失菌株产生更加明显的生长抑制作用。[结论]SOD和CAT在酿酒酵母抵抗NaCl和Na2CO3胁迫中发挥重要作用。     

基于rDNA ITS-1序列酿酒酵母的系统分类学研究

为了准确快速地为酵母生产提供优良菌株,采用核糖体DNA ITS-1(Internal transcribed spacer 1)序列分析法,对27株酵母菌(其中24株为酿酒酵母属中的酿酒酵母(S.cerevisiae),其他3株分别为汉逊酵母属中的多形酵母(H.polymorph)、克鲁维酵母属中的乳清酵母(K.marxianus)和红酵母属中的粘质酵母(R.mucilaginosa))进行了系统分类学研究,提取这27株酵母菌的基因组DNA并进行PCR扩增,采用琼脂糖和非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳检测,能将酵母菌株鉴定到属的水平;对PCR扩增序列进行克隆和测序,结果表明大多数酿酒酵母菌株之间的ITS-1序列有差异,主要表现在序列中的一段Ploy-T上,最少的有7个T,最多的有13个T。研究还用Phylip 3.6等DNA序列分析软件对不同ITS-1序列的菌株进行了系统发育分析,确定出不同菌株之间的亲缘关系,并纠正了长期认为是酿酒酵母的两株酵母菌。     

巨峰葡萄自然发酵不同阶段酵母菌的组成及差异分析

采集巨峰葡萄发酵不同阶段的发酵液,通过酵母菌的分离、纯化、WL培养基的鉴别培养、表型性状的聚类分析以及显微细胞形态观察,对酵母菌进行初步的表型分群,挑选不同表型群的代表菌株进行DNA的提取以及26S rDNA D1/D2基因扩增和测序分析。共得到64株酵母菌,经过对获得酵母菌菌株的表型鉴定得到14个表型群,通过26S rDNA基因测序、比对,酵母菌最终鉴定为3个不同的酵母菌种群,分别为假丝酵母、路氏类酵母和酿酒酵母。其中发酵前期包含的酵母菌种群是假丝酵母(64%)和路氏类酵母(36%);发酵中期包含假丝酵母(10%)、路氏类酵母(5%)和酿酒酵母(85%);发酵后期则包含路氏类酵母(43%)和酿酒酵母(57%)。结果表明,发酵不同阶段的优势酵母菌种群是存在差异的,酿酒酵母在发酵的中后期均占优势,假丝酵母仅在发酵的前中期存在且只在前期占优势,路氏类酵母在发酵的各个时期均有发现,但发酵后期占比最高。     

张裕摩塞尔十五世酒庄酿酒葡萄酵母菌分离筛选及鉴定

[目的]为进一步探究张裕摩塞尔15世酒庄酿酒葡萄酵母菌的多样性,更好开发利用酒庄酵母菌资源。[方法]从张裕摩塞尔十五世酒庄的葡萄园土壤、葡萄浆果表皮以及葡萄自然发酵过程中进行酵母菌的分离筛选,对得到的32株酵母菌株运用 WL营养琼脂培养基进行初步分类,同时结合26S rDNA D1/D2区序列分析。[结果]共鉴定出克鲁维毕赤酵母（Pichiakluyveri）、葡萄汁有孢汉逊酵母（Hanseniasporauvarum）、酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）、大隐球酵母（Cryptococcus magnus）共4种酵母菌。[结论]初步确定张裕摩塞尔15世酒庄酿酒葡萄酵母菌的主要种类,为酿造具有酒庄特色葡萄酒提供理论基础和研究依据。     

