根癌农杆菌介导转化抗虫基因获得转基因烟草

将抗虫ＰＩ基因构建到ｐＩＧ１２１Ｈｍ质粒的Ｔ－ＤＮＡ上，利用农杆菌ＬＢＡ４４０４介导转化烟草，获再生植株。经ＧＵＳ检测和Ｄｏｔ ｂｌｏｔ分析，证实外源基因已插入植物细胞基因组中，再生植株的转化率为６４．３％。     

大豆体细胞胚胎发生及植株再生

以野生大豆（ＧｌｙｃｉｎｅｓｏｊａｓｉｅｂｅｔＺｕｃｃ）三个品系、半野生大豆（Ｇｌｙｃｉｎｅｇｒａｃｉｌｉｓｓｋｖ）１个品系、栽培大豆（ＧｌｙｃｉｎｅｍａｘＬＭｅｒｒｉｌ）４个品系为材料，进行组织培养．探讨了大豆体细胞组织再生植株的主要影响因素，并以器官分化和体细胞胚两种不同方式再生完整大豆植株。     

不同供体原生质体前处理方法对甘蓝与萝卜属间原生质体融合植株？…

用酶法分离甘蓝下胚轴原生质体和萝卜叶肉原生质体，对供体原原质体（萝卜）进行融合前单因素（酶ＥｃｏＲＩ）或双因素复合处理（酶ＥｃｏＲＩ＋ＵＶ０．０３５～０．１０５Ｊ／ｃｍ＾２），用ＰＥＧ法诱导甘蓝与萝卜属间非对称性原生质体融合。结果表明，（１）不同处理方法对植株再生率有明显影响，对称性融合植株再生率为８．５％，非对称性融合植株再生率低３个百分点；单因素处理植株再生率达１１％，双因素复合处理植株再生率     

几丁质酶基因转化番茄的研究

以金丰一号亲本JM、JF为转化材料，建立了以子叶为外植体的离体再生体系，其芽分化培养基为MS ZT 2．0mg/L IAA0．2mg／L，生根培养基为MS。借助植物双元表达载体pROK，用农杆菌(LBA4404)与番茄子叶外植体共培养，把几丁质酶基因和抗除草剂BAR基因转化到番茄上。经过卡那霉紊和Basta的筛选和再生培养，获得转化再生植株。采用浓度为1000mg/L的Basta除草剂溶液涂抹再生植株后代叶片，表现明显抗性。对转化再生植株进行了PCR检测、Southern检测，表明上述基因已整合进番茄基因组中。     

甜瓜抗CMV转基因植株的分子生物学研究

本研究建立了转目的基因植物基因整台及表达的分子生物学鉴定系统，并用报告基因检测、ＳＤＳ－ＰＡＧＥ、Ｄｏｔ－ＥＬＩＳＡ、ＰＣＲ特异扩增、Ｗｅｓｔｅｒｎ－Ｂｌｏｔ等方法，研究了用叶盘法经Ｔｉ质粒转化的甜瓜再生植株ＣＭＶ－ＣＰ基因的整合与表达。结果表明：再生植株基因组中整合了ＣＭＶ－ＣＰ基因，长度为１ｋｂ，并能有效表达。表达产物分子量为２４Ｋｄ，确为ＣＭＶ的外壳蛋白，其表达量占细胞总蛋白约５％。     

基因枪介导大麦基因转化体系的建立

为了进一步提高基因枪转化效率，研究建立了以澳大利亚品种Franklin幼胚为受体的高效基因枪介导转化体系。结果表明，经愈伤组织诱导、筛选培养，从519块愈伤组织中获得16株再生苗，植株再生率高达3．0％。对长势良好的9株再生苗除草剂抗性检测和目的基因的PCR、PCR-Southern检测证实7株为转基因植株，并经过对外源基因(TrxS)表达活性检测表明，转基因大麦中Trxh的活性是CK的3．3倍，为基因枪高效转化提供了成功的证据。     

