苹果树腐烂病菌多聚半乳糖醛酸酶基因Vmpg7和Vmpg8的功能

【目的】前期转录组分析表明苹果树腐烂病菌（Valsa mali）两个多聚半乳糖醛酸酶(polygalacturonase,PG)基因Vmpg7和Vmpg8在病菌侵染定殖过程中显著上调表达。论文旨在分析Vmpg7和Vmpg8在病菌营养生长、致病力、果胶酶活性、对果胶的利用等方面的作用及基因双敲除对同家族内其他基因表达水平的影响,明确Vmpg7和Vmpg8在病菌致病过程中的生物学功能,为进一步解析苹果树腐烂病菌致病分子机理提供基础。【方法】通过qRT-PCR检测基因在病菌侵染过程中的表达水平及基因双敲除后PG家族内其他PG基因的表达量;利用double-joint PCR构建基因敲除载体并通过PEG介导的原生质体转化技术进行基因敲除,经4对引物PCR检测及Southern blot验证获得基因单敲除和双敲除突变体,并利用gap-repair技术对基因进行回复;利用PDA培养基常规培养法观察突变体营养生长状况;通过离体接种富士苹果叶片及枝条的方法检测基因缺失对病菌致病力的影响;通过3,5-二硝基水杨酸（DNS）比色法检测各突变体胞外果胶酶活性;利用Czapek培养基培养法分析突变体对果胶的利用情况。【结果】qRT-PCR分析表明,Vmpg7和Vmpg8在病菌侵染3 d后分别上调表达27.73和8.19倍。通过基因敲除技术,分别获得3个Vmpg7基因单敲除突变体、1个Vmpg8基因单敲除突变体和3个Vmpg7/Vmpg8基因双敲除突变体,并获得了Vmpg7和Vmpg8单敲除突变体的回复突变体。将突变体接种到PDA培养基上,菌落形态和生长速率均没有发生变化;接种到苹果叶片和枝条上,Vmpg7单敲除突变体及Vmpg7/Vmpg8双敲除突变体在叶片和枝条上的致病力显著降低,而Vmpg8单敲除突变体在叶片上的致病力显著降低;进一步对果胶酶活性及对果胶的利用分析,发现Vmpg8单敲除突变体及Vmpg7/Vmpg8双敲除突变体胞外果胶酶活性均显著降低,且所有突变体在果胶培养基上生长均明显减慢。此外,基因回复后突变体的致病力、果胶酶活性及在果胶上的生长速率均回复到野生型菌株03-8水平。重要的是,Vmpg7/Vmpg8双敲除后影响了PG家族中其他PG基因的表达水平,3个基因显著上调表达。【结论】多聚半乳糖醛酸酶基因Vmpg7和Vmpg8可能与同家族内其他基因协同作用,通过调节果胶酶活性参与苹果树腐烂病菌致病过程。     

苹果树腐烂病菌高效基因敲除受体菌株ΔVmKu80的构建

为验证苹果树腐烂病菌VmKu80的基因功能,构建高效率基因敲除的受体菌株。通过基因敲除技术获得介导非同源末端连接(NHEJ)途径的VmKu80基因缺失突变体,并对其生长速率、皿内菌落形态、致病力、分生孢子器的形成和基因敲除效率等进行分析。结果表明,该突变体的生长速率、皿内菌落形态、对苹果的致病力和分生孢子器产生等均与03-8菌株无显著差异,且以VmKu80缺失突变体为受体菌株的基因敲除效率是03-8菌株的12倍。说明,VmKu80缺失突变体的获得可以实现苹果树腐烂病菌基因敲除工作的高通量化,有助于苹果树腐烂病菌的基因功能研究。     

