巨菌草一株内生固氮菌的分子鉴定及生物学特性

菌草(JUNCAO)是可作为栽培食用菌、药用菌的草本植物。内生固氮菌具有生物固氮的功能,可以促进植物生长,提高植物对病原菌的拮抗作用。采用无氮培养基、乙炔还原法等方法从巨菌草根中分离纯化到1株具有较强固氮酶活性的菌株,固氮酶活性值为270.20 nmolC2H4/(mL·h)。通过16S rDNA序列分析,进一步确定该菌株属于变栖克雷伯氏菌(Klebsiella variicola)。内生固氮菌株fjg102对稻瘟病菌Guy11和Ku70的抑菌率分别为40.25%和44.30%,具有一定的抑制病原菌的作用。菌株fjg102革兰氏染色阳性,具有溶磷作用、触酶反应为阳性、明胶液化为阳性等生理生化特性。盆栽试验结果表明,接种fjg102菌株后对大麦有明显的促生作用。其中叶长增加37.26%,根长增长9.40%,根重增加66.16%,鲜重增加96.40%,干重增加80%。可见,该内生固氮菌株具有生物固氮和促生的效果,可进一步研究开发成为微生物肥料生产菌种。     

水稻根系内生固氮菌的分离鉴定及其促生作用研究

【目的】研究不同生育期水稻根系内生固氮菌的多样性,分离鉴定内生固氮菌并筛选具有促生作用的菌株,为水稻生产中固氮菌的应用提供理论依据。【方法】采用无氮培养基培养方法,从拔节期和抽穗期佳辐占根系中分离内生固氮菌,通过扩增16S rRNA方法进行分子鉴定和系统进化分析;采用透明圈法进行溶磷解钾能力验证;采用乙炔还原法测定固氮酶活性。将分离的内生固氮菌株单独接种盆栽水稻幼苗,测定其对株高、根长、鲜质量的影响;将内生固氮菌混合菌液接种水稻品种佳辐占和台粳8号,于齐穂期测定倒1、倒2和倒3叶片的叶绿素含量（SPAD值）。【结果】从拔节期和抽穗期水稻根系中分别分离出10和20株内生固氮菌,且两个时期水稻根系内生固氮菌群多样性存在差异,拔节期以克雷伯氏菌属为主,而抽穗期以假单胞菌属为主。筛选出7株具有溶解无机磷能力的菌株,分别是J3、J10、J23、H27、H30、H33和H37。乙炔还原法测定结果表明,分离的内生固氮菌均具有弱固氮活性,其中 H33和H40-2菌株固氮能力相对较强。将固氮菌回接水稻幼苗,H40-2和J3菌株对水稻株高、地上鲜质量、根长均有显著影响,可促进水稻生长。将固氮菌混合回接水稻根系,发现佳辐占叶片叶绿素含量与对照差异不显著,而台粳8号显著提高。【结论】分离的内生固氮菌株H40 2和J3在水稻苗期具有明显促生作用,可作为功能性内生固氮菌开发利用。     

兼溶多种难溶磷的溶磷菌筛选及其对玉米幼苗生长的影响

采用固体平板和液体摇瓶实验,以自玉米根际分离获得的10株优良溶磷菌为材料,进一步筛选出4株兼具 较好利用Ga3(PO4)2,AlPO4,FePO4 和卵磷脂的溶磷菌株(P1,P17,P35,P21).4株溶磷菌对不同难溶磷的溶解能 力从大到小依次为Ga3(PO4)2、混合难溶磷>AlPO4、FePO4>卵磷脂.其中,菌株P21对混合难溶磷、AlPO4、 FePO4 以及卵磷脂的溶磷量(全磷、有效磷)均为最大,该菌株在上述各难溶磷培养液中的全磷分别为128.84, 30.23,27.20和6.79μg/mL,有效磷分别为90.27,25.03,21.47和6.53μg/mL,对Ca3(PO4)2 也能较好地溶解 (全磷85.07μg/mL、有效磷56.68μg/mL),表明在室内培养条件下,菌株P21对多种难溶磷的兼溶能力更为突 出.盆栽实验表明,与CK相比,4株溶磷菌均能显著提高玉米幼苗干物质量、可溶性糖和可溶性蛋白质量分数及 根系活力;可能受多种环境因素影响,菌株P21对幼苗的促生效应不及P17,P35菌株突出,表现出溶磷菌实际应 用的复杂性.     

