灰葡萄孢T-DNA插入细胞壁缺陷突变体的筛选

用荧光增白剂Calcofluor White(CFW)对234株T-DNA插入灰葡萄孢突变株进行筛选,获得了3株对CFW敏感性(B-117,B-169,D-9)和1株对CFW抗性(B-62)的突变株。1.2 mol·L-1 Sorbito对D-9的生长缓慢有挽救作用。在SDS培养基上D-9和野生型的差异不大,但在NaCl培养基上野生型的生长受到抑制,D-9则不受NaCl影响。在孢子萌发试验中,D-9突变株也与野生型明显不同,表现为D-9的孢子膨大、菌丝较粗、长度增加而且不弯曲。在番茄感染试验中,D-9突变株侵染番茄的毒力大幅度减弱。由此推测D-9突变株与细胞壁缺损以及致病性有关。     

灰葡萄孢菌核形成缺陷突变体的遗传分析

本研究通过筛选灰葡萄孢的ATMT突变体库,获得了1株不形成菌核,孢子产量明显减少,对番茄叶片的致病力明显增强的菌株BCt41。通过对该菌株进行PCR、Southern杂交鉴定,证明该菌株为遗传稳定的单拷贝T-DNA插入突变体。通过TAIL-PCR技术获得了T-DNA插入位点的侧翼序列,与灰葡萄孢数据库比对表明:T-DNA插入位点位于基因BC1G_02176.1的外显子2中。该基因编码区长1 206bp,含1个54bp内含子,编码383个氨基酸,基因功能未知。本研究结果为进一步研究该基因在灰葡萄孢分生孢子发育、菌核形成及致病过程中的作用奠定了基础。     

杆菌介导灰葡萄孢菌株RoseBc-3的遗传转化

观察了农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)介导转化灰葡萄孢(Botrytis cinerea)菌株RoseBc-3的影响因素,并对遗传转化的有效性进行评估.结果表明:农杆菌与灰葡萄孢共培养的温度和灰葡萄孢分生孢子浓度均能影响转化效率,当共培养温度为22℃、灰葡萄孢分生孢子浓度为1×105个/mL时,转化效率最高,平均每平皿(直径9 cm)转化子数量超过100个;通过特异性引物介导的PCR和特异性探针杂交方法,证明所获得的转化子是农杆菌中T-DNA插入造成的,且大多数(87.5％)T-DNA插入为单拷贝插入;从灰葡萄孢T-DNA插入体库筛选获得了6类突变体,即产孢显著减少或不产孢突变体(占3.8％)、菌丝生长速率减慢突变体(占3.5％)、菌丝稀疏突变体(占1.6％)、菌落颜色异常突变体(占5.7％)、致病力丧失突变体(占3.3％)和致病力增强突变体(占3.0％).采用反向PCR技术和hi-TAIL PCR技术从14个灰葡萄孢突变体菌株中获得了T-DNA侧翼序列,且发现T-DNA在基因编码区和非编码区插入的频率是相同的.     

