RNA干扰水牛MTPN基因对颗粒细胞增殖、凋亡及激素分泌的影响

本研究旨在探讨敲低MTPN基因对体外培养水牛颗粒细胞增殖、凋亡及雌激素、孕酮分泌的影响。应用RNAi技术敲低颗粒细胞中MTPN基因的表达水平,通过实时荧光定量PCR方法检测体外培养水牛颗粒细胞中MTPN基因及增殖和周期相关基因的表达情况,CCK-8法检测细胞增殖,借助流式细胞仪检测细胞周期的分布,采用ELISA试剂盒检测细胞培养液中雌激素与孕酮含量。结果显示,经siRNA(si-MTPN)转染颗粒细胞后,MTPN基因相对表达量下降60%(P0.01);细胞增殖受到显著抑制(P0.05),G1期细胞数量下降,S期细胞数量上升,G2期细胞数量极显著上升(P0.01),细胞被阻滞在G2期;增殖与周期相关基因Cyclin D2、Cytochrom C表达量显著上升(P0.05),Caspase9、Fas基因表达量极显著上升(P0.01);ELISA检测雌激素和孕酮分泌水平均显著下降(P0.05)。综上表明,敲低MTPN基因能通过调控相关基因的表达抑制体外培养水牛颗粒细胞的增殖及雌激素、孕酮的分泌水平,为阐明MTPN基因参与家畜卵泡发生的分子机制提供参考。     

siRNA干扰牦牛Bmal1基因对颗粒细胞激素分泌的影响

本研究旨在探讨敲低Bmal1基因对体外培养牦牛颗粒细胞雌二醇(E2)和孕酮(P4)分泌的影响。应用siRNA技术下调颗粒细胞中Bmal1基因的表达,利用ELISA试剂盒检测细胞培养液中E2与P4含量,再通过实时荧光定量PCR(qRT-PCR)和蛋白印迹(Western Blot)检测细胞激素分泌相关基因的表达情况。结果显示:经si-Bmal1转染颗粒细胞后,E2分泌量显著下降,P4分泌量极显著下降;在mRNA检测水平上,激素合成相关基因Cyp19a1、Star的表达量下降;在蛋白检测水平上,Cyp19a1、Star的结果与mRNA表达基本一致。综上表明,敲低Bmal1基因能通过调控相关基因的表达抑制体外培养牦牛颗粒细胞E2和P4的分泌水平,Bmal1基因参与牦牛颗粒细胞激素分泌的调控。     

敲低SQLE基因对奶牛乳腺上皮细胞增殖及凋亡的影响

为了探讨角鲨烯环氧酶(squalene epoxidase,SQLE)基因对体外培养奶牛乳腺细胞凋亡及增殖的影响,本研究用RNAi技术敲低奶牛乳腺上皮细胞中SQLE基因;用实时荧光定量PCR方法检测奶牛乳腺上皮细胞中SQLE基因及凋亡和周期相关基因的表达;用CCK-8法检测其对细胞增殖的影响;用周期和凋亡检测试剂盒筛选细胞,用流式细胞术准确计数处于不同周期的细胞数和凋亡细胞数。结果显示,奶牛乳腺上皮细胞转染siRNA后,SQLE基因相对表达量显著下降(P0.05),细胞增殖受到极显著抑制(P0.01);G1期细胞数量显著下降(P0.05),G2期细胞数量没有显著性改变,S期细胞数量显著上升(P0.05);肿瘤坏死因子超家族成员6(又称Fas或CD5)的相对表达量显著上升(P0.05),细胞周期蛋白依赖性激酶抑制剂1B(cyclin dependent kinase inhibitor 1B,P27)相对表达量显著上升(P0.05),而细胞周期素D1(Cyclin D1)、B淋巴细胞瘤因子2(B-cell lymphoma-2,Bcl-2)、细胞周期蛋白依赖性激酶抑制剂1A(cyclin dependent kinase inhibitor 1A,P21)、Bcl-2相关X蛋白(Bcl-2 associated X,apoptosis regulator,Bax)显著下降(P0.05)。综上所述,敲低SQLE基因通过调节相关基因的表达抑制乳腺上皮细胞的增殖。     