一种新型生物肥料——解磷固氮菌肥

解磷固氮菌肥,是一种无污染,无公害乳黄色液体的生物肥料。它是利用固氮菌和解磷菌在土壤和作物根系中,分离出具有固氮、解磷能力的固氮菌株和速效溶磷菌株,经过深层发酵制备而成。施于土壤后,对改善土壤结构,提高土壤肥力具有良好的作用。1992年黑龙江省江滨农场小麦全部使用解磷固氮菌肥,每公顷增产小麦250公斤;全场增收小麦1816吨,增加收入119.86万元。投入产出比为1:12。用解磷固氮菌肥拌种、喷施均可,也可和其他综合农艺措施一起进     

小麦、水稻、玉米、白菜、芹菜内生固氮菌及其系统发育

【目的】了解小麦、水稻、玉米、白菜、芹菜内生固氮菌的主要类群,确定内生固氮菌的系统发育地位。【方法】样品表面灭菌后采用无氮培养基分离、培养内生固氮菌,乙炔还原法测定菌株固氮酶活性;PCR扩增得到菌株16S rDNA,通过序列测定和相似性分析研究菌株的系统发育。【结果】从大田小麦体内分离到内生固氮菌34株,固氮酶活性在0.30-30.24 nmol C2H4/h•mg蛋白,基于16S rDNA序列最大相似性,这些菌株分属于假单胞菌（Pseudomonas）、根瘤菌（Rhizobium）、芽孢杆菌（Bacillus）、黄杆菌（Flavobacterium）等13属21种,种群分布较为广泛;从大田水稻体内分离到内生固氮菌25株,固氮酶活性在3.12-254.12 nmol C2H4/h•mg蛋白,属于芽孢杆菌、伯克霍尔德氏菌（Burkholderia）、肠杆菌（Enterobacter）、克雷伯氏菌（Klebsiella）等9属16种,伯克霍尔德氏菌、肠杆菌和克雷伯氏菌是水稻内生固氮菌特有种群;从大田玉米体内分离到内生固氮菌9株,固氮酶活性在7.27-59.58 nmol C2H4/h•mg蛋白,属于根瘤菌、鞘氨醇单胞菌（Sphingomonas）等5属6种;从盆栽试验小白菜体内分离到内生固氮菌14株,固氮酶活性在2.33-205.21 nmol C2H4/h•mg蛋白,属于根瘤菌、节杆菌（Arthrobacter）等6属8种;从市售芹菜体内分离到内生固氮菌10株,固氮酶活性在1.23-46.70 nmol C2H4/h•mg蛋白,属于鞘氨醇单胞菌、假单胞菌等5属8种。【结论】在生长期小麦、水稻、玉米和部分蔬菜体内普遍存在内生固氮菌,菌株固氮酶活性差异较大,在0.30-254.12 nmol C2H4/h•mg蛋白,系统发育地位分属于假单胞菌、根瘤菌、芽孢杆菌等25个属的56个种,这些内生固氮菌对于农业生产有巨大潜能。     

一株溶磷促生菌的分离、鉴定及其对玉米幼苗生长的影响

【目的】分离能高效溶磷的促生菌菌株,研究不同溶磷菌胁迫对玉米幼苗生长的影响。【方法】采用改良SRSM培养基及改良Belimov方法从平凉市化肥施用冬小麦土壤中筛选溶磷菌株,利用形态特征和16S rDNA序列对筛选菌进行鉴定、分析其促生特性,盆栽试验分析不同溶磷胁迫下玉米幼苗抗逆性等。【结果】在初步分离得到8株溶磷菌株中,筛选出1株ZX-2020菌株,通过生理生化及16S rRNA 鉴定ZX-2020为Pseudomonas sp,GenBank登录号为MT084758。玉米幼苗生长试验表明,接种ZX-2020菌株的玉米与不同溶磷菌处理相比,其幼苗根、茎长度和叶面积均有显著提高,分别增加54.49%、26.96%和36.06%,产IAA量为6.71 mg/L,溶磷量为198.26 μg/mL。【结论】Pseudomonas sp.ZX-2020在施用化肥土壤中能更好地定殖,保证促植物生长能力的发挥,并为化肥污染土壤的植物-微生物联合原位修复提供优良菌株资源。     

