烟草orf25基因植物表达载体的构建及遗传转化

为更好地研究烟草雄性不育的机理,构建orf25基因的植物表达载体。orf25基因是ATP合成酶F(0)部分的4个亚基因之一。以雄性不育烟草MS革新3号为受体材料,利用组成型启动子Ca MV35S构建orf25基因植物表达载体,将表达载体p BI121-orf25导入根癌农杆菌LBA4404。采用根癌农杆菌介导orf25基因遗传转化MS革新3号,结果证明载体上的目的基因orf25已整合到烟草基因组中,并获得了52株转p BI121-Ca MV35Sorf25基因烟草植株,经PCR鉴定,转基因阳性植株有14株,转化率为26.9%。为下一步研究该基因的功能及其与烟草雄性不育性的关系提供依据。     

一个耐硒基因过表达载体的构建及转基因植株的筛选鉴定

[目的]进一步验证WRKY47基因在调控硒胁迫应答中的功能,构建WRKY47过表达载体,获得相应的转基因株系。[方法]以野生型拟南芥的c DNA为模板,利用PCR扩增WRKY47基因全长,将该基因连接到p BI121载体上。将获得的重组载体转化至农杆菌菌株GV3101,通过浸化转化法将WRKY47重组质粒转化到拟南芥野生型植株中,利用转基因筛选与遗传鉴定获得WRKY47转基因阳性植株。[结果]扩增获得WRKY47基因,CDS全长1 470 bp,连接转化并获得测序正确的重组载体p BI121-WRKY47。通过抗性筛选和分子鉴定获得阳性转基因植株。[结论]成功构建过表达载体并获得相应的转基因株系,为进一步研究该基因的分子机制奠定基础。     

转海藻糖合酶基因玉米株系的获得及其抗旱性研究

采用农杆菌介导玉米萌发种子转化方法,将海藻糖合酶基因(TPS)导入玉米自交系昌7-2中。PCR和Southern blot检测结果表明,目的基因已导入转化植株并整合到受体基因组上。田间抗旱性鉴定和生理生化指标结果显示,转基因植株(株系)的抗旱性明显高于对照。说明海藻糖合酶基因具有抗旱功能,利用植物基因工程技术对其进行玉米抗旱育种是切实可行的。     