灰葡萄孢犬尿氨酸单加氧酶基因BcKMO与病菌cAMP信号途径的关系

【目的】明确灰葡萄孢（Botrytis cinerea）犬尿氨酸单加氧酶基因BcKMO与病菌cAMP信号途径之间的关系,为进一步阐明BcKMO调控灰葡萄孢生长、发育和致病力的分子机制打下基础。【方法】利用cAMP信号途径特异性抑制剂SQ22536,检测灰葡萄孢野生型BC22、BcKMO的T-DNA插入突变体BCG183和回复菌株BCG183/BcKMO对cAMP信号途径特异性抑制剂的敏感性;分别提取灰葡萄孢野生型BC22、突变体BCG183和回复菌株BCG183/BcKMO中的cAMP,利用HPLC检测各菌株中cAMP的含量;利用real-time PCR技术检测BcKMO与cAMP信号途径中cAMP依赖的蛋白激酶（PKA）的催化亚基基因pka1和pka2、调节亚基基因pkaR、编码异源三聚体G-蛋白Gα亚基基因bcg2和bcg3在病菌不同发育阶段、组织部位以及培养条件下的表达规律;利用real-time PCR技术检测BcKMO突变体中cAMP信号途径关键基因pka1、pka2、pkaR、bcg2、bcg3的表达水平;利用real-time PCR技术检测cAMP信号途径关键基因pka1、pka2、pkaR、bcg2、bcg3的RNAi突变中BcKMO的表达水平。【结果】灰葡萄孢BcKMO的T-DNA插入突变体BCG183对cAMP信号途径特异性抑制剂SQ22536不敏感,受抑制的程度明显低于野生型BC22和回复菌株BCG183/BcKMO。BcKMO的T-DNA插入突变体BCG183中cAMP含量明显低于野生型菌株BC22和回复菌株BCG183/BcKMO。BcKMO与cAMP信号途径中cAMP依赖的蛋白激酶（PKA）的催化亚基基因pka1、编码异源三聚体G-蛋白Gα亚基基因bcg2和bcg3的表达规律基本一致,均为在7 d的菌丝和菌核中表达水平较高;此外,BcKMO和cAMP信号途径关键基因pka1、pka2、pkaR、bcg2、bcg3均为在含果糖培养基上培养的病菌中表达水平较高。BcKMO的T-DNA插入突变体BCG183中cAMP信号途径关键基因pka1、pka2、pkaR、bcg2、bcg3的表达水平均明显高于野生型BC22和回复菌株BCG183/BcKMO。pka1、bcg2的RNAi突变体中BcKMO表达水平明显高于野生型,而pka2、pkaR、bcg3的RNAi突变体中BcKMO表达水平明显低于野生型。【结论】BcKMO负调控cAMP信号途径关键基因pka1、pka2、pkaR、bcg2、bcg3的表达;cAMP信号途径关键基因pka1、bcg2负调控BcKMO的表达,而cAMP信号途径关键基因pka2、pkaR、bcg3正调控BcKMO的表达。     

人参灰葡萄孢对氯氟醚菌唑敏感基线的建立及抗药性监测

为了解人参灰葡萄孢对氯氟醚菌唑的抗药性情况，采用菌丝生长速率法测定了人参灰葡萄孢对氯氟醚菌唑的敏感性，采用最小抑菌浓度法监测人参灰葡萄孢对氯氟醚菌唑的抗药性。结果表明：氯氟醚菌唑对供试的148株人参灰葡萄孢菌株的EC₅₀值为0.008 4～2.795 8 mg/L,其敏感性频率分布呈连续单峰曲线，经K-S法检验符合正态分布，未出现敏感性明显下降的抗药性菌株群体，EC₅₀平均值为0.174 4 mg/L,可作为人参灰葡萄孢对氯氟醚菌唑的敏感基线；不同地区来源、不同年份分离的人参灰葡萄孢菌株对氯氟醚菌唑的敏感性差异显著(P<0.05);所检测的人参灰葡萄孢菌株对氯氟醚菌唑的抗药性水平多数为敏感菌株和低抗菌株，只有吉林省抚松县和集安市有少量中抗和高抗菌株，抗性频率均在3.70%以下。本研究为氯氟醚菌唑防治人参灰霉病提供了技术依据。     

利用CRISPR/Cas9技术编辑OsRR22基因创制耐盐水稻种质资源

水稻是重要的粮食作物之一,在盐碱地开发和改良中发挥着重要作用。为了创制高耐盐水稻种质资源,利用CRISPR/Cas9基因编辑技术,在水稻品种盐丰47中对OsRR22设计3个靶位点进行基因编辑。通过PCR和测序鉴定,在T₀代获得16个突变单株,其中靶位点1和靶位点2均有纯合突变,靶位点3没有检测到突变。在T₁代转基因株系中,获得3株纯合突变且无T-DNA插入的纯合突变体。对T₂代进行农艺性状分析发现,与野生型相比,突变体的株高显著降低,产量相关农艺性状均无显著变化。苗期耐盐性鉴定结果表明,在200 mmol/L NaCl处理7天后,突变株的存活率比野生型提高30%以上。综上,利用CRISPR/Cas9技术对水稻品种盐丰47进行了耐盐性改良,为耐盐水稻新品种的培育提供了理论和材料基础。     

