烟草抗马铃薯Y病毒病相关基因NtPsaN的克隆及表达分析

【目的】从高抗PVY烟草品种VAM中克隆抗病相关基因,分析该基因的序列特征、进化关系和表达特性,研究其在烟草抗PVY防御反应中的作用,为培育抗PVY烟草新品种奠定基础。【方法】利用SSH结合cDNA芯片筛选出来的病害诱导特异表达基因片段,通过RACE技术克隆烟草抗病相关基因;生物信息学分析该基因保守结构域以及序列特征;采用MEGA4.0软件构建系统进化树;利用实时荧光定量RT-PCR技术研究该基因的表达特性。【结果】克隆了1个烟草抗病相关基因,命名为NtPsaN,该基因具有PsaN基因家族保守结构域,OFR长度507bp,编码168个氨基酸;构建了PsaN亚基系统进化树;实时荧光定量RT-PCR结果显示接毒之后该基因表达与不接毒对照相比有明显上调趋势。【结论】克隆得到一个烟草PVY抗病相关基因NtPsaN,其表达受PVY侵染诱导,该基因可能在烟草抵御PVY病害侵染过程中起重要作用。     

甘蔗水分胁迫响应相关醛脱氢酶基因的克隆及其表达特征分析

 【目的】筛选并克隆与水分胁迫相关的基因,通过对目的基因的表达分析进一步解析植物的抗旱机制,为甘蔗抗逆育种提供候选基因和理论依据。【方法】应用消减文库技术结合cDNA芯片技术筛选水分胁迫诱导的基因的EST序列,根据筛选到感兴趣的上调表达基因的EST序列,用RACE技术获得SSADH的全长cDNA序列,并通过实时荧光RT-PCR技术对该基因的表达特征进行分析。【结果】通过消减文库技术结合cDNA芯片技术筛选的EST中含有4个推测为基因SSADH 的EST,其在水分胁迫处理的斑茅中均明显上调表达。通过RACE扩增获得甘蔗SSADH全长cDNA序列为1 914 bp,其中5′端非编码区25 bp,开放阅读框为1 581 bp,3′端非编码区306 bp,在1 749处有终止加A信号AATAA。克隆的甘蔗全长cDNA序列进行NCBI比对分析显示,所克隆的甘蔗SSADH全长cDNA与拟南芥（NM_106592.3）的ALDH5F1同源性为73%,表明克隆的cDNA序列可以归为甘蔗的醛脱氢酶家族基因ALDH5F1。通过荧光实时PCR分析SSADH表达表明,该基因参与干旱胁迫下的全程响应,并证明水分胁迫下该基因表达与Ca2+的存在调控关系。【结论】克隆了甘蔗基因SSADH,该基因为一个水分胁迫响应基因;SSADH的植物在体表达与Ca2+存在调控关系。克隆的基因SSADH可用于植物抗逆性调控研究。     

山葡萄VaCBF1转录因子基因的克隆与表达分析

【目的】克隆山葡萄(Vitis amurensis)CBF1转录因子基因(VaCBF1),为其功能的深入研究及其在植物抗寒基因工程中的应用奠定基础。【方法】根据植物CBF基因AP2/EREBP保守区设计1对简并引物,利用PCR法从山葡萄cDNA中扩增VaCBF1基因的中间片段。再根据中间片段区域设计2对特异引物,采用反向PCR法扩增VaCBF1基因的5′端和3′端序列。将中间片段与5′端和3′端序列拼接后得到山葡萄VaCBF1基因的cDNA全长序列,据此设计1对特异引物,PCR扩增VaCBF1基因编码区的全长序列,并对其进行生物信息学分析。同时,利用荧光定量PCR分析山葡萄VaCBF1基因在不同逆境胁迫(干旱、低温、盐胁迫)下的表达情况。【结果】成功地从山葡萄中克隆得到VaCBF1基因cDNA全长序列,其长度为762bp,编码253个氨基酸,在GenBank注册号为DQ517296。同源性分析证实,VaCBF1属于CBF转录因子家族。荧光定量PCR分析发现,低温胁迫可以诱导山葡萄VaCBF1基因高表达,而该基因的表达不受盐及干旱处理诱导。【结论】首次从山葡萄中克隆了VaCBF1基因,并证实该基因参与了植物对低温胁迫的应答。     