水稻基腐病菌HrpX/HrpY在致病性中的功能分析

【目的】由Dickeya zeae引起的水稻基腐病是水稻上重要细菌病害之一,迄今对该病原细菌的致病性调控研究尚不完善。论文旨在分析水稻基腐病菌（Dickeya zeae）双组分调控系统HrpX/HrpY的序列特征,研究该系统在水稻基腐细菌中的功能作用以及与下游基因的调控关系。【方法】对HrpX/HrpY序列进行生物信息学分析,构建带有反向筛选标记基因scaB的自杀重组质粒pKNG-ΔhrpX和pKNG-ΔhrpY,通过三亲转化方法分别将重组质粒导入野生型菌株EC1中,通过2次等位基因同源重组筛选获得基因缺失突变体ΔhrpX和ΔhrpY;比较突变体与野生菌的生长速率、胞外酶活性、毒素活性、运动性、菌膜形成能力,以及对水稻的致病性和对烟草的过敏性反应（HR）;进一步提取细菌总RNA,采用实时荧光定量PCR研究HrpX/HrpY双组分系统对下游基因表达量的影响。【结果】水稻基腐病菌EC1基因组中,hrpX和hrpY均为单拷贝,hrpX编码区长1 473 bp,编码490个氨基酸,hrpY长642 bp,编码213个氨基酸,hrpX和hrpY两者之间相隔32 bp,具有相同的转录方向,在功能上具有相关性。其中,HrpX是一个结合在膜上的组氨酸蛋白激酶,HrpY是存在细胞质中的效应调节蛋白,HrpX/HrpY两者构成双组分系统,并对下游hrp基因的表达具有调控作用。进一步通过遗传操作手段,成功构建了基因缺失突变体ΔhrpX和ΔhrpY,表型测定结果表明,突变体ΔhrpX和ΔhrpY的运动性减弱、菌膜形成能力降低、对水稻种子萌发的抑制作用减弱,且降低了对水稻的致病力,但ΔhrpX和ΔhrpY的生长速率、胞外酶和毒素的活性变化不明显,也不影响其在烟草上的HR。实时荧光定量PCR结果显示,突变体菌株ΔhrpX和ΔhrpY相对野生菌EC1表达量明显下降的基因有hrpA、hrpF和hrpN,而对毒素合成基因zmsA表达量的差异不明显,HrpX/HrpY双组分系统对hrp基因簇中大部分下游基因都有正调控作用,且HrpY的调控作用更加明显。【结论】HrpX/HrpY是水稻基腐病细菌中的一个双组分系统,调节病原细菌的运动性、菌膜的形成和病菌的致病力,正向调控一些下游hrp基因的表达。     

过氧化氢酶BcCAT2在灰葡萄孢生长发育和致病过程中的功能初探

为了明确灰葡萄孢过氧化氢酶BcCAT2在病菌生长发育时期和侵染过程中的功能,本研究利用生物信息学方法,对BcCAT2及其编码蛋白进行分析;构建了BcCAT2敲除载体,利用原生质体转化方法,获得了BcCAT2敲除突变体;利用PCR和qRT-PCR技术,对所获得的转化子进行鉴定;对野生型菌株和△Bccat2的表型（菌落形态、菌丝形态、生长速度、产孢量等）和致病力进行分析。结果发现,BcCAT2基因的缺失会导致菌丝形态纤细、生长速度缓慢、几乎不产菌核和分生孢子,且致病力明显下降,表明BcCAT2基因正调控病菌的生长发育和致病力。研究结果为进一步阐明灰葡萄孢过氧化氢酶BcCAT2基因调控病菌生长发育和致病力的分子机制奠定了基础。     

苹果树腐烂病菌小G蛋白VmRab7基因的功能分析

苹果树腐烂病菌（Valsa mali）引起的真菌病害严重制约着苹果经济产业的发展,深入研究其致病机制,对该病害的防控十分重要。初步鉴定了小G蛋白VmRab7的功能,为解析苹果树腐烂病菌的致病机理和病害防控提供理论依据。采用同源重组的方法对VmRAB7进行基因敲除,获得ΔVmrab7敲除突变体;通过菌落直径的测量,分析VmRab7对菌丝生长速率的影响;通过离体枝条和叶片接种,分析VmRab7对致病力的影响;通过透射电镜观察,分析ΔVmrab7突变体的自噬体及液泡形态。研究发现,VmRAB7基因的缺失使菌丝生长速率降低了约40%,致病力降低了约50%,突变体丧失了产孢能力;ΔVmrab7敲除突变体具有小且多的碎片化液泡,液泡中无球状的自噬体结构。因此,VmRab7调控着苹果树腐烂病菌的营养生长、产孢、致病力、液泡融合和细胞自噬过程。     