稻曲病菌突变体B-726生物学性状分析及其T-DNA插入位点侧翼序列的克隆

【目的】分析稻曲病菌T-DNA插入突变体库中致病力减弱突变菌株B-726的生物学性状,分析其T-DNA插入位点的侧翼序列,克隆因外源基因插入被破坏正常表达的基因,为明确该基因在稻曲病菌致病过程中的作用奠定基础,并为稻曲病防治新途径的制定提供理论依据。【方法】通过测定突变菌株B-726生长速率、产孢能力及致病力检测,分析其生物学性状;Southern杂交分析B-726外源基因插入的拷贝数;利用HiTail-PCR 获得T-DNA插入位点的侧翼序列;运用RACE-PCR技术,克隆与插入位点毗邻的基因全长;用半定量RT-PCR分析该基因表达情况。【结果】突变菌株B-726与野生菌株P1相比致病力极显著下降,产孢能力、生长速率显著下降。Southern杂交结果显示T-DNA在菌株B-726中以单拷贝形式插入。经过序列分析发现,T-DNA插入在1个命名为Uvt-726上游344 bp处,半定量PCR结果表明,Uvt-726在B-726表达量较P1显著下降。【结论】克隆了1个可能与稻曲病菌致病力相关的基因,推断该基因在稻曲病菌致病过程中起着重要的作用。     

亚油酸乙醇胺诱导番茄对灰葡萄孢抗性的作用及机制

【背景】灰葡萄孢（Botrytis cinerea）引起的灰霉病是危害番茄（Solanum lycopersicum）的重要病害之一,防治不及时可造成30%—40%减产。目前生产上多以化学防治为主,但存在农产品安全及环境污染的风险。N-酰基乙醇胺（NAE）是植物体内天然存在的一类脂质生物活性化合物,其在哺乳动物中具有多种免疫功能,但其在植物免疫中的作用和机制尚不清楚。【目的】探讨N-酰基乙醇胺在诱导番茄对灰葡萄孢防御中的作用,为研发番茄灰霉病绿色防控技术提供依据。【方法】将灰葡萄孢分别接种在含有硬脂酰乙醇胺（NAE 18:0）、亚油酸乙醇胺（NAE 18:2）、廿二碳五烯酸乙醇胺（NAE 22:5）的培养基上,观察灰葡萄孢的生长情况。在此基础上,以番茄‘Moneymaker’植株为材料,硬脂酰乙醇胺、亚油酸乙醇胺、廿二碳五烯酸乙醇胺外源处理番茄叶片后接种灰葡萄孢,统计病情指数,测定荧光参数。采用qRT-PCR技术明确亚油酸乙酰胺处理后番茄叶片灰葡萄孢Actin的相对表达量,进一步测定番茄叶片中主要抗病基因PI I、PR-1、NPR1、Nr、ACO1、PYR1a等的相对表达量及茉莉酸（jasmonic acid,JA）、水杨酸（salicylic acid,SA）、乙烯（ethylene,ETH）、脱落酸（abscisic acid,ABA）、生长素（indoleacetic acid,IAA）含量。并以乙烯信号转导突变体植株never ripe（nr）及对照植株Pearson（PB）为材料,在外源亚油酸乙酰胺处理后接种灰葡萄孢,测定番茄叶片叶绿素荧光参数和灰葡萄孢Actin的相对表达量。【结果】体外培养试验结果表明灰葡萄孢生长并不受外源N-酰基乙醇胺的影响,外源施用N-酰基乙醇胺能显著提高番茄植株对灰霉病的抗性,缓解由灰葡萄孢侵染导致的番茄叶片光系统II实际光化学效率（Φ_PSII）的下降。3种N-酰基乙醇胺中,亚油酸乙醇胺施用后番茄叶片灰霉病病情指数下降最为明显,灰葡萄孢Actin的相对表达量下调60%,其诱导灰霉病抗性效果最佳。番茄植株接种灰葡萄孢后抗性基因PI I、PR-1、NPR1、Nr、ACO1的表达水平均有不同程度上调。外源亚油酸乙醇胺处理使得番茄响应灰葡萄孢接种后PI I、Nr、ACO1的表达进一步增强,其中乙烯合成基因ACO1的表达水平最高。番茄植株接种灰葡萄孢后叶片水杨酸、茉莉酸、生长素和乙烯含量增加,但外源亚油酸乙醇胺处理并接种灰葡萄孢后只有乙烯含量显著增加。进一步研究发现,番茄乙烯突变体nr植株中,外源亚油酸乙醇胺对灰葡萄孢的抗性诱导作用显著受到抑制。【结论】外源施用亚油酸乙醇胺能够提高番茄内源光合效率和抗病基因的表达及内源激素乙烯的含量,增强番茄植株对灰霉病的抗性,推测其诱导抗性作用可能与乙烯信号路径相关。     