菌株混合培养的溶磷解钾效果及条件优化

将溶磷菌、固氮菌和解钾菌按功能不同两两组合培养后筛选出互相不拮抗的菌株组合,进行三菌混合培养,测试得到的5组混合菌株的溶磷、解钾能力。结果表明,混合培养菌的溶磷、解钾能力均比各菌单独培养时要高,其中,组合1、2和5混合培养时具有1+1+13的溶磷效果,组合3和5混合培养时具有1+1+13的解钾效果。探索组合5的最佳培养条件,发现当培养基C/N比为25,p H 9,温度为30℃时菌株生长总量最好。     

1株六堡茶根际溶磷菌的鉴定、培养优化及促生与磷活化能力分析

自六堡茶根际分离得到1株高效溶磷菌菌株Lb-1,通过菌落形态及16S rRNA基因系统发育分析菌株的分类地位,并对其溶磷培养条件进行优化,利用盆栽试验研究其在土壤中的溶磷效果及对茶树的促生能力,以期为提高茶园土壤磷利用及开发微生物菌肥提供依据。结果表明,菌株Lb-1为贝莱斯芽孢杆菌(Bacillus velezensis),该菌株溶磷最佳碳源为葡萄糖,最佳氮源为胰蛋白胨,最佳初始pH值为6.0,最佳接种量为1%,最佳微量元素为Fe,最佳发酵温度为30℃,优化培养条件下溶磷量可达857.91 mg/L,且可显著提高菌株的柠檬酸、琥珀酸、丙二酸分泌量。盆栽试验表明,接菌处理下六堡茶鲜重、干重、株高、根系总长度、根系表面积、根系体积及磷含量分别显著提高59.09%、69.77%、38.75%、37.94%、44.82%、52.94%及108.35%,铝结合磷、闭蓄态磷含量显著降低,有效磷含量显著提高。综上,溶磷菌株Bacillus velezensis Lb-1可有效活化根际难溶磷、提高六堡茶树对磷的吸收及促进植株生长发育,或可作为开发磷高效菌肥的潜在资源。     

不同氮水平下三种固氮菌剂对油菜及土壤中氮素的影响

通过在油菜盆栽试验中施加不同浓度的尿素和三种不同的固氮菌剂,比较分析了油菜和土壤中氮素的变化,结果表明:在施加尿素为2g/kg的范围内,土壤和植物中的氮素会随着尿素施入量的增多而增多;并且从马铃薯增产菌剂中分离出来的固氮菌比从生根旺菌肥和玉米复合微生物菌剂中分离出来的菌肥在施氮量适中的情况下固氮能力比较强。可为固氮菌肥的合理有效施用与氮肥的优化配比及探求作物高产优质的生物调控提供理论依据。     

施氏假单胞菌在玉米根际的固氮效率和促生效果研究

非豆科植物根际联合固氮作用广泛存在于水稻、玉米等根际,在农作物节肥增产方面具有巨大的应用潜力。施氏假单胞菌A1501是一株分离自水稻根际的模式联合固氮菌,接种该菌对水稻和玉米均具有良好的促生效果。为了进一步研究根际固氮与促生效果的关系,利用突变型泌铵固氮菌株（1568/pVA3）和转基因氮高效利用玉米品系共同构建高效固氮体系,并在温室条件下进行促生及生物固氮量评价。播种60 d后对玉米生长量和微生物固氮量进行分析,结果表明：固氮施氏假单胞菌接种后氮高效利用和对照玉米品系的地上和地下部生物量都显著高于不接种对照,但是固氮菌接种对氮高效利用玉米和对照玉米的总生物量没有显著影响。氮高效利用玉米接种1568/pVA3菌株后,植株生物量较施肥处理提高25.5%,全氮含量较不接种对照增加39%,15N同位素稀释法测定生物固氮量为0.8 g·株^-1;接种野生型后植株生物量较施肥处理提高24.8%,生物固氮量为0.64 g·株^-1。研究结果表明,通过将固氮菌尤其是泌铵工程菌与氮高效利用玉米建立联合固氮体系可以显著提高根际固氮量和植株生物量,据估算每公顷可节省化肥约23%,而对照体系为7.5%。     