柑橘衰退病毒基因p23 RNAi载体的构建及转化

【目的】构建柑橘衰退病毒(Citrus tristeza virus,CTV)含p23的RNAi载体,以获得具有抗性的柑橘转基因植株。【方法】基于转化病毒基因介导抗性,根据NCBI公布的CTV基因组序列,查找p23保守序列,设计并克隆两条不同长度的片段。对两条片段和植物表达载体p BI 121进行双酶切和连接来构建RNAi载体。初步预测所构建的载体发生RNAi抗病毒的可行性。利用农杆菌介导的瞬时表达技术将含RNAi载体的农杆菌注射入CTV指示植物墨西哥莱蒙的叶片,利用GUS组织化学染色法观察叶片中载体发生瞬时表达的情况。发生瞬时表达的叶片接种CTV T36基因型,利用酶联免疫反应(ELISA)检测病毒含量。同时,提取叶片的RNA并反转录为c DNA,利用实时荧光定量PCR(q-PCR)检测CTV p20,通过该基因的表达量反映叶片中的病毒含量。通过农杆菌介导的遗传转化将RNAi载体转入大红甜橙实生苗上胚轴节间茎段,抗生素筛选得到的芽嫁接至枳橙实生试管苗。提取大红甜橙叶片的DNA,通过PCR扩增确定其是否为转基因阳性;目的基因检测为阳性的植株二次嫁接至温室保存的酸橙实生苗;根据插入的p23基因序列设计q-PCR引物,检测转基因植株中p23的表达情况。取CTV T36基因型寄主的带皮芽,用腹接法接种大红甜橙转基因植株。取接种后新萌发枝梢上的叶片,用检测瞬时表达叶片同样的方法分析植株的抗病性。对于第1次接种后未检测出病毒感染的植株,进行第2次接种并检测分析。【结果】克隆得到CTV p23 513 bp的长片段和291 bp的短片段,与载体p BI121连接后成功构建含发夹结构的来自病原且能靶向目的基因的RNAi载体,命名为p23-RNAi。注射p23-RNAi的墨西哥莱蒙叶片经GUS染色后能够产生蓝色斑点,表明农杆菌p23-RNAi可以在叶片中发生瞬时表达;接种CTV后第15和30天,瞬时表达p23-RNAi的墨西哥莱蒙叶片ELISA检测结果均为阴性,同时q-PCR检测结果显示其CTV p20的积累水平和增加速度明显低于对照植株,表明瞬时表达的p23-RNAi在一定时间内可以对CTV的侵染产生抑制。p23-RNAi经农杆菌介导遗传转化大红甜橙获得抗性芽,通过普通PCR的扩增结果证明得到7个转基因植株;q-PCR检测结果进一步表明7个转基因植株间p23的含量呈现一定差异,植株E的含量最高,其次是C、F、H、A、B和G。接种CTV后,p20的表达量在7个转基因植株间也表现出一定差异,表达量最高的是植株A,其次是G、F、E、B、H、C,且与对照植株相比,呈现不同程度的抗病性。转基因植株对病毒的抗性与外源基因的表达水平没有相关性,外源基因表达水平最高的植株E并没有表现强的CTV抗性。经过两次病毒接种,转基因植株C在接种后具有完全抗性。【结论】p23-RNAi载体能引起植物抗柑橘衰退病毒;瞬时表达技术可快速鉴定RNAi载体的抗病性,有利于筛选高效率的RNAi载体。     

甜菜幼苗叶片渗透调节系统及部分激素对干旱胁迫的响应

以抗旱性不同的甜菜品种HI0466、KWS9454为供试材料,在不同水分处理条件下研究甜菜渗透调节系统相关生理指标及部分激素对苗期不同程度水分亏缺的响应机制及其与甜菜抗旱性的关系。结果表明,持续水分胁迫下甜菜幼苗叶片可溶性蛋白含量呈现先升高后下降的趋势,吲哚-3-乙酸(简称IAA)含量、水势持续降低,而可溶性糖、游离脯氨酸、甜菜碱等渗透调节物质及脱落酸(简称ABA)含量则逐步升高,且抗旱品种升高幅度较大。因此可知,在胁迫加重时抗旱品种甜菜叶片可维持较高的可溶性糖、游离脯氨酸、甜菜碱及ABA含量,且品种间差异显著,使得叶片水势维持在相对较低的水平,增强了其保水能力,提高了其抗旱性。主成分分析评价结果表明,胁迫条件下游离脯氨酸含量、甜菜碱含量、细胞水势、ABA含量均可作为甜菜品种苗期抗旱性鉴定的有效生理指标。     

大豆热激蛋白基因HSP17.4的耐热功能鉴定

为研究小热激蛋白基因HSP17.4在大豆热生物胁迫耐受过程中的作用,本试验把植物过表达载体p CPB-HSP17.4和RNA干扰表达载体p CPB-HSP17.4-RNAi利用农杆菌介导法将其导入受体大豆JN18中。经PCR检测,获得T0代阳性植株13株;T1代阳性植株26株;T2代阳性植株39株。T1、T2代转基因植株Southern blotting结果显示,目标基因以单拷贝形式整合到基因组中。荧光定量PCR结果显示,HSP17.4基因在转化植株的叶、茎中均有表达。在42℃高温胁迫下,与未转化植株相比,T1、T2转过表达植株叶片中相对表达量分别为未转化植株的813%和793%,转RNAi表达植株叶片中相对表达量分别为未转化植株的49.77%和52.81%。耐高温鉴定结果表明,转过表达HSP17.4基因提高了植株的耐高温能力。     