高效降解秸秆的深绿木霉菌ATMT突变株的筛选

以羧甲基纤维素粉或滤纸为唯一碳源,对深绿木霉菌T23的农杆菌介导的突变株进行了生长速度、产孢率、色素形成等形态学观测,同时,测定了滤纸酶酶活及羧甲基纤维素酶酶活,从中筛选出降解纤维素能力较出发菌T23显著变化的突变株7株。其中,多拷贝T-DNA插入突变株较单拷贝的突变株生长速度快,产孢率高。并且,这些突变株的发酵液呈明显的色素差异。突变株插入的拷贝数越多,酶活越强,在降解过程中这2种酶都观察到了产物的反馈抑制现象。     

稻曲病菌T-DNA插入突变菌株B1241侧翼基因克隆

【目的】分析稻曲病菌(Ustilaginoidea virens)致病力减弱的T-DNA插入突变菌株B1241的生物学性状和致病力,并结合分子生物学手段研究其T-DNA插入位点的侧翼基因,以解析突变基因在稻曲病菌生长和致病过程中的作用,从而为阐明稻曲病菌致病机制提供理论基础。【方法】以野生菌株P1作为对照,观察并检测突变菌株B1241的菌落形态、生长速率、孢子形态、产孢量等生物学性状;采用注射接种的方法将菌丝和孢子的混合液接种于水稻穗苞中,统计每穗发病的病粒数,分析B1241的致病性变化;突变菌株B1241在不含有潮霉素的PSA平板上转接5代之后,PCR检测T-DNA插入的稳定性并通过Southern杂交分析B1241中T-DNA插入的拷贝数;利用HiTail-PCR获得T-DNA插入位点的侧翼序列,经NCBI比对得到侧翼基因;运用RACE-PCR克隆插入位点侧翼基因全长;qRT-PCR分析侧翼基因的表达情况。【结果】经生物学特性观察及田间接种发现,与野生菌株P1相比,突变菌株B1241在固体培养基MM、PSA和TB3上的菌落和孢子形态以及生长速率无显著差异,其致病力、产孢能力均呈极显著下降。B1241在不含潮霉素的PSA平板上转接5代之后,仍能扩增到GFP和HPH基因,说明T-DNA已经稳定地插入到其基因组中。Southern杂交结果显示T-DNA在该突变菌株中以单拷贝的形式插入。经扩增并比对侧翼序列,T-DNA的插入位点处少了28 bp的稻曲序列,有37 bp在T-DNA及稻曲病菌基因组中都没有比对到。NCBI比对发现,侧翼基因Uvt-1241与UV-8b菌株的UV8b-7878基因同源,开放阅读框长2 317 bp,包含81和106 bp的2个内含子,编码709个氨基酸。经RACE-PCR获得基因全长2 650 bp,5'非编码区长度为14 bp,3'非编码区长度为319 bp。T-DNA插入在基因Uvt-1241的启动子区域,位于起始密码子之前516 bp处。qRT-PCR分析结果表明,Uvt-1241在该突变体中表达量下降。该基因编码一个糖基水解酶18家族的蛋白,同时含有一个保守结构域D××D×D×E。【结论】稻曲病菌突变菌株B1241中,T-DNA插入到基因Uvt-1241的启动子区域,从而导致该启动子功能部分缺失,基因表达量下降,使得突变菌株的生长、产孢等生物学特性及致病力发生改变,由此推测该基因可能在稻曲病菌生长及致病过程中起着重要的作用。     