CaMV基因Ⅵ在拟南芥上的遗传转化及交叉保护

通过对ＣａＭＶ ＣＡＢＢ－ＢＪＩ和Ｂａｒｉ－１株系基因Ⅵ的克隆和转化，在根癌农杆菌菌种ＧＶ３１０１的介导下，利用真空渗入法获得了转化ＧＡＢＢ－ＢＪＩ和Ｂａｒｉ－１基因Ⅵ的拟南芥转基因植株。分子检测表明，基因Ⅵ已整合进拟南芥基因组并有不同程度的表达。在转基因植株中，出现了类似病毒感染症状、多生长点及花粉生活力较低等个体的变异株。而多数传基因樾株（占转基因植株７０．４％）为无症状的正常植株。对转化Ｃａ     

基因枪轰击高粱愈伤组织获得转基因植株

利用基因枪轰击高粱幼穗愈伤组织，把Bt蛋白基因转移到体细胞中，在20mg／L潮霉素选择培养基上筛选到抗性愈伤组织，并分化出10株再生植株。对经过潮霉素抗性筛选再生的绿色植株取叶片进行GUS活性分析，从10株再生植株中GUS阳性反应的7株，另有3株无GUS表达。对GUS活性表达阳性的植株，利用：PCR和Southern杂交分析，对GUS活性表达阳性的植株7株中，6株扩增出0．6kb左右的DNA杂交信号带，说明Bt已整和到高粱基因组中。以基因枪法将Bt基因转移高粱愈伤组织过程中，高效的组织培养和再生体系的建立是转基因成功的重要因素之一。在遗传转化过程中应避免转基因的嵌合体现象，通过抗生素的浓度及培养时间，可以降低转基因的嵌合体频率。     

苹果叶片再生的改进及抗虫基因植株的获得

用分别含有全部改造和部分改造的Ｂｔ基因植物表达载体ｐＢ４８．７和ｐＢ４８．６的土壤农杆菌转化苹果优良品种（红富士、早生富士、辽伏）的叶片外植体，经过对ＭＳ培养基成分调整，在Ｎｔ保持不变的条件下以（ＮＨ４）：ＳＯ４取代ＮＨ４ＮＯ３，使得转化后再生频率大增，现已获得２３２株转化再生植株，这些植株可以在合５０ｍｇ·Ｌ－１的卡那霉素培养基上生长，选出部分植株作ＰＣＲ检测，表明Ｂｔ基因已被导入这些苹果品种中。     

花生子叶的高频植株再生和基因转化

花生子叶的高频植株再生和基因转化李岩，李兴汉，白世枝，欧阳文军，陈章良（丹东市农科所）（北京大学生命科学学院）植物基因转化技术是植物基因工程必不可少的一环，这一技术首先必须以高频的植株再生系统为基础。现代植物基因工程的转基因手段目前最常用的有两种，即...     

外源基因在转基因抗虫油菜中的遗传行为

为了选育出稳定的转基因抗虫油菜新品种，采用卡那霉素抗性分析和PCR检测技术对转基因抗虫油菜中Bt杀虫蛋白基因的遗传行进行了研究，连续三代的研究结果表明，Bt杀虫蛋白基因以单拷贝、杂合地整合到转基因植株（T01，T02，T03，T05，T06，T07，T08）的基因组中，并稳定地遗传给后代，纯合转基因株系杂交分析表明，在不同T0转基因植株中Bt杀虫蛋白基因整合位点是不同的，T01和T05或T03和T08的Bt杀虫蛋白若整位点是同源染色体的不同座位，而其他转基因植株的Bt杀虫蛋白若整位点是在非同源染色体上。     

农杆菌介导法将pac1基因转入烟草的研究

以烟草叶片为外植体,利用农杆菌介导法首次将pac1基因转入吉林省主栽烟草品种吉烟9号、龙江911-21和云烟87中.经过卡那霉素抗性筛选,初步获得吉烟9号转化植株43株、龙江911-21转化植株61株、云烟87转化植株43株.经PCR检测,转化烟草吉烟9号的PCR阳性率为21/43,龙江911-21的PCR阳性率为32/61,云烟87的PCR阳性率为24/43.经PCR检测为阳性的植株均能扩增出与目的片断大小一致的特异性条带,初步表明pac1基因已经转到这些烟草基因组中.从PCR扩增稳定的转基因烟草中随机抽取5株,同时以非转基因烟草为对照,进行Southern Blot分析,结果表明目的基因pac1己经被成功地整合到烟草基因组中.     