用花粉管通道法将抗旱耐盐基因导入玉米自交系的研究

采用改进的花粉管通道法,将海藻糖合酶基因(TPS)导入玉米自交系郑58中。3～5叶期时喷雾Basta(0.7%)溶液筛选,进行PCR检测,结果表明,目的基因已导入转化植株并整合到植株染色体上。田间初步抗旱性检测显示,转化植株(株系)的抗旱性高于对照植株。应用改进的花粉管通道法导入抗旱目的基因,可以得到玉米抗旱新资源,是一种切实有效的抗旱育种新方法。     

大豆热激蛋白基因HSP17.4的耐热功能鉴定

为研究小热激蛋白基因HSP17. 4在大豆热生物胁迫耐受过程中的作用,利用农杆菌介导法,将植物过表达载体p CPB-HSP17. 4和RNA干扰表达载体p CPB-HSP17. 4-RNAi导入受体大豆JN18中。经PCR检测,获得T0代阳性植株13株,T1代阳性植株26株,T2代阳性植株39株。T1、T2代转基因植株Southern blotting结果显示,目标基因以单拷贝形式整合到基因组中。荧光定量PCR结果显示,HSP17. 4基因在转化植株的叶、茎中均有表达。在42℃高温胁迫下,与未转化植株相比,T1、T2转过表达植株叶片中相对表达量分别为未转化植株的813%和793%,转RNAi表达植株叶片中相对表达量分别为未转化植株的49. 77%和52. 81%。耐高温鉴定结果表明,转过表达HSP17. 4基因提高了植株的耐高温能力。     

转紫色酸性磷酸酶基因GmPAP14大豆研究

为获得磷高效利用转基因大豆新材料,构建紫色酸性磷酸酶基因GmPAP14超表达载体pBI121-GmPAP14与pCAMBIA3301-GmPAP14,通过农杆菌介导子叶节转化技术将2个载体分别转入高产优质大豆品种,并分析了GmPAP14在转基因植株内的表达情况。结果显示,利用PCR和DNA测序分析可检测到转化植株中的目的条带,其中,转入p BI121-GmPAP14载体的保豆3号阳性植株有6株;转入pCAMBIA3301-GmPAP14载体的中豆32有9株,冀豆12有11株,农大豆2号20株。进一步将上述T0植株自交,目前已获得T_1转基因后代;经实时定量PCR检测,部分株系的GmPAP14表达量显著高于野生型对照,说明GmPAP14已整合到大豆基因组,并能够在转录水平正常表达。     