两种拟南芥MYB51突变体的鉴定与初步分析

拟南芥MYB51(AT1G18570)转录因子是吲哚族芥子油苷合成的正向调控因子。研究组从拟南芥生物资源中心(Arabidopsis Biological Resource Center,Ohio State University,USA)购买AT1G18570的两种T-DNA插入突变体SALK_045103和SALK_059771,分别通过基因型分析筛选得到纯合突变体。半定量RT-PCR分析结果表明,两种突变体中MYB51基因的表达量极低。高效液相色谱检测结果表明,两种突变体中吲哚族芥子油苷含量与野生型相比均显著降低。由此可知,SALK_045103和SALK_059771突变体中MYB51转录因子的功能显著降低,为进一步探讨拟南芥MYB51转录因子在环境因子调控吲哚族芥子油苷合成过程中的作用奠定了材料基础。     

膜下滴灌水氮空间调控对机采棉群体塑造及产量的影响

【目的】研究膜下滴灌水氮空间调控对机采棉群体塑造及产量的影响。【方法】以新陆中66号为供试品种,试验采用大田裂区试验设计,主区为膜内不同滴灌带条数,分别为2、3和5条（分别标记为G₂、G₃、G₅）;副区为不同施氮量,分布为0、238、317、396 kg/hm²（分别标记为N₀、N₁、N₂、N₃）,研究棉花生育期内不同水氮处理对群体指标、叶面积指数、干物质积累、产量和氮肥农学效应的影响。【结果】施氮量对机采棉群体塑造影响极显著,滴灌带布置条数对茎粗和果枝始节高度有显著影响;增加布管数量和施氮量可增加机采棉的叶面积指数,并在生育中后期达到显著影响;机采棉地上部分干物质积累量、单株铃数、单铃重、衣分和籽棉产量均随着施氮量的增加而呈单峰趋势,在N₂水平下有最大值;滴灌带条数和施氮量的交互作用对果枝始节果枝始节高度、吐絮初期干物质积累量和产量的影响显著。【结论】水氮空间调控会显著影响棉花群体塑造和产量。适合“10 cm-66 cm-10 cm-66 cm-10 cm”机采棉模式的水氮组合为G₅N₂;考虑种植成本,也可选用G₃N₂组合,但需要适当提高其灌水频率,并对应减少灌水定额。     

拟南芥不同生态型对灰葡萄孢的抗病性

为明确拟南芥不同生态型对灰葡萄孢的抗病性,并筛选具有抗性的拟南芥材料,试验通过对拟南芥11个生态型进行接种试验,研究其对21个灰葡萄孢菌株的反应,结果发现,有10个灰葡萄孢菌株对拟南芥的11个生态型表现抗/感差异。其中Col-0、Ws-0和Ler生态型接种灰葡萄孢菌株BC18后表现典型的抗病和感病反应。组织病理学试验进一步确定了Col-0、Ws-0生态型为抗病生态型,而Ler为感病生态型,试验结果为进一步的植物抗病基因的克隆和相关作物的遗传改良奠定基础。     

Screening of conidium development mutant of Botrytis cinerea and functional analysis of the related gene