水牛BMP1基因对颗粒细胞增殖与凋亡的功能研究

本研究旨在探讨BMP1基因对体外培养水牛颗粒细胞增殖与凋亡的影响,采用qRT-PCR检测体外培养0、24、48、72和96h水牛颗粒细胞中BMP1基因的表达规律,通过在水牛颗粒细胞培养液中添加BMP1基因重组蛋白和抗BMP1抗体,观察其对体外培养水牛颗粒细胞增殖变化的影响,并应用qRT-PCR和Western blotting方法检测与细胞增殖和细胞凋亡相关因子表达的变化规律。结果显示,随着颗粒细胞体外培养时间的延长,BMP1基因的相对表达量显著上调(P0.05),96h培养组BMP1表达最高。添加BMP1重组蛋白可显著促进水牛颗粒细胞的体外增殖(P0.05),并能够显著上调细胞周期关键蛋白Cyclin D1、Cyclin D2和PCNA mRNA表达水平(P0.05),同时显著抑制了细胞凋亡信号通路中促凋亡相关因子(Fas、FasL、TNFR1、TNF-α、Cytochrome C、Apaf1、Chop、Caspase-3、Caspase-8和Caspase-9)mRNA表达(P0.05)。Western blotting检测结果表明,BMP1重组蛋白能够抑制Fas、Bax和Caspase-9蛋白表达,蛋白与mRNA表达一致。而添加抗BMP1抗体的试验则得出相反的结果。综上表明,BMP1基因能通过调控相关基因的表达促进体外培养水牛颗粒细胞的增殖并抑制其凋亡,在水牛卵泡发生过程中具有重要的调控功能,为阐明BMP1基因参与家畜卵泡发生的分子机制奠定基础。     

敲低SQLE基因对奶牛乳腺上皮细胞增殖及凋亡的影响

为了探讨角鲨烯环氧酶（squalene epoxidase,SQLE）基因对体外培养奶牛乳腺细胞凋亡及增殖的影响,本研究用RNAi技术敲低奶牛乳腺上皮细胞中SQLE基因;用实时荧光定量PCR方法检测奶牛乳腺上皮细胞中SQLE基因及凋亡和周期相关基因的表达;用CCK-8法检测其对细胞增殖的影响;用周期和凋亡检测试剂盒筛选细胞,用流式细胞术准确计数处于不同周期的细胞数和凋亡细胞数。结果显示,奶牛乳腺上皮细胞转染siRNA后,SQLE基因相对表达量显著下降（P<0.05）,细胞增殖受到极显著抑制（P<0.01）;G1期细胞数量显著下降（P<0.05）,G2期细胞数量没有显著性改变,S期细胞数量显著上升（P<0.05）;肿瘤坏死因子超家族成员6（又称Fas或CD5）的相对表达量显著上升（P<0.05）,细胞周期蛋白依赖性激酶抑制剂1B（cyclin dependent kinase inhibitor 1B,P27）相对表达量显著上升（P<0.05）,而细胞周期素D1（Cyclin D1）、B淋巴细胞瘤因子2（B-cell lymphoma-2,Bcl-2）、细胞周期蛋白依赖性激酶抑制剂1A（cyclin dependent kinase inhibitor 1A,P21）、Bcl-2相关X蛋白（Bcl-2 associated X,apoptosis regulator,Bax）显著下降（P<0.05）。综上所述,敲低SQLE基因通过调节相关基因的表达抑制乳腺上皮细胞的增殖。     

姜黄素对水牛卵巢颗粒细胞体外培养的影响

本试验研究了添加姜黄素对水牛卵巢颗粒细胞体外培养过程中增殖、凋亡自噬及间隙连接等生物学过程的影响。设置不同浓度(1,5,10,25,50,100μg/m L)的姜黄素,对颗粒细胞的凋亡、增殖、自噬和间隙连接等基因与蛋白的表达进行定性与定量检测,发现高浓度姜黄素会导致细胞凋亡标记Caspase-3及自噬基因Beclin-1的基因表达量上升,间隙连接蛋白Cx43基因表达量下降,细胞增殖标记PCNA表达量无显著变化。研究结果为姜黄素在调节卵巢颗粒细胞功能提供了一定的理论依据。     