果生炭疽菌转录因子CfHac1的BRLZ结构域生物学功能研究

  目的  炭疽病是油茶的主要病害,导致巨大的经济损失。果生炭疽菌是油茶炭疽病优势致病菌。对果生炭疽菌的转录因子CfHac1的结构域进行分析,为进一步解析转录因子CfHac1调控病菌致病的分子机制奠定基础,对挖掘油茶炭疽病防控新途径具有重要的理论意义。  方法  采用点突变技术构建转录因子CfHac1结构域缺失载体,通过PEG介导法将该回补载体转化至CfHAC1基因完全缺失突变体的原生质体中,通过博来霉素抗性和荧光筛选获得结构域缺失回补菌株,进一步研究BRLZ结构域在果生炭疽菌中的生物学功能。  结果  结果发现转录因子CfHac1含有一个碱性亮氨酸拉链结构域（BRLZ）,该结构域包含58个氨基酸残基;与野生型菌株和完全互补菌株相比,BRLZ结构域缺失突变株ΔCfhac1ΔBRLZ生长速率显著降低,分生孢子产量显著减少,不能形成附着胞,对内质网压力胁迫更敏感,丧失对油茶叶的致病力,其表型与ΔCfhac1突变体一致。  结论  上述结果表明,BRLZ是转录因子CfHac1重要的结构域,对CfHac1在果生炭疽菌中行使正常的生物学功能具有重要的调控作用。      

苹果树腐烂病菌分隔蛋白基因VmImp2的功能研究

旨在研究苹果树腐烂病菌(Valsamali) VmImp2基因的功能,以期揭示腐烂病菌的生长发育及致病机理。利用生物信息学软件对 VmImp2进行蛋白序列及进化分析;利用Double-joint PCR和PEG介导原生质转化的方法,获得腐烂病菌 VmImp2的缺失突变体和回补菌株;利用十字交叉法以及伤口接种法,研究 VmImp2对病菌营养生长,繁殖体产生以及致病力的影响。生物信息学分析显示, VmImp2编码1 487个氨基酸,编码蛋白属于PCH(Pombe Cdc15 homology)家族,含有典型的FCH(Fes/CIP homology, F-BAR)和SH3(Src Homology 3)结构域,与梨树腐烂病菌(V.pyri)的Imp2蛋白亲缘最近。对基因进行敲除后,共获得5个缺失突变体菌株。表型分析显示,缺失突变体的营养生长受到明显影响,表现为菌丝更加稀疏,生长速率明显减缓。同时,突变体的繁殖体产生能力以及对枝条的侵染能力基本丧失。5个突变体的表型一致。将基因回补之后,共获得3个回补菌株,突变体表型缺陷基本恢复到野生型水平。说明 VmImp2基因参与苹果树腐烂病菌的营养生长、繁殖体形成以及致病过程。     

柑橘溃疡病菌胞外蛋白水解酶对其致病力的作用

采用异源表达方法从柑橘黄单胞柑橘亚种(Xcc)中国菌株Xcc 29-1中鉴定出6个编码胞外蛋白水解酶的基因.运用同源重组方法将6个编码基因全部敲除,得到胞外蛋白水解酶缺失突变体,对其致病力、形成生物膜的能力和生长繁殖速度进行检测.结果显示,蛋白水解酶突变体在柑橘上的致病力减弱,并且附着到试管壁的细菌数量显著减少,形成生物膜的能力下降.在野生型菌株中过表达蛋白水解酶后,形成的溃疡病斑水渍状程度加大,在柑橘中的繁殖速度变快;在柑橘叶片中,6个胞外蛋白水解酶基因的转录水平都增强表达.这些结果表明Xcc的胞外蛋白水解酶是一个重要的致病因子.     