A novel conidium development mutant was obtained by screening the transformants of Botrytis cinerea produced by Agrobacterium tumefaciens mediated method, which lost the ability of producing conidia. The flanking sequence of T-DNA insertion site was acquired by TAIL-PCR technology, and then, the T-DNA insertion in the second exon of BC1G_02800.1 confirmed by BLAST between the flanking sequence and the known sequence in the B. cinerea gene database. The mutant gene was identified as BC1G_02799.1 located in the upstream of BC1G_02800.1 gene by RTPCR. The DNA full-length sequence of BC1G_02799.1 was 1951 bp and contained 1848 bp coding region, which encoded a 615 amino acids putative protein similar to ABC-transporter, and the function of BC1G_02799.1 gene was unknown to date. Phenotype analysis of the mutant found that the mutant strain colony was white, grew slowly, and did not produce conidium and sclerotia on PDA medium but showed a stronger pathogenicity to tomato leaves and successfully increased the enzyme activity related to pathogenicity compared to the wild type strain. The results suggested that the BC1G_02799.1 gene was involved in the conidium development, the sclerotia formation, and pathogenicity in B. cinerea. Our research will facilitate in understanding the molecular mechanism of conidium development, sclerotia formation, and pathogenic in B. cinerea.     

8种植物提取物对番茄灰霉病菌抑菌活性的研究

采用生长速率法测定了8种植物丙酮和甲醇提取物对番茄灰霉病原真菌的生物活性。结果表明：多数提取物对番茄灰霉病原真菌有一定的活性;在50×10^-3g·mL^-1浓度下防风、落叶松和五味子的甲醇提取物的72 h抑制率分别为58.19%、80.41%、77.49%;蝙蝠葛、落叶松枝、落叶松叶、五味子丙酮提取物对病菌的72 h抑制率较高分别为82.26%、76.42%、66.60%。     

抗除草剂棉花GV-2的分子特征和遗传稳定性分析

分子特征和遗传稳定性是我国转基因植物安全评价流程所需考察的重要数据。利用基因组测序技术对抗除草剂棉花GV-2的T-DNA插入位点、拷贝数及侧翼序列进行解析,并采用实时荧光定量PCR(quantitative real time polymerase chain reaction,qRT-PCR)、Southern杂交、胶体金试纸及ELISA(enzyme linked immunosorbent assay)方法对连续3代(T₃～T₅)GV-2转化体中目的基因的表达的稳定性进行验证。结果表明,转化体GV-2中T-DNA以单拷贝形式插入到陆地棉A06染色体2 092 124～2 092 194 bp之间,造成棉花基因组中70 bp DNA的缺失。转化体特异性PCR及Sanger测序结果进一步验证了插入位点的正确性。此外,目的基因及其表达蛋白在不同世代转化体中均可稳定遗传,为转基因棉花GV-2转化体的安全评价提供了有效的支撑。     

BcDR1, a putative gene, regulates the development and pathogenicity of Botrytis cinerea

Botrytis cinerea is one of the important phytopathogenic fungi. Cloning of the genes related to their development and pathogenicity is fundamental to the pathogen control. A mutant (BCt160), which produces abnormal conidia and no sclerotia, was identified from Botrytis cinerea mutant library generated by Agrobacterium tumefaciens mediated transformation (ATMT). Southern blotting analysis showed that one T-DNA insertion occurred in the genome of the mutant. TAIL-PCR (thermal asymmetric interlaced PCR) and bioinformatic analysis indicated that the exogenous T-DNA insertion occurred in the second exon of a putative gene BC1G_12388.1, named as BcDR1 (B. cinerea development-related gene 1). The function analysis of BcDR1 gene showed that the BcDR1 was related to development, morphological differentiation, and pathogenicity of B. cinerea, suggesting that BcDR1 gene was required for the development and pathogenicity of B. cinerea.     

灰葡萄孢菌的诱变及其致病性研究

[目的]研究灰葡萄孢菌抗AbA(短梗霉素A)突变体的诱变方法与AbA对灰葡萄孢菌及其突变体细胞形态和致病力.[方法]以野生型灰葡萄孢菌为出发菌株,用不同浓度的EMS诱变和AbA筛选,获得抗AbA的突变菌株.[结果]AbA显著影响灰葡萄孢菌细胞形态,如孢子萌发延迟、芽管粗短、顶端分支增多、抑制菌丝生长,并且降低致病力.AbA对突变菌株细胞形态无影响,而对其致病力有一定的增强作用.[结论]确定了灰葡萄孢菌抗AbA突变体的诱变条件,证明了突变体能抵抗AbA对细胞形态和致病力的影响.