转G10aroA棉花株系的获得及分子生物学鉴定

【目的】培育具有抗草甘膦除草剂的棉花材料具有极其重要的意义。利用农杆菌介导法在棉花中转入编码EPSPS酶的抗草甘膦除草剂基因G10aroA,通过体细胞愈伤诱导组织培养技术获得能够稳定遗传的转基因棉花株系材料。【方法】首先,利用不同草甘膦抗性筛选条件比较分析不同棉花受体材料的愈伤诱导效率;其次,以R15材料作为受体,利用含有G10aroA的农杆菌侵染下胚轴切段,在进行体细胞愈伤诱导的组织培养过程中通过草甘膦抗性筛选获得棉花再生植株,对获得的棉花再生植株进行纯合繁育。在此基础上,利用PCR扩增检测证实外源G10aroA在转基因植株中能够稳定遗传;利用RT-PCR分析其外源基因在转基因植株不同组织中的转录水平进行研究、并进一步利用Western-blot对转基因植株中外源蛋白的表达进行分析。【结果】在优化的草甘膦筛选条件下,以草甘膦浓度为2.5 mmol•L-1的抗性条件进行棉花愈伤诱导筛选并获得棉花再生植株;利用特异引物进行PCR检测结果表明,在检测的全部再生植株中,扩增得到1.8 kb预期大小目标条带的阳性株系32株,其中,收获的27个株系的外源目标基因能够在T0、T1转基因植株中稳定遗传;对G10aroA在转基因株系L12、L14的不同组织中的转录表达进行定量RT-PCR分析表明,外源G10aroA在转基因棉花植株的不同组织中表达具有差异,相对表达量高低依次为茎、苞叶、叶和花;另外,蛋白检测结果进一步表明,该外源基因能够在转基因株系L7、L12和L14中植株中正常表达为预期46 kD的EPSPS蛋白。【结论】通过农杆菌介导法转化外源抗草甘膦基因G10aroA,在草甘膦抗性条件下进行棉花体细胞诱导的组织培养,成功获得转外源G10aroA的棉花再生株系,并通过分子生物学方法研究证实外源G10aroA能够在T0、T1转基因株系中稳定遗传、转录以及表达。     

基因枪介导转hpa99基因小麦的获得和检测

为了探究来源于水稻细条斑病菌(Xanthomonas oryzae pv.oryzicola)的hpa99基因改良小麦抗赤霉病的可行性,以小麦幼胚诱导的愈伤组织为转化受体,以磷酸甘露糖异构酶(phosphomannose isomerase,PMI)作为选择标记,通过基因枪法将带有hpa99基因的表达质粒AF234296导入普通小麦品种山农15。2～3次PMI筛选后,获得38株再生植株。通过氯酚红(chlorophenol red,CPR)染色以及PMI基因和目的基因hpa99的PCR检测,获得7株阳性植株,转化率为0.108%。结果表明,hpa99已整合到小麦基因组中,获得了无抗生素标记基因的转基因小麦。     

甜瓜蔗糖合成酶基因(CmSS1)反义表达载体的构建及遗传转化

以BamHⅠ和SalⅠ双酶切pMD18-T-CmSS1和表达载体pBI121,再用T4 DNA连接酶将回收的目的片段反向与pBI121连接。结果证明,CmSS1反向插入到pBI121中,得到了pBI121-CmSS1的重组质粒;利用农杆菌介导法将反义CmSS1基因转化甜瓜,经PCR检测,得到5株转基因植株。这为以后研究甜瓜蔗糖合成酶的活性调节机制及通过基因工程手段研究甜瓜SS的活性奠定了基础。     

拟南芥钴胺素合成相关蛋白CSRP基因克隆及其功能分析

以拟南芥为研究对象,根据已知的生物信息数据,通过反向遗传学的方法,对与钴胺素合成相关蛋白CSRP基因进行分子克隆,得到该基因的基因组序列和cDNA序列,构建二元重组质粒,利用根癌农杆菌介导的花浸泡转基因方法分别转化突变体和野生型植株,进行互补试验和过表达试验,筛选转基因植株,并进一步预测其编码蛋白的亚细胞定位于叶绿体中.结果表明,在突变体中转入该基因后,转基因植株恢复野生型的表型,而在过表达的转基因植株中表型更为明显,即生长旺盛,晚花.说明该基因对于拟南芥的营养生长起促进作用,由于其功能预测与钴胺素合成相关的蛋白,推测其可能在植物营养生长中起作用.     