组氨酸激酶基因barA在水生拉恩菌中的生防调控功能

为探究水生拉恩菌(Rahnella aquatilis)HX2的生防性状表现机制,利用转座子mini-Tn5对HX2菌株进行随机突变,筛选获得1个对葡萄根癌菌K308(Agrobacterium vitis K308)拮抗活性减弱的突变体,并确定该插入位点的基因为双组分调控系统中的组氨酸激酶基因barA。该基因编码的蛋白含有组氨酸激酶结构域HAMP(histidine kinases,adenylyl cyclases,methyl binding proteins,phosphatases)、组氨酸磷酸传递结构域HisKA(histidine kinase acceptor)、C-端催化ATP结合结构域HATPase_C(histidine associated ATPase C terminal)、磷酸接受结构域REC(receiver domain)和含组氨酸的磷酸转移结构域HPT(histidine phosphotransferase domain),是一种跨膜的杂合组氨酸激酶蛋白。通过双交换突变,获得了barA缺失突变体并构建了互补菌株。通过比较分析发现,barA基因缺失后,细菌HX2生物膜形成能力显著提高,但细菌游动和涌动能力降低,以及对葡萄根癌病的生防效果从野生型的86.2%降低至26.7%,构建的互补菌株能够恢复突变菌株在该研究中的所有测定性状。由此推测,组氨酸激酶基因barA是细菌HX2表现生防性状的一个重要调控基因,为生防细菌HX2在植物病害防治上提供理论基础。     

猕猴桃细菌性溃疡病菌T3SS关键效应蛋白基因致病功能

目的 由丁香假单胞菌猕猴桃致病变种（Pseudomonas syringae pv. actinidiae,Psa）引起的猕猴桃细菌性溃疡病是全球猕猴桃产业最具毁灭性的病害。病原细菌主要通过III型分泌系统（type III secretion system,T3SS）将多种效应蛋白（T3SS effector,T3SE）注入寄主植物细胞,进而促进病菌侵染和致病。本研究旨在解析Psa基因组中T3SE的信息并对其T3SS和T3SE的致病功能进行系统分析,为溃疡病菌致病机制的研究和防治策略的制定提供依据。方法 利用marker-free同源重组基因敲除技术获得M228菌株的T3SS功能缺陷突变体ΔhrcS和ΔhrcC,观察突变体在寄主上的致病力,同时检测突变体诱导本氏烟产生细胞坏死的情况;随后利用从Pseudomonas-Plant Interaction数据库下载的T3SE数据库,本地BLAST多序列比对构建强、弱致病菌株M228和M227的T3SE库,并对二者的T3SE基因信息进行比对分析;另外,获得M228菌株T3SE单、多效应子突变菌株20株及2株HopR1基因回补菌株（共涉及19个T3SE）,并将各突变体室内有伤接菌猕猴桃枝条,系统评价各突变体致病力变化并进行统计分析。结果 通过对Psa的hrcS和hrcC基因进行突变,证明T3SS是其在寄主上致病以及非寄主上过敏性坏死反应（HR）所必需的。通过数据库同源比对,发现在强毒株系和弱毒株系中有31个T3SE基因具有100%的同源性,选取一些基因进行缺失突变,发现hopM1/avrE1和hopR1是Psa重要的毒性因子,且二者不存在功能冗余。另外,单独敲除avrPto5或avrRpm1均能提高Psa致病力。在缺失A-F-E基因簇和avrPto5的菌株中,敲除hopM1/avrE1和hopR1也分别导致Psa的致病力显著下降;而同时敲除hopM1/avrE1、hopR1、avrPto5和A-F-E基因簇导致病菌完全丧失致病力。结论HopM1/AvrE1与同家族HopR1均为Psa重要致病因子,且独立于其他效应子发挥作用;avrPto5和avrRpm1基因缺失可以增强Psa的致病力。     