PGPR复合菌系对花生生长及根际土壤微生物的影响

【目的】为4株植物根际促生菌(PGPR)的复合菌肥制备提供指导,促进植物根际促生菌在农业生产上的应用。【方法】将4株植物根际促生菌根据固氮、解磷及解钾的功能互补配制成4种复合菌系(P_9+GD_3、P_9+GD_(12)、P_(10)+GD_3和P_(10)+GD_(12)),对盆栽花生幼苗进行灌根试验,30 d后测定花生幼苗的生长指标、土壤理化性质、根际土壤功能菌群数及酶活性。【结果】4种复合菌系的灌根处理均显著增加花生的株高和鲜重,有效提高土壤的氮磷钾含量,增加根际土壤氮循环功能菌群、溶磷菌及解钾菌的数量,显著提高土壤脲酶、过氧化氢酶和中性磷酸酶活性,尤以P_(10)+GD_(12)菌株组合最显著,其对照(未进行PGPR复合菌系处理)的花生株高和鲜重分别高37.60%和63.90%,土壤碱解氮和速效钾分别高64.36%和1.38倍,根际土壤的氨化细菌、自生固氮菌及解钾菌分别增加36.98、8.25和13.23倍,根际土壤脲酶增加2.48倍。【结论】利用根际促生菌的功能构建多功能复合菌系可有效促进花生幼苗生长,提高土壤养分含量,改善根际土壤环境,为下一步复合菌剂的应用奠定理论基础。     

不同自生固氮菌对大豆促生作用的研究

[目的]为研究接种不同自生固氮菌对大豆生长的影响。[方法]以大豆田土壤为培养基质,将9株自生固氮菌混菌接种到大豆盆栽土壤中,通过对干湿质量、叶片大小、株高、根长、须根数等指标的测定与分析,获得各菌株对大豆苗期生长的促生作用。[结果]9株菌均能促使大豆苗生长。不同菌株促生效果差异较大。其中,固氮菌2121、2212、2222和2312对大豆幼苗促生影响最为显著,菌株2122、10321、10322对大豆生长的促进效果则较差。     

玉米联合固氮菌的固氮活性及联合固氮效果

盆栽实验表明,分属于固氮菌属(Azotobacter)、固氮螺菌属(Azospirillum)、克雷伯氏属(Klebsiella)、阴沟肠杆菌(Enterobacter cloacae)的9株玉米联合固氮菌均能在玉米苗根际繁殖并有固氮作用,且能提高植株的含氮量和干重。但不同菌株的固氮活性和玉米的联合固氮效果不同。     

巨菌草根内生固氮菌Klebsiella variicola的分离、鉴定及培养条件的优化

采用Ashby和Nfb无氮培养基从巨菌草成熟期根部分离得到1株具有高效固氮性能的内生固氮菌GN02,其在分离的菌落中所占比例最高,且酶活性较高.经16S rDNA序列鉴定,该菌株与克雷伯氏菌属各菌株同源性关系可达99%,结合其形态、生理生化特征,初步鉴定为变栖克雷伯氏菌(Klebsiella variicola).在含氮源的KP培养基中菌株GN02的生长情况明显优于无氮源的Ashby培养基.菌株GN02在KP培养基中的最优培养条件为:温度37.1℃,pH 5.6,蔗糖25.6 g·L~(-1),在此条件下其D_(600 nm)能达到1.48,比优化前提高了22.31%.响应面优化所得到的培养条件重复性好,准确、可靠.     