Plant Regeneration from Immature Inflorescence Culture and Genetic Transformation of Wheatgrass (Agropyron cristatum × A. Desertorum cv. Hycrest-Mengnong)

The plants of hybrid wheatgrass (A. Cristatum ×A. Desertorum cv. Hycrest-Mengnong) were directly induced from embryogenic callus regenerated from immature inflorescence. Immature inflorescence was cultured on improved MS medium containing 2.0-3.0 mg L-1 2,4-D to regenerate callus. The calli were then transferred to hormone-free MS medium for differentiation and 1/2 MS medium for rooting. Results showed that callus initiation frequency was 83.4% and plant regeneration frequency was 59.6%. Phosphinothricin acetyltransferase (bar) gene was transformed into the hybrid wheatgrass by particle bombardment. Resistant callus was obtained using selecting agent, herbicide glufosinate of 0.5 mg L-1, and some transgenic plants were recovered in vitro. The transgenic plants were identified by PCR and Southern blot analysis and these plants developed normally in the glufosinate medium, whereas the nontransgenic plants did not. The results demonstrated that bar cDNA integrated into the genomic DNA of the transgenic plants. The transgenic frequencies of bar gene were 1.1%.     

拟南芥bZIP23基因过量表达载体的构建及过表达植株的筛选

[目的]以拟南芥为材料克隆bZIP23基因,构建bZIP23基因的过量表达载体和筛选过表达植株,为验证其功能奠定基础.[方法]提取拟南芥总RNA和RT-PCR克隆bZIP23基因,用限制性内切酶切割和T4 DNA连接酶连接,使bZIP23基因连接到35S强启动子的pART27载体上;将连接产物转化到Trans1-T1感受态细胞中,筛选阳性单克隆进行菌落PCR鉴定并测序验证,获得重组质粒.将该重组质粒电激转化至根瘤农杆菌GV3101菌株,浸花法转化拟南芥野生型植株.[结果]通过单菌落PCR鉴定和DNA测序结果显示,bZIP23基因与35S过量表达载体已连接,获得了重组载体;抗性筛选与遗传鉴定获得相应的转基因过量表达阳性植株.[结论]构建的过量表达载体及筛选得到的过量表达植株为验证bZIP23基因功能奠定了基础.     

抗除草剂基因在粳稻恢复系中的基因枪转化及其在后代中的表达

利用基因枪法把抗除草剂基因bar基因导入粳稻恢复系超优一号,经PCR,PCR-southern杂交分析,证明外源基因已整合到水稻基因组中,且能稳定遗传;田间喷施除草剂抗性检测结果表明,bar基因在转基因恢复系及后代中均表达,表现抗除草剂,在恢复系与不育系所配制的杂交种中,高效表达,表现高抗除草剂;部分转基因植株T1代分离比符合孟德尔显性单基因的遗传规律,即3∶1规律,部分不符合。     

转hrfAXoo基因水稻对白叶枯病的抗性

将来自水稻白叶枯病菌(Xanthomonas oryzae pv．oryzae)编码harpinxoo的hrfAxoo基因连接到双元载体pBI121上，构建成含hrfAxoo基因的植物表达质粒pBMH9。以粳稻R109成熟胚诱导愈伤组织，由根癌农杆菌EHA105介导，将含有hrfAxoo基因的重组质粒pBMH9转化水稻愈伤组织。用G-418抗生素做抗性筛选，产生抗性愈伤组织的频率为85％，转化植株的再生频率为53％。根据hrfAxoo基因两端序列和pBMH9中外源片断的旁侧序列设计2对引物，通过PCR扩增验证转化水稻中的靶基因序列。对部分转基因水稻进行RT—PCR和Northern blot分析，结果显示hrfAxoo基因在转基因水稻中能正常表达。抗病性鉴定结果表明，转基因水稻在，ID、T1和T2代对水稻白叶枯病有较好的抗性；在转基因系中水稻白叶枯病菌的生长明显受到抑制。因此，本研究获得对水稻白叶枯病抗性提高的转基因水稻。