激发子PB90诱导不结球白菜过敏性细胞死亡早期上调表达基因片段的分析

【目的】从基因组水平筛选不结球白菜中受激发子PB90诱导过敏性细胞死亡早期上调表达的基因。【方法】采用抑制性差减杂交的方法筛选疫霉菌激发子PB90注射处理不结球白菜叶片5 h内上调表达的基因。【结果】测定分析了200个上调表达的cDNA片段,生物信息学分析表明它们包含70个上调表达的基因片段,共分为9类：基本能量或代谢产物;蛋白质合成分解;细胞信号传导;细胞凋亡;转录;运输相关和编码未知功能的蛋白等。进一步用半定量RT-PCR分析了候选基因beclin,thioredoxin,HLA-B,MAP3K,SPT1, SPT2和AGO1,表明这7个基因在PB90诱导不结球白菜过敏性细胞死亡早期上调表达。【结论】构建了疫霉菌激发子PB90诱导不结球白菜过敏性细胞死亡早期抑制性差减杂交cDNA文库,获得了70个上调表达的基因,并对其中7个基因的可能功能进行预测分析,认为这些基因可能与疫霉菌激发子PB90诱导不结球白菜过敏性细胞死亡有关。这些基因的挖掘为进一步阐明过敏性细胞死亡的分子机制提供了素材。     

玉米ZmSCL7的克隆及功能研究

【目的】对玉米SCARECROW-LIKE 7（SCL7）进行克隆与表达研究,了解该基因表达的分子机制及其应用。【方法】以玉米叶片总RNA为模板,根据同源克隆策略设计简并引物,利用RT-PCR结合RACE技术,获得ZmSCL7的全长cDNA序列。利用同源性比对进行序列分析,通过Northern杂交分析ZmSCL7在不同逆境胁迫下的表达特征,对转基因烟草进行Western blot分析,并测定最大光化学效率、叶绿素、丙二醛和脯氨酸含量验证该基因的抗盐功能。【结果】获得ZmSCL7全长cDNA序列1 653 bp,编码550个氨基酸。Northern杂交表明该基因在NaCl、H2O2和低温处理条件下上调表达,在ABA处理条件下下调表达。与对照相比,转ZmSCL7烟草在200 mmol•L-1NaCl时萌发受到较小抑制,且最大光化学效率、叶绿素和脯氨酸含量上升,丙二醛含量下降。【结论】ZmSCL7作为一个转录因子受多种逆境胁迫诱导,该基因的过量表达提高了烟草的抗盐性。     

多抗PVY、TMV和CMV转基因烟草的培育

 【目的】利用RNA介导抗性培育抗多种植物病毒的转基因烟草。【方法】分别以马铃薯Y病毒（PVY）、烟草花叶病毒（TMV）和黄瓜花叶病毒（CMV）全长衣壳蛋白（CP）基因为模板,通过设计PCR引物和亚克隆获得PVY CP 3′端长度100 bp、TMV CP 3′端长度100 bp和CMV CP 3′端长度200 bp的cDNA片段并拼接成嵌合基因,并以此为模板构建反向重复结构嵌合基因的植物表达载体pRHPTC。将pRHPTC通过冻融法导入农杆菌LBA4404,采用叶盘法转化烟草NC89,然后测定转基因烟草对3种病毒的抗性。【结果】经卡那霉素筛选和PCR检测,共获得276株转基因烟草。Southern和Northern blot分析表明,外源基因以不同拷贝数整合于烟草基因组中;不同转基因植株中病毒RNA的积累量存在显著差异。抗病性检测显示：23%左右的转基因植株表现出对3种病毒侵染的抗性。对转基因植株扩繁后代和T1代的抗性分析表明：多病毒抗性表现稳定。【结论】利用RNA介导的抗病毒基因工程可获得同时抗多种病毒的转基因烟草,其抗病性在T0代扩繁植株和T1代植株中得到稳定遗传。     

一种全长cDNA抑制缩减杂交方法及其水稻诱导表达基因分离的应用

以缩减杂交的原理和SMART cDNA合成方法为基础,开发了一种全长cDNA缩减杂交方法.该方法从微量的2个RNA样品合成全长cDNA,经PCR扩增和在两端连接不同的接头,通过2次缩减杂交获得含有高度浓缩的差异表达的全长或较大的基因片段,克隆后筛选出差异表达的基因.以噻菌灵(Probenazole,PBZ)为诱导剂处理水稻,获得了2个上调表达和1个下调表达基因的较长的cDNA片段.     