白三叶根际解无机磷菌株筛选、鉴定及促生效果研究(英文)

[目的]对白三叶根际解无机磷菌株进行筛选、鉴定及促生效果研究,以期为收集优良溶磷菌菌种资源奠定基础。[方法]对贵州省种植的白三叶根际溶磷菌进行分离筛选,并测定其溶磷、分泌IAA能力及促生效果。[结果]白三叶根际存在数量多且溶磷能力各异的溶磷菌株,其中菌株RW2、RW6和RW18对磷酸钙中磷的溶解能力较强,溶磷量分别为337.39、447.45与462.03μg/ml;菌株溶磷量与分泌有机酸量之间无显著线性关系;分泌IAA量最高的是菌株RW2,为12.69μg/ml,其次为菌株RW18,为12.34μg/ml;16SrDNA序列分析将RW2、RW6和RW18菌株初步鉴定为勒克氏菌属(Leclerciasp.),菌株RW18对白三叶幼苗促生效果最好,与对照相比,其株高、根长、根重及地上生物量分别提高110.98%、89.17%、346.17%和242.22%,具有作为促生菌利用开发的潜力。[结论]该研究结果为研发溶磷菌和复合接种剂提供了菌种和科学依据,同时也为缓解贵州地区贫瘠土地磷素供给、节约磷矿等资源、降低环境污染、保护生态环境以及保障农牧业可持续发展开辟了新途径。     

一株桑树根际促生菌的筛选鉴定及促生性能研究

从桑树根际土壤中筛选分离出一株具有促生能力的细菌G2,经过形态学特征观察、生理生化特性以及16S rDNA测序比对,鉴定为施氏假单胞菌(Pseudomonas stutzeri),并研究了不同pH、培养时间等对G2菌株的促生能力的影响。结果表明,在pH为7时,培养48 h G2菌溶磷能力达到最高,为17.96 mg/L;而IAA的分泌速度在48 h之前较快。盆栽试验表明,接种稀释100倍的G2菌液后,桑树苗的株高、鲜重、地上部干重及根系干重分别较对照提高31.8%、38.5%、34.6及31.2%。综合分析表明,G2菌株具有较强的促生能力,为桑树微生物菌肥的开发提供了理论支撑。     

甘蔗内生固氮菌Klebsiella variicola DX120E nifH基因的克隆与序列分析

【目的】了解甘蔗内生固氮菌变栖克雷伯氏菌（Klebsiella variicola）DX120E nif H基因的生物信息学,为揭示甘蔗内生固氮菌DX120E的固氮分子机理提供理论依据。【方法】根据NCBI上其他固氮菌株的nif H序列设计引物,对内生固氮菌Klebsiella variicola DX120E菌进行PCR扩增;运用生物信息学方法对其核苷酸序列、编码的氨基酸序列进行分析,并对其蛋白结构进行预测。【结果】甘蔗内生固氮菌Klebsiella variicola DX120E nif H基因的ORF为882bp,Gen Bank登录号为KF732646.1,与Klebsiella pneumoniae 342、Klebsiella variicola At-22等6种固氮菌的nif H基因氨基酸序列同源性高达95.0%-99.0%。DX120E nifH蛋白与Klebsiella pneumoniae 342的亲缘关系最近,与非克雷伯氏菌固氮菌的亲缘关系较远。生物信息学分析显示,菌株DX120E的nif H基因编码293个氨基酸,起特别重要的氨基酸残基非常保守。该基因在N端有11个氨基酸残基即酪氨酸—甘氨酸—赖氨酸—甘氨酸—甘氨酸—异亮氨酸—甘氨酸—赖氨酸—丝氨酸—苏氨酸—苏氨酸,其属于典型结合ATP的基序结构。nif H蛋白分子量为32.07k D,pI为4.92,为酸性蛋白;其具有2个ASN糖基化位点,1个CAMP磷酸化位点,6个CK2磷酸化位点,6个PKC磷酸化位点。疏水性预测显示该蛋白为亲水性蛋白,无信号肽。【结论】变栖克雷伯氏菌（Klebsiella variicola）DX120E nif H基因的推导氨基酸序列与克雷伯氏菌固氮菌属具有较高的同源性,该基因在甘蔗生物固氮过程中可能起重要作用。     