禽呼肠孤病毒σ3基因在烟草中的表达与鉴定

【目的】研究禽呼肠孤病毒S1基因编码的σ3基因在烟草中的表达及其表达产物的反应原性。【方法】根据Gen Bank中公布的禽呼肠孤毒株S1133的基因序列,设计特异引物扩增σ3基因,构建重组植物表达载体p BI121-σ3,热激法转化农杆菌EHA105感受态细胞,筛选含有重组质粒的p BI121-σ3的阳性工程菌株EHA105。采用农杆菌介导的叶盘法转化野生型烟草,卡那霉素筛选获得抗性植株。随后通过σ3基因的特异引物,PCR方法初步筛选获得转σ3基因的烟草植株。进一步对阳性植株通过实时荧光定量PCR方法检测σ3基因在转基因烟草中的拷贝数,以烟草自身单拷贝的内源基因核糖核酸还原酶-RNR2作为内参基因,通过梯度稀释分别构建RNR2及σ3基因的起始模板量和对应CT值的标准曲线,通过检测样品中σ3基因和RNR2基因模板量对数值的比值估算出σ3基因在转基因烟草中的拷贝数。并通过Western-blotting方法对转基因烟草中表达的σ3融合蛋白的反应原性进行分析。【结果】1通过双酶切和测序验证表明σ3基因插入位置、大小和读码框均正确,表明σ3基因已经成功的构建于植物表达载体p BI121的花椰菜花叶病毒(Ca MV)35S启动子的下游,以NOS为终止子,含有卡那霉素抗性标记(NPT II)。其表达的蛋白与下游的绿色荧光蛋白形成融合蛋白,其大小约为61.6 ku;2在转化筛选抗性植株的过程中采用350 mg·L-1的头孢霉素可以很好地抑制农杆菌的污染,100 mg·L-1的硫酸卡那霉素筛选压力能够很好地抑制非转化细胞的生长;3随机选取10株转化烟草进行PCR检测发现8株转化烟草可以扩增到清晰的目的条带约994 bp;4内参基因RNR2的标准曲线为y=-3.5352x+15.143,σ3基因的标准曲线为y=-3.5366x+1.8265,两个标准曲线的相关系数均接近于1。在检测的5株转化烟草中σ3基因的拷贝数均为4,阴性对照没有扩增。5Western-blotting显示σ3融合蛋白在转化烟草中可以正确表达,目的条带大小约为61.6 k D,与预计大小一致;σ3融合蛋白能够与禽呼肠孤病毒的阳性血清发生特异反应,表明该融合蛋白具有良好的反应原性。【结论】成功地构建了植物表达载体p BI121-σ3,筛选获得低拷贝的转σ3基因的烟草,σ3融合蛋白能够在烟草中表达且具有相应的反应原性,为进一步研究σ3基因的功能和利用植物作为生物反应器生产σ3蛋白口服疫苗的研发奠定了基础。     

农杆菌介导烟草抗真菌β-1,3-葡聚糖酶基因转化洋桔梗

为获得洋桔梗抗真菌病害新品种,本研究将烟草抗真菌β-1,3-葡聚糖酶基因(Glu)与质粒p BI121重组,构建了植物表达载体p BI121-Glu,利用农杆菌介导法转化洋桔梗品种Double Mariachi Pink叶块,共获得21个卡那霉素抗性株系。对抗性株系进行PCR扩增,获得10个阳性株系。选取其中生长良好的5个株系进行RT-PCR检测,鉴定出3个株系(EG6、EG11和EG17)为转基因正常转录株系。EG6、EG11和EG17株系及非转基因对照株系的β-1,3-葡聚糖酶的平均活力分别为0.301 U、0.243 U、0.401 U及0.236 U,其中EG6和EG17株系的平均活力显著高于非转基因对照株系。洋桔梗离体叶片的抗灰霉病鉴定显示,EG17病斑面积(0.432 cm2)显著小于非转基因对照株系(2.156 cm2)。此外,EG17对灰霉病的抗性还表现为发病延迟、病斑面积扩大速度减慢等。     

RNA干扰技术抑制洋桔梗ACC合酶基因的表达

为了延长洋桔梗的花期,本研究通过农杆菌介导法,以ACC合酶(ACS)基因干扰表达载体,对Double Mariachi Pink洋桔梗(Eustoma grandiflorum)的叶片外植体进行了转化。经过再生芽的筛选增殖培养,在含有卡那霉素Km(15 mg/L)再生根筛选培养基中得到了46株抗性苗,其中11株经GFP基因PCR鉴定为阳性。经进一步的GFP基因RT-PCR鉴定,3株表达为阳性,并且其中2株经GFP荧光检测呈阳性。提取荧光阳性植株RNA,逆转录后,进行了ACS荧光定量PCR。结果表明,与未转基因对照植株相比,转基因植株ACS的相对表达量平均下降了63.17%。花期统计结果表明,ACS干扰表达载体转化的洋桔梗植株花期比未转基因植株对照延长了17 d。     

