酵母SOD1基因缺失突变体应答真菌细胞壁抑制剂CFW的转录组学分析

以酿酒酵母为研究材料,采用酵母全基因组表达谱芯片,分析超氧化物歧化酶SOD1基因缺失(sod1Δ)对酵母细胞应答真菌细胞壁抑制剂钙荧光白(CFW)全基因组转录表达谱的影响,为揭示植物病原真菌细胞壁调控机制以及植物抗真菌基因工程改造提供新的理论基础。结果表明:CFW(10μg/m L)处理1 h后,与野生型酵母细胞相比,sod1Δ酵母细胞中211个基因发生了显著差异表达(97个基因表达上调、114个基因表达下调)。随机选取5个差异表达基因采用定量PCR验证,结果与芯片分析结果一致。差异表达基因功能主要涉及细胞壁、细胞代谢、蛋白质合成、细胞防御以及大量功能未知蛋白。以上结果表明,SOD1基因缺失可显著改变酵母细胞应答真菌细胞壁抑制剂CFW胁迫的全基因组转录表达谱。     

欧美杨细菌性溃疡病菌双组分基因缺失突变及其生物学表型分析

  目的  欧美杨细菌性溃疡病是革兰氏阴性细菌Lonsdalea populi引起的杨树枝干病害,其危害严重,已造成欧美杨人工林的重要经济损失。双组分系统是细菌致病过程的关键调控途径之一。目前,欧美杨细菌性溃疡病菌的双组分系统如何调控致病过程仍缺乏系统研究。因此,本研究开展欧美杨细菌性溃疡病菌的双组分编码基因的缺失突变及突变体表型分析,为深入解析其致病机制提供遗传材料。  方法  本研究以欧美杨溃疡病菌菌株N-5-1为研究对象,利用双亲结合方法获得了28个双组分系统基因的缺失突变体,并通过表型测定方法分析了这些基因突变体的致病性、生长、游动性、生物膜形成和抗逆性等表型特征,研究不同双组分系统编码基因对该病菌致病过程的调控。  结果  构建了36个欧美杨溃疡病菌的双组分编码基因的敲除重组载体,获得了28个基因的缺失突变体。致病性测定表明18个双组分基因的敲除降低了病原菌的毒性,其中8个突变体毒性丧失。此外,还获得了调控游动性和生物膜形成能力的突变体以及在逆境胁迫反应（金属离子、盐离子、抗生素等胁迫）有缺陷的突变体。  结论  本研究获得了5个显著影响欧美杨细菌性溃疡病菌毒性及其他生物表型的双组分基因,为后续双组分信号调控致病机制研究提供了遗传材料。      

Mammalian and yeast ras gene products: biological function in their heterologous systems

Activated versions of ras genes have been found in various types of malignant tumors. The normal versions of these genes are found in organisms as diverse as mammals and yeasts. Yeast cells that lack their functional ras genes, RASSC-1 and RASSC-2, are ordinarily nonviable. They have now been shown to remain viable if they carry a mammalian rasH gene. In addition, yeast-mammalian hybrid genes and a deletion mutant yeast RASSC-1 gene were shown to induce morphologic transformation of mouse NIH 3T3 cells when the genes had a point mutation analogous to one that increases the transforming activity of mammalian ras genes. The results establish the functional relevance of the yeast system to the genetics and biochemistry of cellular transformation induced by mammalian ras genes.     

A rice geranylgeranyl reductase is essential for chloroplast development

Chloroplasts are essential for plant photosynthesis and growth. Many genes have been identified that regulate plant chloroplast development. However, it is not known at a molecular level how these genes regulate chloroplast biogenesis. In this study, we isolated a mutant ygl2(yellow-green leaf2) that exhibited a pigment-defective phenotype. YGL2 encodes a geranylgeranyl reductase, and in mutant ygl2, there was a single base change(T1361 G) located in the third exon of YGL2 that resulted in a missense mutation(L454 R) in the encoded product. Transmission electron microscopy revealed that chloroplast development was impaired in the ygl2 mutant. The expression levels of plastid-encoded genes were significantly altered in the ygl2 mutant. Furthermore, in a yeast two-hybrid assay, we found that YGL2 interacted with the RNA editing factor MORF8.     