南方根结线虫诱导辣椒基因CaRKNIF2的克隆与分析

 【目的】明确辣椒(Capsicum annuum L. HDA149)中与南方根结线虫(Meloidogyne incognita)不亲和互作过程中抗性相关WRKY转录因子的基因结构及其表达模式。【方法】采用RACE结合RT-PCR方法克隆cDNA序列,并根据cDNA序列设计特异引物扩增DNA序列,Southern杂交确定基因拷贝数,实时荧光定量PCR方法分析该基因在线虫侵染后辣椒的不同组织和不同时间点的表达。【结果】从辣椒中克隆到一个WRKY转录因子基因CaRKNIF2(GenBank登录号：GQ253367),该基因编码区全长1 662 bp,编码553个推定的氨基酸,为单拷贝基因。CaRKNIF2基因编码区全长DNA序列2 530 bp,包含5个内含子和6个外显子。在线虫接种诱导处理时,该基因表达具有组织特异性,根尖组织中的表达量最高;接种3 h后在根尖组织中的表达量开始升高,12 h最高,此时相对表达量约为3.1倍。【结论】CaRKNIF2在线虫接种处理后的表达上调,表明该基因参与了抗性基因Me3介导的辣椒与根结线虫的不亲和互作,可能在此过程中具有重要功能。     

陆地棉干旱胁迫响应基因GhGR的克隆及特征分析

【目的】克隆陆地棉干旱胁迫谷胱甘肽还原酶基因（GhGR）,并对其序列进行生物信息学分析和表达分析。【方法】利用RACE和RT-PCR技术克隆陆地棉谷胱甘肽还原酶基因的全长序列,应用生物信息学软件对获得的基因序列及编码的蛋白序列进行分析;通过基因枪转化和实时荧光定量PCR表达对该基因表达部位和表达模式进行分析。【结果】从陆地棉（Gossypium hirsutum L.）中克隆了谷胱甘肽还原酶基因GhGR,cDNA全长1 035 bp,其中,ORF为792 bp,编码263个氨基酸。氨基酸序列比对和同源性分析显示该基因与杨树（XP_002299276.1）、蓖麻（XP_002518118.1）、葡萄（CAN74593.1）同源性最高,分别为90%、91%和91%。系统发育树结果显示,GhGR与葡萄中该蛋白的亲缘关系最近。基因枪转化和实时荧光定量PCR分析表明GhGR定位于洋葱的细胞膜和细胞核膜,并且其表达量受干旱胁迫诱导上调表达。【结论】从陆地棉克隆得到谷胱甘肽还原酶基因GhGR,初步认为该基因对干旱胁迫有一定响应。     

甘蓝型油菜BnClo1基因克隆、表达载体的构建及原核表达

【目的】克隆甘蓝型油菜(Brassica napus)油体钙蛋白(caleosin)基因BnClo1,并进行原核表达研究。【方法】在获得甘蓝型油菜BnClo1基因全长cDNA的基础上,根据BnClo1基因编码区设计1对特异引物,以甘蓝型油菜种子总RNA为模板,通过RT-PCR获得了约750bp的cDNA片段,T/A克隆后进行序列测定。随后将该蛋白成熟肽cDNA片段克隆到原核表达载体pTYB12中,构建融合表达载体pTYB12-BnClo1,转化到Escherichia coli ER2566(DE3)中进行表达。【结果】测序结果显示,RT-PCR获得的cDNA全长768bp,包含完整的开放阅读框738bp,编码245个氨基酸残基,caleosin分子量为28.1kD。原核表达产物经SDS-PAGE分析表明,以20℃、4mmol·L-1IPTG诱导该基因表达效果最好,诱导产物为一个与理论值相符的83.1kD的融合蛋白intein-caleosin。【结论】克隆了油菜BnClo1基因,并在大肠杆菌中进行了优化表达。为进一步纯化和鉴定目的蛋白,及研究其功能奠定了试验基础。     

甘蔗可溶性酸性转化酶（SoSAI1）基因的克隆及表达分析

【目的】克隆甘蔗可溶性酸性转化酶基因（SoSAI1）全长cDNA序列和5?侧翼启动子序列,并分析其序列特征和基因表达模式。【方法】利用RACE技术克隆SoSAI1的全长cDNA序列,应用生物信息学软件分析SoSAI1预期编码蛋白特征;采用Genome Walking技术克隆SoSAI1的启动子序列;采用实时荧光定量PCR分析不同生长期SoSAI1在甘蔗叶和茎中的表达,以及PEG 6000、100 mmol•L-1 NaCl和6℃胁迫下,SoSAI1在甘蔗苗期根和叶中表达模式。【结果】SoSAI1的cDNA序列全长为2 387 bp,ORF长2 058 bp,编码685个氨基酸,预测其分子量和等电点分别为74.44 kD和5.6,GenBank登录号为JQ406875。5?侧翼启动子序列长417 bp,含有胚乳特异表达顺式作用元件和参与干旱诱导的MYB结合位点,GenBank登录号为KC862314。SoSAI1表达在生理成熟期的花序和花序轴中较高,而在成熟茎和老茎中较低。15%PEG和6℃能诱导叶中SoSAI1表达,而15%PEG和NaCl能诱导根中SoSAI1表达。【结论】获得SoSAI1全长cDNA序列和部分启动子序列,SoSAI1在甘蔗生长发育和蔗糖积累,并在应对环境胁迫中发挥作用。     