紫苏PfDGAT1酵母功能互补分析

[目的]本试验将已克隆的紫苏种子中高表达二酰甘油酰基转移酶(DGAT)基因PfDGAT1转化至酿酒酵母突变型菌株H1246进行酵母互补功能验证,研究二酰甘油酰基转移酶是否具有催化油脂合成的作用。[方法]通过构建紫苏DGAT基因的酵母表达载体pYES2.0-PfDGAT1并转化至酿酒酵母突变型菌株H1246,用尼罗红对转基因酵母细胞染色,检测转基因酵母中是否能合成油体;利用薄层层析(TLC)试验检测转基因酵母中是否存在三酰甘油(TAG)。[结果]转pYES2.0-PfDGAT1载体的突变型酵母菌株H1246能够检测到有油体存在,而转pYES2.0空载体的突变型酵母菌株H1246中没有检测到油体,说明紫苏PfDGAT1基因的表达恢复了酿酒酵母突变型菌株H1246油体缺陷的表型,可以催化TAG合成。[结论]PfDGAT1基因在紫苏种子油脂合成积累过程中发挥重要作用,该研究结果为深入解析PfDGAT1基因在紫苏油脂合成途径中的功能奠定了基础。     

东北山葡萄酿酒酵母的分离与鉴定

为了选育优良的饲料原料产品酿酒酵母菌种,本试验采集了酿酒品质良好的山葡萄和山葡萄园土壤样本,通过分离优化、菌种生理生化鉴定和分子生物学鉴定方法,对分离出的天然酵母菌种进行了种属鉴定。结果表明,成功分离出18株酵母菌,其中有酿酒酵母12株、发酵毕赤酵母3株、乳酸克鲁维酵母3株,为进一步对酿酒酵母特性研究奠定了基础。     

芪合酶基因的克隆及其酵母表达载体的构建

应用基因工程技术将从中国野生属葡萄种高抗白粉病的华东葡萄白河-35-1中分离出的芪合酶基因cDNA片段（Stilbene synthase，STS）进行PCR扩增；把回收的目的基因PCR产物定向插入克隆载体pGEM-TEasy中进行测序与序列分析；采用定向克隆的方法将芪合酶基因克隆到大肠杆菌-酵母菌穿梭型酿酒酵母表达载体pYES6／CT上，转化大肠杆菌，提取阳性重组质粒转化酿酒酵母菌（Saccharomyces cerevisiae）菌株INVScl，酵母菌落PCR电泳结果显示，在约1200bp处有一条亮带，证明芪合酶基因酵母表达载体构建成功，为后期工作的开展奠定了基础，并为开发一种含有白藜芦醇生物活性成分的酵母微生态制剂提供了重要的实验素材。     

朊蛋白(prp105-125缺失)酵母双杂交诱饵载体的构建和鉴定

对小鼠朊蛋白（prp105—125缺失）的基因片段进行扩增,并将扩增片段导入诱饵载体pSos中构建酵母双杂交诱饵载体pSos-prp朊蛋白（prp105—125缺失）,用重组质粒转化感受态酵母菌cdc25H,检验其表达产物在酵母细胞中有无毒性及自激活作用。序列分析结果表明,该试验成功构建了小鼠朊蛋白（prp105-125缺失）酵母双杂交诱饵载体,且该诱饵质粒的表达产物对酵母菌cdc25H既无毒性也无自激活作用。     

Regulation of yeast replicative life span by TOR and Sch9 in response to nutrients

Calorie restriction increases life span in many organisms, including the budding yeast Saccharomyces cerevisiae. From a large-scale analysis of 564 single-gene-deletion strains of yeast, we identified 10 gene deletions that increase replicative life span. Six of these correspond to genes encoding components of the nutrient-responsive TOR and Sch9 pathways. Calorie restriction of tor1D or sch9D cells failed to further increase life span and, like calorie restriction, deletion of either SCH9 or TOR1 increased life span independent of the Sir2 histone deacetylase. We propose that the TOR and Sch9 kinases define a primary conduit through which excess nutrient intake limits longevity in yeast.     

The chemical genomic portrait of yeast: uncovering a phenotype for all genes

Genetics aims to understand the relation between genotype and phenotype. However, because complete deletion of most yeast genes ( approximately 80%) has no obvious phenotypic consequence in rich medium, it is difficult to study their functions. To uncover phenotypes for this nonessential fraction of the genome, we performed 1144 chemical genomic assays on the yeast whole-genome heterozygous and homozygous deletion collections and quantified the growth fitness of each deletion strain in the presence of chemical or environmental stress conditions. We found that 97% of gene deletions exhibited a measurable growth phenotype, suggesting that nearly all genes are essential for optimal growth in at least one condition.     