拟南芥MPK3、MPK4、MPK6在酵母hog1?中的渗透调节作用

【目的】研究拟南芥MAPK信号转导途径的关键基因MPK3、MPK4、MPK6的功能,明确其在渗透调节中的作用。【方法】构建拟南芥MPK3、MPK4、MPK6的酿酒酵母表达载体,遗传转化酿酒酵母渗透调节功能丧失的hog1?突变体,筛选得到阳性转化子,并分析其在渗透胁迫下的表型特征。【结果】扩增得到了拟南芥MPK3、MPK4、MPK6的全长cDNA序列,构建了上述3个基因的表达载体,并筛选得到了3个基因的阳性转化子。在1 mol•L-1 KCl、0.3 mol•L-1 LiCl、1 mol•L-1 NaCl、1 mol•L-1 Sorbitol的盐胁迫处理下,阳性转化子生长状态良好,与野生型的表型基本一致,均恢复了hog1?对盐胁迫的抗性。在盐胁迫处理下,hog1?细胞形态异常且体内甘油含量较野生型低,而转化子的形态和体内甘油含量均恢复到正常的表型。【结论】MPK3、MPK4、MPK6均能够使酿酒酵母渗透调节功能丧失突变体hog1?恢复对盐胁迫的抗性,具有渗透调节的功能。     

Global mapping of the yeast genetic interaction network

A genetic interaction network containing approximately 1000 genes and approximately 4000 interactions was mapped by crossing mutations in 132 different query genes into a set of approximately 4700 viable gene yeast deletion mutants and scoring the double mutant progeny for fitness defects. Network connectivity was predictive of function because interactions often occurred among functionally related genes, and similar patterns of interactions tended to identify components of the same pathway. The genetic network exhibited dense local neighborhoods; therefore, the position of a gene on a partially mapped network is predictive of other genetic interactions. Because digenic interactions are common in yeast, similar networks may underlie the complex genetics associated with inherited phenotypes in other organisms.     

Regulation of yeast replicative life span by TOR and Sch9 in response to nutrients

Calorie restriction increases life span in many organisms, including the budding yeast Saccharomyces cerevisiae. From a large-scale analysis of 564 single-gene-deletion strains of yeast, we identified 10 gene deletions that increase replicative life span. Six of these correspond to genes encoding components of the nutrient-responsive TOR and Sch9 pathways. Calorie restriction of tor1D or sch9D cells failed to further increase life span and, like calorie restriction, deletion of either SCH9 or TOR1 increased life span independent of the Sir2 histone deacetylase. We propose that the TOR and Sch9 kinases define a primary conduit through which excess nutrient intake limits longevity in yeast.     

水稻短胚芽鞘基因SCP1的图位克隆

水稻胚芽鞘在幼苗出土过程中发挥重要作用，其生长受到多种激素的调控。为了挖掘胚芽鞘生长的关键调控因子，对水稻突变体库进行筛选，获得了一系列胚芽鞘发育缺陷突变体。其中一个突变体（short coleoptile 1, scp1）的胚芽鞘明显短于野生型，且乙烯合成基因表达水平和乙烯释放量均低于野生型，其幼苗的耐盐性和耐旱性显著提高。成株期的scp1突变体表现出矮化、小粒的表型。通过图位克隆，将SCP1基因定位在5号染色体上32.01 kb区间，该区间有5个功能基因，通过扩增与测序发现OsRGA1基因在突变体中有大片段缺失，并且与已报道的osrga1等位突变体d1具有相似的胚芽鞘表型和农艺性状，说明scp1是osrga1的另一个等位突变体。相关研究结果加深了对OsRGA1基因功能的认识，为探究乙烯调控水稻生长发育及耐逆性的分子机理提供了研究材料。     