烟草靶斑病菌内切多聚半乳糖醛酸酶基因endoPGs的克隆及表达特征分析

【目的】内切多聚半乳糖醛酸酶（endo polygalacturonases,endoPGs）是重要的致病因子之一。论文从烟草靶斑病菌（Rhizoctonia solani）强致病力菌株YC-9和弱致病菌株LF-2中克隆该致病基因,分析比较该基因的序列特征、进化关系和表达特性,研究其在与烟草互作过程的致病作用。【方法】通过比较GenBank中不同植物病原真菌的endoPGs序列设计简并引物,首先获得菌株YC-9及LF-2的endoPGs基因片段,再采用RACE技术克隆获得其cDNA全长序列;生物信息学分析比较其保守结构域及序列特征;采用MEGA 4.0软件构建endoPGs的系统进化树;通过real-time RT-PCR技术对强致病力菌株YC-9及弱致病力菌株LF-2的endoPGs与烟草K326互作的表达特性进行研究。【结果】克隆获得了烟草靶斑病菌强致病力菌株YC-9和弱致病力菌株LF-2的endoPGs的cDNA全长序列,分别命名为endoPG1和endoPG2,开放阅读框（ORF）长度均为1 086 bp,编码361个氨基酸;比较分析表明endoPG1和endoPG2的推测蛋白均具有PLNO3003基因家族保守结构域,其跨膜结构间存在差异;成功构建了该基因系统进化树,结果表明来自烟草靶斑病菌的endoPGs构成独立分支,且烟草靶斑病菌endoPG1及endoPG2同源关系最近;real-time RT-PCR表达特性分析结果显示,靶斑病菌endoPG1和endoPG2与烟草互作（接种）之后该基因的表达与未互作（不接种）的对照样品相比均呈明显上调趋势,同时endoPG1表达迅速且高于endoPG2。【结论】 烟草靶斑病菌强致病力菌株YC-9及弱致病力菌株LF-2的内切多聚半乳糖醛酸酶基因均具有PLNO3003基因家族的保守结构域,其推测蛋白的跨膜结构间存在差异,该推测蛋白与烟草靶斑病菌同源关系最近,且endoPG1和endoPG2的推测蛋白的同源性最高;内切多聚半乳糖醛酸酶基因的表达受与烟草互作的诱导,在不同致病力菌株中存在明显差异。     

甜菜夜蛾触角气味受体基因OR18的克隆和表达定位

【目的】从甜菜夜蛾（Spodoptera exigua）成虫触角中克隆气味受体基因,研究受体基因在虫体不同组织和触角不同感受器中的表达分布,从而探讨受体基因的功能。【方法】通过PCR结合RACE技术克隆气味受体基因的全长序列,利用实时定量PCR检测其在不同组织中的表达,采用原位杂交确定其在触角不同感受器中的分布。【结果】通过同源克隆的方法从甜菜夜蛾触角中获得1条740 bp的基因片段,通过RACE技术获得全长序列并命名为SexiOR18（GenBank登录号JN873314）。SexiOR18 cDNA全长1 618 bp,开放阅读框长度为1 194 bp,编码398个氨基酸。序列比对和进化树分析结果显示SexiOR18与其它鳞翅目昆虫尤其是夜蛾科昆虫的OR18具有很高的相似性。实时定量PCR检测结果显示,SexiOR18主要在成虫触角中表达,且在雌虫中的表达量显著高于雄虫,SexiOR18在成虫其它组织和幼虫触角中无明显表达。原位杂交结果显示,SexiOR18主要在毛形感器和锥形感器下表达,而在腔锥形感器和刺形感器下没有表达。【结论】SexiOR18在感受性信息素和普通气味的毛型感器和锥形感器中都有分布,推测其可能参与了性信息素和普通气味分子的识别。     