Notch2在牛黄体化颗粒细胞中的调控作用

试验旨在探究Notch2在牛黄体化颗粒细胞中的调控机制。将免疫荧光鉴定采集到的原代颗粒细胞,通过慢病毒过表达技术感染牛黄体化颗粒细胞,最后应用qRT-PCR技术检测周期基因、抗氧化基因和孕酮合成相关基因的表达。结果显示:牛黄体化颗粒细胞过表达Notch2胞内功能片段NICD2后,周期基因CyclinD1、CyclinD2、CDK4和PCNA的mRNA表达量上升(P<0.05),而CDK1基因的mRNA表达无显著差异;抗氧化基因SOD和CAT的mRNA表达量上升(P<0.05);孕酮合成相关基因CYP11A1、STAR和3β-HSD的mRNA表达量上升(P<0.05)。综上所述,推测Notch2在牛卵泡颗粒细胞黄体化过程中促进细胞增殖、抗氧化水平和孕酮的合成。     

BMP15对藏鸡等级卵泡颗粒细胞孕酮分泌的影响

为探究骨形态发生蛋白15(Bone Morphogenic Protein 15,BMP15)对体外培养的藏鸡等级卵泡颗粒细胞孕酮分泌的影响，研究体外分离、培养并鉴定藏鸡等级卵泡F1颗粒细胞后，用0、25、50、100 ng/mL四种不同浓度的BMP15蛋白单独处理或者联合25 ng/mL促卵泡素（FSH）处理细胞，72 h后采用ELISA法检测不同处理组细胞培养液中的孕酮含量。同时，采用实时荧光定量PCR(RT-qPCR)法检测不同处理组细胞中孕酮合成关键基因StAR、CYP11A1和HSD3B1 mRNA相对表达量。结果显示：免疫组化法鉴定体外分离培养的藏鸡F1卵泡颗粒细胞卵泡刺激素受体（FSHR）抗体阳性率95%以上；BMP15单独处理细胞后，随着BMP15浓度的升高，孕酮分泌量呈下降的趋势，且100 ng/mL处理组的孕酮分泌量极显著低于其他组（P<0.01）;BMP15联合FSH处理细胞后，随着BMP15浓度的升高，孕酮分泌量呈现上升的趋势，其中100 ng/mL处理组的孕酮分泌量极显著高于其他组（P<0.01）；不同处理组细胞中孕酮合成关键基因StAR、CYP1...     

不同浓度GnIH对鸭颗粒细胞周期和增殖的影响

为了研究不同浓度GnIH对鸭颗粒细胞周期、增殖及相关基因表达的影响。本研究分别用不同浓度GnIH(0、0.1、1、10和100 ng·mL~(-1))处理体外培养的鸭颗粒细胞24 h(n=3),观察细胞的生长状态,通过流式细胞术和EdU方法检测细胞周期和细胞增殖,并用qRT-PCR方法检测增殖相关基因CDK6、CyclinD1、IGF-2、IGFBP-2、p27~(kip1)的表达。结果显示,各浓度GnIH处理组的细胞生长状态良好,形态正常,细胞轮廓清晰,组间死亡细胞数差异不显著(P0.05);在0.1和1 ng·mL~(-1) GnIH处理组,细胞周期阻滞在G2期的比例显著上升(P0.05);随着GnIH处理浓度的增加,EdU阳性细胞数所占的百分比降低;在0.1和1 ng·mL~(-1) GnIH处理组,颗粒细胞中CDK6、CyclinD1、IGF-2、IGFBP-2、p27~(kip1)基因的相对表达量均下降,在10和100 ng·mL~(-1) GnIH处理组中这些基因的相对表达量则有所上升。研究表明,在体外培养的鸭颗粒细胞中,GnIH能使细胞周期阻滞在G2期,并降低EdU阳性细胞所占百分比和下调增殖相关基因的表达水平,从而抑制颗粒细胞增殖来影响动物繁殖性能。     