水稻短胚芽鞘基因SCP1的图位克隆

水稻胚芽鞘在幼苗出土过程中发挥重要作用,其生长受到多种激素的调控。为了挖掘胚芽鞘生长的关键调控因子,对水稻突变体库进行筛选,获得了一系列胚芽鞘发育缺陷突变体。其中一个突变体（short coleoptile 1, scp1）的胚芽鞘明显短于野生型,且乙烯合成基因表达水平和乙烯释放量均低于野生型,其幼苗的耐盐性和耐旱性显著提高。成株期的scp1突变体表现出矮化、小粒的表型。通过图位克隆,将SCP1基因定位在5号染色体上32.01 kb区间,该区间有5个功能基因,通过扩增与测序发现OsRGA1基因在突变体中有大片段缺失,并且与已报道的osrga1等位突变体d1具有相似的胚芽鞘表型和农艺性状,说明scp1是osrga1的另一个等位突变体。相关研究结果加深了对OsRGA1基因功能的认识,为探究乙烯调控水稻生长发育及耐逆性的分子机理提供了研究材料。     

苹果树腐烂病菌多聚半乳糖醛酸酶基因Vmpg7和Vmpg8的功能

【目的】前期转录组分析表明苹果树腐烂病菌（Valsa mali）两个多聚半乳糖醛酸酶(polygalacturonase,PG)基因Vmpg7和Vmpg8在病菌侵染定殖过程中显著上调表达。论文旨在分析Vmpg7和Vmpg8在病菌营养生长、致病力、果胶酶活性、对果胶的利用等方面的作用及基因双敲除对同家族内其他基因表达水平的影响,明确Vmpg7和Vmpg8在病菌致病过程中的生物学功能,为进一步解析苹果树腐烂病菌致病分子机理提供基础。【方法】通过qRT-PCR检测基因在病菌侵染过程中的表达水平及基因双敲除后PG家族内其他PG基因的表达量;利用double-joint PCR构建基因敲除载体并通过PEG介导的原生质体转化技术进行基因敲除,经4对引物PCR检测及Southern blot验证获得基因单敲除和双敲除突变体,并利用gap-repair技术对基因进行回复;利用PDA培养基常规培养法观察突变体营养生长状况;通过离体接种富士苹果叶片及枝条的方法检测基因缺失对病菌致病力的影响;通过3,5-二硝基水杨酸（DNS）比色法检测各突变体胞外果胶酶活性;利用Czapek培养基培养法分析突变体对果胶的利用情况。【结果】qRT-PCR分析表明,Vmpg7和Vmpg8在病菌侵染3 d后分别上调表达27.73和8.19倍。通过基因敲除技术,分别获得3个Vmpg7基因单敲除突变体、1个Vmpg8基因单敲除突变体和3个Vmpg7/Vmpg8基因双敲除突变体,并获得了Vmpg7和Vmpg8单敲除突变体的回复突变体。将突变体接种到PDA培养基上,菌落形态和生长速率均没有发生变化;接种到苹果叶片和枝条上,Vmpg7单敲除突变体及Vmpg7/Vmpg8双敲除突变体在叶片和枝条上的致病力显著降低,而Vmpg8单敲除突变体在叶片上的致病力显著降低;进一步对果胶酶活性及对果胶的利用分析,发现Vmpg8单敲除突变体及Vmpg7/Vmpg8双敲除突变体胞外果胶酶活性均显著降低,且所有突变体在果胶培养基上生长均明显减慢。此外,基因回复后突变体的致病力、果胶酶活性及在果胶上的生长速率均回复到野生型菌株03-8水平。重要的是,Vmpg7/Vmpg8双敲除后影响了PG家族中其他PG基因的表达水平,3个基因显著上调表达。【结论】多聚半乳糖醛酸酶基因Vmpg7和Vmpg8可能与同家族内其他基因协同作用,通过调节果胶酶活性参与苹果树腐烂病菌致病过程。     