培养基成分对雌果蝇寿命的影响

[目的]探讨各培养基成分对雌果蝇寿命的影响。[方法]通过测定雌果蝇的寿命、鲜重及超氧化物歧化酶(SOD)活性,研究了不同培养基成分对雌果蝇寿命及体重的影响。[结果]含酵母粉的培养基显著延长了雌果蝇的寿命,而浓度变化对雌果蝇的寿命没有显著影响;不同浓度白砂糖对雌果蝇寿命的影响呈现倒钟型的曲线,当培养基中糖浓度为40.5 g/L处果蝇出现寿命最长;若糖浓度过低和过高,都不利于果蝇的生长,存活率呈急剧下降趋势;果蝇鲜重随着糖浓度的升高出现下降的趋势;不同糖浓度下SOD活性的变化并没有出现随寿命延长而呈逐渐升高的趋势。[结论]酵母粉浓度变化对处女蝇的寿命延长无显著影响,一定糖浓度使果蝇处于饥饿状态,寿命最长。     

食料和温湿度对刺槐叶瘿蚊广腹细蜂寿命的影响

[目的]提高刺槐叶瘿蚊广腹细蜂的繁殖率。[方法]设置不同组合的营养源和不同梯度水平的温、湿度,研究其对刺槐叶瘿蚊广腹细蜂寿命的影响。[结果]葡萄糖、蔗糖、蜂蜜、清水较对照均能延长广腹细蜂的寿命,蜂王浆、酵母粉、牛肉膏较对照均不能延长广腹细蜂的寿命。在69%相对湿度下,18、23、33℃对广腹细蜂寿命均无明显影响,寿命在27～28h,显著高于28和38℃下的寿命（22和10h）。在温度28℃下,清水处理保湿、50%相对湿度、90%相对湿度条件下,差异不显著,但与80%、69%、61%、39%、31%相对湿度条件相比差异显著。清水保湿条件下,寿命为36h。[结论]食料和温湿度对刺槐叶瘿蚊广腹细蜂的寿命均有影响。     

Asymmetric inheritance of oxidatively damaged proteins during cytokinesis

Carbonylated proteins were visualized in single cells of the budding yeast Saccharomyces cerevisiae, revealing that they accumulate with replicative age. Furthermore, carbonylated proteins were not inherited by daughter cells during cytokinesis. Mother cells of a yeast strain lacking the sir2 gene, a life-span determinant, failed to retain oxidatively damaged proteins during cytokinesis. These findings suggest that a genetically determined, Sir2p-dependent asymmetric inheritance of oxidatively damaged proteins may contribute to free-radical defense and the fitness of newborn cells.     

Rapamycin-induced insulin resistance is mediated by mTORC2 loss and uncoupled from longevity

Rapamycin, an inhibitor of mechanistic target of rapamycin complex 1 (mTORC1), extends the life spans of yeast, flies, and mice. Calorie restriction, which increases life span and insulin sensitivity, is proposed to function by inhibition of mTORC1, yet paradoxically, chronic administration of rapamycin substantially impairs glucose tolerance and insulin action. We demonstrate that rapamycin disrupted a second mTOR complex, mTORC2, in vivo and that mTORC2 was required for the insulin-mediated suppression of hepatic gluconeogenesis. Further, decreased mTORC1 signaling was sufficient to extend life span independently from changes in glucose homeostasis, as female mice heterozygous for both mTOR and mLST8 exhibited decreased mTORC1 activity and extended life span but had normal glucose tolerance and insulin sensitivity. Thus, mTORC2 disruption is an important mediator of the effects of rapamycin in vivo.     