紫色马铃薯查尔酮合成酶基因(CHS)的克隆及分析

【目的】从紫色马铃薯中克隆CHS的cDNA全长序列,并分析其组织表达水平以及诱导剂处理后基因的表达与花青素含量积累之间的关系。【方法】采用RT-PCR和RACE方法克隆紫色马铃薯CHS的cDNA全长序列,通过在线软件进行核苷酸序列和氨基酸序列分析,半定量RT-PCR检测StCHS在紫色马铃薯组织中的表达特异性以及蔗糖和赤霉素处理后StCHS的表达。采用分光光度计法测定紫色马铃薯花青素含量。【结果】克隆获得紫色马铃薯CHS的cDNA全长1 490 bp,包含1 170 bp的ORF,该基因编码389个氨基酸。推测StCHS蛋白含有Cys164、Phe215、His303和Asn336 4个活性位点,构成CHS蛋白的催化中心。StCHS的表达具有组织特异性,在茎、叶柄和叶中表达较强,在根、块茎和叶轴中几乎检测不到CHS的表达。赤霉素能促进CHS的表达从而促进花青素的积累;蔗糖能够显著促进紫色马铃薯花青素的积累,但对CHS的表达影响不明显。【结论】从紫色马铃薯中克隆获得CHS的cDNA全长序列,该基因表达具有组织特异性,StCHS是紫色马铃薯花青素合成途径中的一个限速酶基因。     

油菜BnICE1的克隆及表达分析

【目的】从超强抗寒油菜品种陇油6号中克隆抗寒转录因子BnICE1,并对其进行序列特征分析,研究BnICE1在低温胁迫下表达水平的变化,探讨BnICE1对油菜耐低温胁迫能力的影响。【方法】利用RACE技术获得油菜BnICE1全长的cDNA序列。对该序列进行生物信息学分析,采用实时荧光定量PCR研究BnICE1低温及不同组织表达量。【结果】cDNA片段全长1 737 bp,包含1 500 bp完整的开放阅读框,该基因编码499个氨基酸残基,分子量53.2 kD,等电点5.0。序列比对表明,该蛋白C端含有一个典型的bHLH结构域,与其它植物的ICE1蛋白具有较高的同源性,因此命名为BnICE1（GenBank登录号为JF268687）。进化树分析表明,BnlCE1同羊草和白菜亲缘关系较近。实时荧光定量PCR结果表明,该基因在油菜茎、叶和下胚轴均有表达,下胚轴中表达量最高,同时该基因的表达受低温胁迫诱导。【结论】从油菜中克隆了抗寒基因BnICE1,实时荧光定量PCR分析表明其在油菜适应低温胁迫的过程中发挥作用。     

番茄抗病品种吉美08 SlDFR基因的克隆与表达

【目的】克隆番茄（Solanum lycopersicum）抗病品种吉美08二氢黄酮醇4-还原酶（dihydroflavonol 4-reductase,DFR）基因,并分析枯萎病菌尖孢镰刀菌番茄专化型（Fol4287）诱导下其在番茄不同组织中的表达模式,为深入研究SlDFR基因在番茄抗病过程中的调控机制提供理论依据。【方法】采用同源克隆技术从番茄中克隆SlDFR基因cDNA全长序列,并进行生物信息学分析,采用实时荧光定量PCR（qRT-PCR）检测番茄根、茎、叶中SlDFR基因在枯萎病菌诱导下的表达模式。【结果】从番茄抗病栽培品种吉美08中克隆得到SlDFR基因,cDNA序列全长1659 bp,包含1个1149 bp的开放阅读框（ORF）,编码379个氨基酸。SlDFR蛋白的相对分子质量为42.43 kD,等电点（pI）为6.08,是一个亲水的、稳定的酸性蛋白,亚细胞定位在高尔基体上,无信号肽和跨膜结构域,有38个磷酸化位点,其中,丝氨酸18个,苏氨酸15个,酪氨酸5个。SlDFR蛋白的二级结构中α-螺旋占37.73%,延伸链占13.98%,无规则卷曲占40.69%。系统发育进化树分析结果表明,SlDFR蛋白序列与同属茄科马铃薯（Solanum pennellii）亲缘关系较近,其次为黑果枸杞（Lycium ruthenicum）。qRT-PCR分析结果显示,SlDFR基因在番茄叶中表达量最高,在根中表达量最低。SlDFR基因在番茄根、茎、叶中表达量受番茄枯萎病菌诱导,均呈现不同程度上调,其中,在根中表达量变化最大,在叶中表达量变化较小,推测SlDFR基因的表达量与番茄枯萎病菌胁迫响应有关,且番茄根部类黄酮的合成为重要胁迫响应途径。【结论】SlDFR基因表达量受Fol4287的诱导,可能参与番茄枯萎病胁迫响应过程,且对番茄枯萎病菌的响应在番茄根部更强烈,并通过调控番茄根部黄酮类物质的合成提高根系分泌物的抑菌活性从而增强番茄对枯萎病的抗性。