解磷解钾根际促生菌的分离鉴定和筛选应用

为了获得具有高效解磷解钾能力、适宜作为菌肥生产菌的根际促生菌,采用选择性培养基,以稀释培养法针对性地筛选具有解无机磷、解钾能力的根际促生菌,通过生理生化实验结合16S rDNA序列分析对分离菌株进行鉴定,并比较其解磷解钾效果,筛选出无拮抗的菌株并发酵菌液作为菌肥应用。结果表明:多个细菌菌株中,b6巨大芽孢杆菌(Bacillus megaterium)解无机磷活性较强,b7胶质芽孢杆菌(Bacillus mucitaginosus)解钾活性较强。复合菌肥在实验室盆栽条件下对山毛豆(Tephrosia candida)促生效果显著,但其肥效与化肥仍有差距,可搭配减量化肥施用,提高化肥利用率。     

巨柏根际多功能溶磷菌W13对植物生长的促生效果研究

从巨柏根际土壤中分离多功能溶磷促生菌株,为高原环境下多功能溶磷菌的收集和研究提供研究基础。本研究从西藏自治区林芝市朗县采集巨柏根际土壤样本,采用梯度稀释法筛选溶磷菌,并结合溶磷圈法和钼锑抗比色法测定溶磷能力,选出溶磷能力较好的菌株,并对IAA、固氮、解钾等多种促生特性进行测定,最终筛得具有多功能的溶磷菌,通过盆栽实验对溶磷菌的促生效果进行验证,并结合形态特征、革兰氏染色和16S rDNA基因序列对菌株进行鉴定。W13具有产IAA、铁载体、固氮、解钾等多种促生特性,为非脫羧勒克菌（Leclercia adecarboxylata）。经盆栽促生试验结果表明,W13对油菜和青稞具有不同程度的促生作用,与对照组相比W13有效提高了油菜植株的根长、株高、鲜重和干重,并分别增长了119%、55.30%、157%和50%。青稞株高效果显著增长了44.80%。多功能溶磷细菌W13对油菜和青稞都具有一定的促生作用,因此该菌具有作为生物肥料的潜力,用于植物生产。     

高效溶磷菌的筛选及其促生效应研究

[目的]从大田玉米根际土壤初筛溶磷能力较强的菌株,通过盆栽和大田试验复筛出具最优溶磷能力的玉米根际促生菌。[方法]利用改良的PVK培养基定性筛选溶磷菌株,通过NBRIP液体摇瓶试验定量研究其溶磷能力,再通过盆栽和大田试验来确定溶磷菌的促生和增产效果。[结果]从玉米大田根际土壤中筛选出8株具有解无机磷能力的细菌,其中菌株NJAU-B8在PVK培养基上溶磷圈直径与菌体直径的比值较高,在NBRIP液体培养基中有效磷含量最高达到487.67mg·L-1。2季玉米盆栽试验结果表明,菌株NJAU-B8对苗期玉米生长促进作用优于其他菌株,其中第1季株高、茎粗、SPAD值、地上部鲜质量和地上部干质量较不接菌处理(CK)分别增加40.37%、18.74%、1.32%、46.67%和4.08%,而第2季则分别增加22.18%、2.02%、1.20%、16.26%和35.53%。另外除菌株B1,其他接菌处理株高均优于CK。大田试验结果表明:第1季玉米产量复合微生物肥料(BIO)与有机-无机复混肥(AOF)处理差异不显著,但BIO处理依然高于AOF和化肥(CF)处理;第2季白菜产量达到显著性差异;第3季BIO处理土豆产量分别比AOF和CF处理增产11.29%和26.41%。结合形态、生理生化特征和16S rDNA基因序列分析,将菌株NJAU-B8归类于伯克霍尔德属(Burkholderia sp.)。[结论]分离获得高效溶磷菌株NJAU-B8,其菌剂能够有效促进苗期玉米生长和增加玉米产量。