灰葡萄孢致病基因BcPDR1与Gα亚基基因的关系研究

为了探究灰葡萄孢致病基因BcPDR1与病菌G蛋白α亚基基因之间的关系,利用qRT-PCR技术分析BcPDR1基因突变对Gα亚基基因BcBCG2和BcBCG3表达的影响以及BcBCG2、BcBCG3基因突变对BcPDR1基因表达的影响;在敲除突变体ΔBcpdr1的基础上,构建BcBCG2、BcBCG3基因过表达菌株ΔBcpdr1/BcBCG2-OE、ΔBcpdr1/BcBCG3-OE,对过表达菌株的表型和致病力进行分析。结果发现,BcPDR1基因的缺失突变体中BcBCG2、BcBCG3基因的表达水平显著升高,BcBCG2、BcBCG3基因沉默突变体中的BcPDR1基因的表达水平显著降低;BcBCG2、BcBCG3基因的过表达菌株的菌落形态、菌丝形态、生长速率、产孢量和致病力均与野生型BC22菌株基本一致,而与ΔBcpdr1突变体存在显著差异。结果表明,灰葡萄孢BcPDR1与Gα亚基基因BcBCG2、BcBCG3之间密切相关,BcPDR1负调控BcBCG2、BcBCG3基因的表达,BcBCG2、BcBCG3正调控BcPDR1基因的表达。研究结果为阐明灰葡萄孢致病基因BcPDR1调控病菌生长发育和致病力的机制奠定了基础。     

CDC25: a component of the RAS-adenylate cyclase pathway in Saccharomyces cerevisiae

The yeast Saccharomyces cerevisiae contains two functional homologues of the ras oncogene family, RAS1 and RAS2. These genes are required for growth, and all evidence indicates that this essential function is the activation of adenylate cyclase. In contrast, ras in mammalian cells does not appear to influence adenylate cyclase activity. To clarify the relation between ras function in yeast and in higher eukaryotes, and the role played by yeast RAS in growth control, it is necessary to identify functions acting upstream of RAS in the adenylate cyclase pathway. The evidence presented here indicates that CDC25, identified by conditional cell cycle arrest mutations, encodes such an upstream function.     

酵母CFD1基因缺失菌株构建及其对复制寿命的影响

目的测定CFD1基因缺失对酿酒酵母复制寿命的影响。方法运用基因同源重组技术构建单基因缺失酵母菌株,利用光学显微镜检测酵母细胞的复制寿命。结果与野生型酵母菌株（29.29±8.71代对比,CFD1基因缺失酵母菌株复制寿命（27.27±8.01）代有所变短,但差异无统计学意义。结论 CFD1基因缺失不影响酿酒酵母的复制寿命。）     

通过缺失大丽轮枝菌Vdku80构建其高效基因敲除受体菌株

【目的】验证大丽轮枝菌（Verticillium dahliae）非同源末端连接途径关键基因Vdku80的功能,构建高效的大丽轮枝菌基因敲除受体菌株。【方法】利用常规基因敲除的方法,构建大丽轮枝菌Vdku80基因缺失的突变体菌株ΔVdku80。即将Vdku80的同源重组DNA片段（Vdku80的基因组上下游DNA片段之间连接潮霉素抗性基因）通过农杆菌介导的转化转入大丽轮枝菌,通过同源区段的重组,潮霉素抗性基因便会替换掉野生型Vdku80,从而获得突变体菌株ΔVdku80。对突变体菌株ΔVdku80的生物学表型,即生长速率、产孢量和对棉花的致病性进行测试。分别以大丽轮枝菌野生型菌株和ΔVdku80作为受体菌株,采用上述基因敲除方法测试2个几丁质合成酶编码基因ChsV和ChsVI的基因敲除效率。【结果】成功构建了Vdku80缺失突变体ΔVdku80。野生型和突变体菌株ΔVdku80在PDA培养基上的菌落形态相似,且培养8 d后菌落直径无明显差别。野生型和突变体菌株ΔVdku80产孢高峰均出现在摇瓶培养后第5天,且该时期产孢量亦无明显的变化。浓度为0.02%的MMS对野生型和突变体菌株ΔVdku80的生长均有明显的抑制作用,且抑制程度相同。接种野生型和突变体菌株ΔVdku80 4周后,棉株真叶均开始表现出萎蔫、褪绿等发病症状,野生型和突变体菌株ΔVdku80对棉花造成的病情指数分别为54.2±4.9和53.6±5.4,亦无明显变化。因此,突变体菌株ΔVdku80的生长速率、产孢量和致病性相对于野生型菌株均未发生明显变化。使用野生型菌株作为基因敲除的受体菌株,几丁质合成酶编码基因ChsV和ChsVI的基因敲除转化子在总转化子中的比例分别为44%和31%;而使用ΔVdku80作为基因敲除的受体菌株,几丁质合成酶编码基因ChsV和ChsVI基因敲除转化子在总转化子中的比例分别为94%和87%。【结论】Vdku80缺失的菌株ΔVdku80作为受体菌株可以提高其他基因的基因敲除效率,且Vdku80的缺失对大丽轮枝菌的生长速率、产孢量和致病性均无影响,因此不会干扰其他基因的敲除所带来的表型变化。Vdku80缺失的菌株ΔVdku80可作为高效的大丽轮枝菌基因敲除受体菌株。     