苹果砧木富平楸子嫁接高度对抗旱性的影响

以常规低位嫁接为对照,研究富平楸子高位嫁接对植株抗旱性的影响,为生产中该砧木资源的应用提供参考。以一年生富平楸子组培盆栽苗为砧木,分别在距地面10cm和60cm处嫁接‘秦脆’,采用土壤含水量75%～80%为对照,土壤含水量45%～55%为处理,进行为期60 d的中度干旱胁迫处理,测定相关指标,比较两种嫁接高度下植株的抗旱性强弱。结果表明：长期干旱胁迫后,与对照相比,2种类型苗木的各指标均显著降低,其中高位嫁接植株的生物量、根系指标、叶片相对含水量(RWC)、净光合速率(Pn)、蒸腾速率(Tr)、瞬时水分利用效率(WUEi)及总叶绿素含量的降幅均小于低位嫁接植株,且差异显著;叶片内游离脯氨酸含量与抗氧化酶(SOD、POD)活性的增幅大于低位嫁接植株,其中游离脯氨酸含量增幅差异显著;叶片相对电导率与MDA含量的增幅小于低位嫁接植株,差异显著。利用以上指标进行隶属函数计算,结果显示高位嫁接植株抗旱性更强,且差异显著。富平楸子采用高位嫁接可显著提高植株抗旱性,因此实际生产中以高位嫁接的利用形式对旱地苹果产区是可行的。     

马铃薯卷叶病毒外壳蛋白基因克隆转化及其转基因后代的表达

根据GenBank中的马铃薯卷叶病外壳蛋白基因(PLRV-CP)全序列,设计一对特异性引物,以马铃薯卷叶病毒RNA为模板,克隆了马铃薯卷叶病外壳蛋白基因,在pBI121的基础上构建了植物表达载体。利用PLO(Poly-L-Ornithine)将PLRV-CP基因导入到马铃薯加工型品种大西洋的原生质体中,获得了转基因后代。在5株转化后代中扩增出长度为610bp的目标DNA片断,说明导入的外源PLRV-CP基因已经整合到马铃薯基因组中。Southern blot分析结果进一步证明了PCR结果的正确性。RT-PCR结果表明,在3株转化后代叶片中具有阳性表达。马铃薯卷叶病毒接种实验结果表明,转基因植株比对照有明显的马铃薯卷叶病抗性。     

生物源脱落酸(ABA)提高茄苗抗旱能力的效果及机理

以茄子苏琦1号为材料,探讨了生物源脱落酸(ABA)提高茄苗抗旱性的作用。结果表明:ABA能有效减缓干旱胁迫条件下茄苗叶片相对含水量的下降,提高茄苗的抗旱性;在干旱胁迫过程中,经ABA处理的茄苗叶片中超氧物歧化酶(SOD)活性的降低幅度和丙二醛(MDA)的积累明显低于对照,脯氨酸、抗坏血酸(AsA)、还原型谷胱甘肽(GSH)和可溶性糖含量都明显高于对照。     

轮状病毒外壳抗原蛋白VP4基因转化苎麻的研究

利用套叠PCR技术对轮状病毒外壳抗原蛋白VP4基因进行了定点突变,将改造后的基因插入pBI121构建植物表达载体。在设计PCR引物时,引入植物表达载体pBI121具有的克隆位点BamH I和Sac I,利用BamH I和Sac I切除pBI121上的GUS基因并使载体质粒线性化,用同样的2种酶消化pTVP4克隆载体获得VP4基因片段,使之形成与线性化pBI121质粒相同的粘性末端。在T4DNA连接酶的作用下,将线性化pBI121质粒和酶切后的VP4基因片段连接成新的重组质粒pBI121/VP4,通过直接转化法转化到根癌农杆菌(Agrobacteriumefaciens)EHA105菌株中,获得农杆菌工程菌株。采用叶盘转化法转化苎麻(Boehmeria.nivea L.Guad)栽培品种圆叶青,以卡那霉素抗性作为转化植株的筛选标记获得抗性植株。经PCR、PCR Southernblot分析表明,初步获得了轮状病毒外壳蛋白VP4的转基因苎麻植株。     