猪链球菌4型转录调控因子GalR的生物学特性

【目的】 研究分析猪链球菌4型（Streptococcus suis serotype 4,SS4）强毒株SH1510 转录调控因子GalR基因的缺失对细菌生物学特性的影响,为进一步研究GalR对半乳糖代谢途径的调控及其致病机理提供理论依据。【方法】 利用同源重组双交换的方法构建了SS4强毒株SH1510 转录调控因子GalR基因缺失株SH1510ΔGalR,通过GalR基因内部扩增引物I1/I2进行缺失株初步筛选,进一步通过PCR和Western blotting鉴定缺失株SH1510ΔGalR。对亲本株SH1510和缺失株SH1510ΔGalR进行革兰氏染色以比较形态差异;配置基础培养基,分别加入葡萄糖、蔗糖、D-半乳糖后培养细菌,绘制细菌生长曲线,比较细菌对不同糖的利用率;将亲本株和缺失株的菌液浓度分别调整为2.5×10 ⁹、5×10 ⁸、1×10 ⁸、2×10 ⁷ CFU/mL,对BALB/c小鼠进行腹腔注射以观察小鼠致死率并使用Reed-Muench法计算菌株LD₅₀。将浓度为2×10 ⁷CFU/mL的亲本株和缺失株1﹕1等体积混合后腹腔注射BALB/c小鼠,24 h后取脑、脾、血在氯霉素抗性和无抗性THB平板上进行细菌计数,比较细菌在小鼠体内的定植能力;并以健康猪的全血模仿体内环境,将亲本株和缺失株分别加入含有SS4抗血清的健康猪全血中,37℃孵育2 h进行平板计数,比较细菌在全血中的存活能力。【结果】 使用内部检测引物I1/I2做PCR,缺失株SH1510ΔGalR检测为阴性,进一步使用引物C1/C2、O1/C2、O2/C1、O1/O2鉴定缺失株SH1510ΔGalR,分别扩增出1 056、2 121、2 094、3 147 bp的片段,结果和预期相符。Western blotting 鉴定结果表明亲本株SH1510可与粗制GalR多抗兔血清发生特异性结合,在37 kD处出现单一条带,但缺失株SH1510ΔGalR没有条带出现。PCR和Western blotting鉴定结果均表明缺失株SH1510ΔGalR已构建成功。亲本株和缺失株经革兰氏染色,光学显微镜下观察可见亲本株和缺失株均呈链状排列,长度相似,形态无显著差异。在葡萄糖和蔗糖作为唯一糖原的生长条件下,亲本株和缺失株的生长情况相仿,而当糖原为D-半乳糖时,缺失株的生长速率和OD₆₀₀值明显低于亲本株。另外,从最高OD₆₀₀值可以看出,猪链球菌SH1510对糖的利用率为葡萄糖>蔗糖>D-半乳糖。 小鼠致病性试验中,亲本株和缺失株的LD₅₀分别为1×10 ⁸CFU和1.62×10 ⁸CFU,缺失株对小鼠的致病性下降了1.62倍。体内竞争感染试验结果显示,缺失株在小鼠的脑、脾、血液中的细菌分离数均远低于亲本株,差异极显著（P＜0.01）。全血存活试验表示,亲本株的存活率为35.2%,缺失株的存活率为27.3%,缺失株SH1510ΔGalR比亲本株SH1510在全血中的存活率显著下降（P＜0.05）。【结论】 GalR 基因可促进猪链球菌4型对半乳糖的利用,同时对SH1510的毒力有直接或间接的调控作用。     

HST2 mediates SIR2-independent life-span extension by calorie restriction

Calorie restriction (CR) extends the life span of numerous species, from yeast to rodents. Yeast Sir2 is a nicotinamide adenine dinucleotide (NAD+-dependent histone deacetylase that has been proposed to mediate the effects of CR. However, this hypothesis has been challenged by the observation that CR can extend yeast life span in the absence of Sir2. Here, we show that Sir2-independent life-span extension is mediated by Hst2, a Sir2 homolog that promotes the stability of repetitive ribosomal DNA, the same mechanism by which Sir2 extends life span. These findings demonstrate that the maintenance of DNA stability is critical for yeast life-span extension by CR and suggest that, in higher organisms, multiple members of the Sir2 family may regulate life span in response to diet.