Secretion of human interferons by yeast

Plasmids were constructed to direct synthesis of the human interferons IFN-alpha 1, IFN-alpha 2, and IFN-gamma in the yeast Saccharomyces cerevisiae. Expression of IFN genes containing coding sequences for secretion signals resulted in the secretion of IFN activity. A large proportion of the IFN-alpha 1 and IFN-alpha 2 isolated from the yeast cell growth media had the same amino termini as the natural mature interferons, suggesting a removal of the signal sequences identical to that of human cells. These results show that a lower eukaryote, such as yeast, can utilize and process a human signal sequence.     

禾谷镰孢碳源代谢调控因子FgCreA的功能

【目的】敲除禾谷镰孢（Fusarium graminearum）中碳源代谢调控因子FgCreA,并对其营养生长、有性生殖和致病力等方面进行研究,为研究禾谷镰孢中碳源代谢机制提供依据。【方法】根据酵母数据库SGD和NCBI数据库中的序列,利用酿酒酵母中碳源代谢调控因子Mig1确定禾谷镰孢中的碳源调控因子FgCreA;在NCBI数据库中检索其他物种中碳源代谢调控蛋白,使用ClustalW2软件进行多重序列比对,并用MEGA5软件构建系统进化树,同时在InterProScan网站上预测其蛋白结构域;在NCBI数据库中检索与禾谷镰孢碳源吸收相关的结构基因和真菌毒素DON生物合成的相关基因,调取起始密码子上游1 000 bp的片段,预测FgCREA基因结合位点位置;用Primer5软件设计引物,利用Split-PCR和PEG介导原生质体转化的方法进行基因敲除,并通过PCR和Southern blot验证获得FgCREA基因敲除突变体Fgcrea。根据突变体Fgcrea营养生长、有性生殖和致病力等方面的变化分析FgCREA的功能。【结果】通过生物信息学方法,明确禾谷镰孢中只有一个碳源代谢调控因子基因FgCREA(FGSG_09715),氨基酸序列416 aa,共包含两个保守的C2H2锌指结构区域。FgCreA同源蛋白在各类真菌中均存在一定程度的同源性,具有较高的保守性。禾谷镰孢碳源吸收相关结构基因（XYL2、ARA1、ICL1、PG1、SUC2）和真菌毒素DON生物合成相关基因（TRI1、TRI3、TRI4、TRI5、TRI6、TRI7、TRI8、TRI10、TRI12、TRI101）启动子区均含有FgCREA DNA结合位点。采用Split-PCR技术和PEG介导的原生质体转化,通过PCR和Southern blot获得并验证了两个FgCREA基因敲除突变体。表型观察发现,突变体Fgcrea的生长速度与野生型相比下降90%;分生孢子形态正常,但产孢量与野生型相比降低88%;有性生殖阶段,突变体Fgcrea可以产生正常的子囊壳、子囊和子囊孢子,但需要比野生型长20-28 d;突变体Fgcrea对钠盐较敏感,侵染小麦穗不发病。【结论】获得禾谷镰孢碳代谢调控因子FgCreA敲除突变体,明确FgCreA参与营养生长和有性生殖,并能够影响致病过程。但是否影响相关结构基因的转录水平和DON生物合成仍需进一步验证。