转群体感应淬灭基因attM烟草抗青枯病的研究

自根癌农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)克隆获得attM基因。采用叶盘转化法,农杆菌介导转化烟草,经过卡那霉素抗性筛选获得抗性愈伤组织,对其分化产生的植物株系进行PCR、PCR-Southern和荧光定量PCR及GUS染色检测分析。结果表明:attM基因被成功插入烟草基因组DNA中。在转基因株系中均能够表达,相对表达量最大可达125.8,最小为31.0。以野生型烟草和转pBI121空载体的烟草为对照,分别进行了离体及活体检测试验,结果表明:转attM基因烟草植株对茄科雷尔氏菌引起的青枯病抗性显著。1×107～1×108CFU.mL-1的青枯菌接种离体叶片,野生型烟草和转pBI121空载体的烟草的中毒面积与接种面积比值为15～25,转基因植株的比值低于3;青枯菌3×106CFU.mL-1伤根接种盆栽烟草植株14d,野生株和转空载体烟草均青枯死亡,病情指数为100,转基因植株病情指数为31.25。     

84K杨树耐盐基因转化研究

在已建立了84K杨叶片外植体再生系统的基础上,利用叶盘法首次开展了84K杨双价耐盐基因mtlD/gutD的转化研究,经诱导不定芽及诱导生根阶段卡那霉素(选择性抗生素)连续筛选,获得了16株卡那霉素抗性转化植株.抗性植株经PCR检测,有4株呈阳性.耐盐实验表明,3株阳性植株抗NaCl能力比对照有不同程度提高.PCR及耐盐实验初步证明双价耐盐基因转化获得成功.     

转BADH基因花生幼苗抗盐性研究

[目的]为提高花生幼苗的抗盐性和BADH基因在花生耐盐基因工程中的应用提供试验依据。[方法]以根癌农杆菌LBA4404为转化受体菌,pCGⅡ（Km^1）为表达载体,将BADH cDNA导入花生,并通过测定盐胁迫下花生幼苗的根冠鲜重、细胞膜相对电导率和叶绿素含量研究转化植株的耐盐性。[结果]PCR检测结果表明转化植株有1301 bp目的带,阴性对照植株无目的带。对阳性植株进行Noiahem杂交,结果表明BADH基因已整合到转化植株的基因组中,并可以正常表达。盐胁迫下,检测组植株的根冠鲜重比对照组植株显著增加;检测组植株的相对电导率与对照组植株差异显著,转基因植株的相对电导率均低于对照植株;对照组植株的叶绿素含量比检测组植株低且差异显著。[结论]转BADH基因花生比对照植株表现出更强的耐盐性。     

杨树二氢黄酮醇-4-还原酶基因(DFR)的克隆及反义表达对儿茶素合成的影响

为了验证二氢黄酮醇-4-还原酶基因(DFR)在杨树上的功能,明确DFR对抗病物质儿茶素合成的影响,利用抗病基因防治树木溃疡病提供候选基因。以接种欧美杨细菌性溃疡病菌后6 d的一年生中林46杨树苗干的树皮为材料,利用RT-PCR技术克隆DFR基因的ORF序列,并构建DFR的反义表达载体anti-p BI121-DFR。采用农杆菌介导叶盘法转化84K杨,获得了转反义DFR基因的84K杨4株。用高效液相色谱法检测转基因植株叶片中的儿茶素质量分数,结果显示,4株转反义DFR株其内源儿茶素质量分数分别为0.97、2.4、1.6和0.87 ng/g,与84K野生型植株中儿茶素质量分数(8.9 ng/g)相比显著降低。上述结果表明DFR基因参与了杨树类黄酮生物合成途径,该基因与儿茶素的合成有关。