2022 年 5 期目录

  目的  杨絮是由杨树子房胎座表皮细胞发育而来的种毛,近年来已成为我国北方城市环境问题之一。目前对杨树种毛发育基因的研究还不深入,本研究将2个在杨树子房发育过程中差异性表达、且基因注释均与棉纤维发育相关的基因（PeCFL1和PeCFL2）作为种毛发育调控的候选基因,探究二者在欧美杨‘渤丰3号’中表达的时空特异性,为深入研究该基因在杨絮发育过程中的调控作用及基因工程手段改良杨树品种奠定基础。  方法  取‘渤丰3号’杨越冬花枝,采集水培4、5、6、7、8、12 d的雌花序,进行固定、石蜡包埋、切片,观察子房发育及种毛的形态发生过程。采用实时定量PCR检测PeCFL1和PeCFL2基因在‘渤丰3号’杨雌花序发育过程中以及在根、茎、叶等营养器官中的表达模式。利用原位杂交技术检测PeCFL1和PeCFL2基因在杨树花器官中的组织表达特异性,揭示杨絮发育调控相关候选基因PeCFL1和PeCFL2的时空表达模式。  结果  ‘渤丰3号’杨雌花枝水培12 d后,子房胎座底部出现纤维状结构,杨絮开始形成。PeCFL1和PeCFL2在‘渤丰3号’杨根、茎、叶及雌花枝腋芽中微量表达,在水培4 ~ 7 d的雌花序中表达量较少,水培8 d后表达量开始显著升高,12 d时表达量继续大幅上升,此时的石蜡切片可见子房胎座底部纤维状结构。原位杂交结果显示,PeCFL1和PeCFL2基因在杨树子房的子房壁和胎座部位表达。  结论  种毛发育调控相关候选基因PeCFL1和PeCFL2在‘渤丰3号’杨雌花子房胎座底部出现纤维状结构时表达显著升高,并在胎座底部纤维状结构和子房壁中特异性表达,说明其与种毛发育调控密切相关,可作为基因工程改良杨树飞絮的目标基因。      

杨树二氢黄酮醇-4-还原酶基因(DFR)的克隆及反义表达对儿茶素合成的影响

为了验证二氢黄酮醇-4-还原酶基因(DFR)在杨树上的功能,明确DFR对抗病物质儿茶素合成的影响,利用抗病基因防治树木溃疡病提供候选基因。以接种欧美杨细菌性溃疡病菌后6 d的一年生中林46杨树苗干的树皮为材料,利用RT-PCR技术克隆DFR基因的ORF序列,并构建DFR的反义表达载体anti-p BI121-DFR。采用农杆菌介导叶盘法转化84K杨,获得了转反义DFR基因的84K杨4株。用高效液相色谱法检测转基因植株叶片中的儿茶素质量分数,结果显示,4株转反义DFR株其内源儿茶素质量分数分别为0.97、2.4、1.6和0.87 ng/g,与84K野生型植株中儿茶素质量分数(8.9 ng/g)相比显著降低。上述结果表明DFR基因参与了杨树类黄酮生物合成途径,该基因与儿茶素的合成有关。     

林分密度和种植点配置对杨树各器官非结构性碳水化合物的影响

  目的  探究林分密度和种植点空间配置对树木各器官非结构性碳水化合物(NSC)的影响,了解杨树Populus在生长季的碳代谢特征。  方法  试验林分以密度为一级因素,种植点配置为二级因素,采用嵌套设计。于‘南林95’杨P.×euramericana ‘Nanlin 95’生长季(7月)选取叶、枝、树干和粗根4个器官,测定各个器官中NSC (可溶性糖和淀粉) 的质量分数。  结果  在生长季,杨树各器官中可溶性糖质量分数从大到小依次为叶、根、枝、干,淀粉质量分数从大到小依次为干、根、枝、叶。不同林分密度和种植点配置的杨树叶中可溶性糖质量分数差异极显著(P＜0.01),根中可溶性糖和淀粉质量分数受种植点配置影响极显著(P＜0.01),总体上枝和树干受林分密度和种植点配置影响差异不显著。尽管林分NSC总储量在2种密度间(278和400 株·hm?2)差异不显著,但林分NSC总储量在种植点配置间差异显著(P＜0.05)。  结论  在生长季,苏北地区杨树优先将碳资源供给地上部分,其中首要的储存器官是树干。一定密度范围内(278~400 株·hm?2),杨树叶中可溶性糖随林分密度增大而升高。林分密度相同时,正方形的种植点配置方式更有助于杨树个体对NSC的积累,促进植株生长发育,增强林分的固碳潜力。图6表2参35     