抑制BMP/Smad信号通路对水牛卵巢颗粒细胞生长和类固醇激素合成的影响

【目的】探究BMP/Smad信号通路对水牛卵巢颗粒细胞生长和类固醇激素合成的影响。【方法】利用脂质体转染的方法将合成的Smad4基因的3对siRNAs(Smad4-siRNA1、Smad4-siRNA2和Smad4-siRNA3)和NC-siRNA(对照组)分别转染水牛颗粒细胞,通过实时荧光定量PCR检测Smad4基因的表达水平,比较不同siRNA的干扰效率。然后利用筛选的干扰效率最高的siRNA,转染水牛卵巢颗粒细胞,通过CCK-8法检测对照组和干扰组细胞的增殖情况,实时荧光定量PCR检测上述两组细胞凋亡相关基因Bax和Bcl2,细胞周期相关调控基因CyclinD2和CDK4,以及类固醇激素合成相关基因Cyp19A1和Cyp11A1的表达水平,并通过ELISA检测雌二醇(E₂)和孕酮(P₄)的含量。【结果】基因干扰试验结果表明,3对siRNAs对Smad4基因的表达均具有极显著的干扰作用(P<0.01),其中Smad4-siRNA1的干扰效率最高,达到了64%。CCK-8检测结果显示,与对照组相比,干扰组细胞的增殖效率显著降低(P&l...     

miR-495-3p对山羊卵巢颗粒细胞功能的影响

旨在探究miR-495-3p对山羊卵巢颗粒细胞功能的影响及作用机制.本研究选取健康的3～4月龄大足黑山羊母羊,收集卵巢颗粒细胞,利用miR-495-3p模拟物(mimics)和抑制物(inhibitor)构建过表达和抑制模型,通过流式细胞术检测细胞凋亡和周期,ELISA分析颗粒细胞的雌二醇(E2)和孕酮(P4)分泌,采...     

CTSD对黔北麻羊卵泡颗粒细胞的调控机制及功能分析

旨在分析组织蛋白酶D（cathepsin D, CTSD）对黔北麻羊卵泡颗粒细胞的调控机制并初步探究其对产羔性状的影响机理。本研究以36周龄、健康、多胎黔北麻羊母羊（n=5）为研究对象,屠宰后采集卵巢组织分离培养卵泡颗粒细胞,构建真核表达载体pEGFP-N3-CTSD,将其导入细胞后在转录与翻译水平验证真核表达效率;通过CCK-8法检测在不同时间段内重组质粒对颗粒细胞增殖的影响;通过流式细胞仪检测重组质粒对颗粒细胞凋亡及周期的影响;随后使用RT-qPCR法在细胞水平检测重组质粒对细胞凋亡相关基因Bcl-2、Bax、Caspase-3,细胞周期相关因子Cyclin A1、Cyclin D2、Cyclin E mRNA表达水平的影响,最后,以多胎性状候选基因BMPR-IB、FSHR、INHA为功能基因,在转录与翻译水平上验证重组质粒对其mRNA与蛋白表达的影响。双酶切及测序结果证实,黔北麻羊CTSD基因真核表达载体pEGFP-N3-CTSD构建成功,且在转录与翻译水平极显著上调CTSD在颗粒细胞中的表达（P<0.01）;细胞增殖检测结果表明,颗粒细胞中上调CTSD后能够抑制细胞的增殖,其中在12、24、48、72 h对细胞增殖的抑制效率达到极显著（P<0.01）;细胞凋亡检测结果表明,CTSD的过表达能够极显著促进颗粒细胞的凋亡（P<0.01）,且能够显著下调细胞抗凋亡基因Bcl-2的表达（P<0.05）,极显著上调细胞促凋亡相关基因Bax、Caspase-3的表达（P<0.01）;此外,细胞周期检测发现,pEGFP-N3-CTSD在转染后能够极显著上调G0/G1期与G2/M期的细胞数量（P<0.01）,极显著下调S期细胞数量（P<0.01）,同时能够极显著提高细胞周期相关因子Cyclin A1的表达（P<0.01）,极显著降低Cyclin D2的表达（P<0.01）。RT-qPCR及Western blot检测结果表明,在颗粒细胞中上调CTSD后,能够极显著的下调多胎性状候选基因与蛋白BMPR-IB、FSHR、INHA在转录和翻译水平中的表达（P<0.01）。本研究发现,CTSD的高表达能抑制细胞的增殖,促进细胞凋亡,改变颗粒细胞的周期进程;还能改变细胞凋亡相关因子Bcl-2、Bax、Caspase-3与细胞周期相关因子Cyclin A1、Cyclin D2、Cyclin E的表达;同时也能够极显著降低颗粒细胞中多胎性状候选基因与蛋白BMPR-IB、FSHR、INHA的表达量（P<0.01）。这提示,CTSD可能通过改变细胞水平相关因子的表达量来调控颗粒细胞的生物学行为以及影响山羊多胎性状候选基因的表达进而间接的成为影响山羊产羔性状的重要因子,本研究为进一步探明CTSD对山羊产羔性状调控机理及对颗粒细胞的影响机制奠定基础。     

SMAD7对山羊卵泡颗粒细胞增殖、凋亡的影响

旨在探究SMAD7对山羊卵泡颗粒细胞增殖和凋亡的影响。本试验收集3~4月龄大足黑山羊母羊的卵泡颗粒细胞,通过过表达或siRNA干扰、ELISA、qRT-PCR、Western blot及流式细胞术等技术与方法探究SMAD7对颗粒细胞增殖、凋亡及类固醇激素分泌的影响。结果发现,SMAD7过表达显著下调颗粒细胞增殖活力并促进细胞凋亡,抑制PCNA表达（P<0.05）,下调BCL2/BAX的比值（P<0.01）;同时,SMAD7干扰显著上调颗粒细胞增殖活力,显著上调PCNA表达（P<0.05）与BCL2/BAX表达量比值（P<0.05）。SMAD7过表达极显著上调颗粒细胞的孕酮分泌,下调雌二醇表达水平（P<0.01）;同时SMAD7干扰极显著下调孕酮分泌,上调雌二醇分泌（P<0.01）。进一步研究发现,SMAD7过表达显著抑制SMAD2、SMAD3的mRNA和蛋白表达（P<0.05）;SMAD7干扰则显著促进SMAD2、SMAD3的mRNA和蛋白表达（P<0.05）。结果表明,SMAD7抑制山羊卵泡颗粒细胞的增殖和雌二醇分泌,促进凋亡和孕酮的合成,并且抑制SMAD2、SMAD3的表达,进而调节卵泡的发育与闭锁。     

OPN5对鸭颗粒细胞凋亡、增殖及类固醇激素生成的影响

旨在研究视神经蛋白（neuropsin,OPN5）对鸭颗粒细胞凋亡、增殖及类固醇激素生成的影响。本研究分别对鸭颗粒细胞进行OPN5过表达质粒和OPN5 siRNA处理72 h （n=6）,应用EdU细胞增殖检测技术、流式细胞技术、Annexin V-FITC、RT-PCR、Western blot及ELISA技术系统地检测颗粒细胞的增殖、凋亡情况及生殖相关基因的mRNA、蛋白水平及激素水平的变化规律。结果显示,OPN5过表达能促进鸭卵泡颗粒细胞增殖,抑制鸭卵泡颗粒细胞凋亡;能极显著地促进GnRHR、FSHR、LHR的表达 ,并抑制GnIH、GnIHR的表达（P<0.01）;能显著或极显著上调StAR、CYP11A1、3β-HSD、CYP17A1、CYP19A1的mRNA水平（P<0.05或P<0.01）;显著升高OPN5、3β-HSD及CYP19A1的蛋白表达水平（P<0.05）和极显著升高E2、P4分泌水平（P<0.01）,并极显著降低INHβ的水平（P<0.01）。OPN5 siRNA能够显著降低OPN5的表达水平（P<0.01）,抑制卵泡颗粒细胞增殖并促进凋亡,极显著下调GnRH、GnRHR、FSHR、LHR（P<0.01）,促进GnIH、GnIHR的表达（P<0.01）;并极显著抑制StAR、CYP11A1、CYP17A1的表达（P<0.01）;显著降低OPN5、3β-HSD及CYP19A1蛋白表达水平（P<0.05）及极显著降低E2、P4的分泌水平（P<0.01）,并能极显著升高INHβ的水平（P<0.01）。研究表明,OPN5能促进鸭卵泡颗粒细胞的增殖,抑制其凋亡,促进颗粒细胞中类固醇激素的生成和分泌。     