陕西省杨树溃疡病菌地理种群研究

对陕西省不同地区杨树溃疡病病原菌研究显示,在关中地区,杨树溃疡病病原菌包括聚生小穴壳(Dothiorella gregaria Sacc.)、金黄壳囊孢(Cytospora chrysosperma Fr.)、杨细盾霉(Coniothyrium populinum Schulz. et Sacc.)和镰刀菌(Fusarium sp.)4种真菌;陕北地区杨树溃疡病主要由C. populinum Schulz. et Sacc.及C. chrysosperma Fr.所致;陕南杨树溃疡病发生少。接种试验表明,聚生小穴壳和杨细盾霉在各地理菌系之间存在着培养性状与致病性分化, 聚生小穴壳致病性较强, 杨细盾霉致病性较弱。     

内蒙古呼和浩特市杨树腐烂病病原菌鉴定

To identify the pathogens causing poplar stem rot in Hohhot of Inner Mongolia.Tissue isolation method was used to isolate fungi from poplar trees in Hohhot.The pathogenicities were verified based on Koch’s rule,morphological,and molecular biological methods were then used to identify the pathogenic fungi.Eight fungi were isolated,and 3 isolates named YSFL1,YSFL3 and YSFL4-2 were found to cause the typical canker symptoms.According to the colony characteristics and sporogenetic morphology,ITS and β-tubulin sequences,they were identified as Cryptosphaeria pullmanensis (YSFL1) and Cytospora chrysosperma (YSFL3,YSFL4-2).This study proved that the pathogens of poplar canker in Hohhot area belonged to C.pullmanensis and C.chrysosperma.This result enriched the diversity of poplar canker pathogens in China,and laid a foundation for the prevention and identification of poplar pathogens in Inner Mongolia.     

2022 年 11 期目录

  目的  次生细胞壁的发育对于木材的形成至关重要,揭示林木次生壁形成的分子调控机制将为改良其木材品质提供理论依据。  方法  （1）本研究从速生型杨树NE19中克隆得到PdKNAT7基因,并构建表达载体,采用花序侵染法转化拟南芥,筛选得到过表达植株。（2）利用农杆菌介导的瞬时转化法侵染烟草,对PdKNAT7进行亚细胞定位。（3）通过徒手切片观察不同基因型拟南芥花薹基部的次生细胞壁厚度。（4）通过真空渗透的方法瞬时转化84K杨。（5）qRT-PCR分析不同品系杨树中PdKNAT7基因的表达情况,并揭示拟南芥和杨树中参与次生壁形成的相关基因的表达模式。  结果  （1）PdKNAT7定位于细胞核。（2）PdKNAT7主要在NE19杨茎中表达,且表达量高于107杨。（3）与野生型相比,过表达PdKNAT7的拟南芥花薹基部的束间纤维壁变薄,木质部纤维壁变厚,而突变体正好相反;另外,突变体的导管壁更厚。（4）过表达PdKNAT7的拟南芥植株中,4CL1、C4H1、CCR1、CesA8、IRX9和IRX10基因的表达量均下调,突变体中与之相反。（5）瞬时转化PdKNAT7基因的84K杨中,4CL3、C4H1、CCR1、CesA8、IRX9和IRX10基因的表达量也下调。  结论  PdKNAT7通过调控木质素和纤维素的积累来影响拟南芥次生细胞壁的厚度。