白藜芦醇对体外培养的水牛卵丘细胞增殖活力及其相关基因mRNA表达的影响

[目的] 研究白藜芦醇（resveratrol,RES）对水牛卵丘细胞体外培养过程中细胞增殖活力、激素分泌、卵丘扩展及抗凋亡和抗氧化能力的影响。[方法] 用不同浓度（0（对照组）、1、10、20、30、40、50和60 μmol/L）RES培养卵丘细胞,用CCK-8试剂盒测定细胞增殖活力,筛选最佳RES处理浓度及时间用于后续试验。用ELISA法测定培养液中卵丘细胞分泌的雌二醇（estradiol,E₂）和孕酮（progesterone,P₄）的含量,实时荧光定量PCR法测定卵丘细胞扩展、凋亡和抗氧化相关基因的相对表达量。[结果] 与对照组相比,在体外培养24~36 h内,1、10和20 μmol/L RES组水牛卵丘细胞的增殖活力均有升高趋势,10 μmol/L RES处理36 h细胞活力最强,因此用于后续试验中细胞的处理。体外培养36 h时,10 μmol/L RES组细胞增殖能力和E₂、P₄的分泌显著增加（P<0.05）;10 μmol/L RES组卵丘细胞扩展相关基因穿透素3（PTX3）、前列腺素内过氧化物合酶2（PTGS2）、抗凋亡基因B淋巴细胞瘤-2（Bcl-2）和超氧化物歧化酶1（SOD1）基因mRNA相对表达量显著或极显著增加（P<0.05;P<0.01）,而促凋亡基因Bcl-2相关蛋白（Bax）、半胱氨酸蛋白酶-3（Caspase-3）和p21的表达量显著或极显著降低（P<0.05;P<0.01）,透明质酸合酶2（HAS2）和过氧化氢酶（CAT）的表达量无显著差异（P>0.05）。[结论] 培养液中添加10 μmol/L RES能够提高水牛卵丘细胞体外培养的增殖活力,促进卵丘细胞激素分泌和卵丘细胞扩展,并增强卵丘细胞抗氧化能力并减少细胞凋亡。     

DDR1对奶牛乳腺上皮细胞增殖与凋亡的调控作用

旨在通过干扰或过表达盘状蛋白结构域受体1（DDR1）基因,探讨其对奶牛乳腺上皮细胞增殖、凋亡及周期的影响。本研究将DDR1基因小干扰RNA片段和过表达载体pcDNA3.1-DDR1转染奶牛乳腺上皮细胞,采用qRT-PCR和Western blot检测细胞中DDR1的干扰和过表达效果;利用CCK-8法检测细胞增殖能力;流式细胞术检测细胞周期和细胞凋亡（早凋、晚凋）的变化;利用qRT-PCR检测增殖与凋亡相关基因的表达情况。结果,在奶牛乳腺上皮细胞中干扰DDR1基因后,其mRNA和蛋白表达分别下调94%和30%,而过表达DDR1基因后,其mRNA和蛋白表达分别上调68.24和1.38倍;干扰DDR1极显著抑制细胞的增殖（P<0.01）,细胞早凋与晚凋比例极显著上升（P<0.01）;干扰组G1期细胞比例极显著上升（P<0.01）,S期细胞比例极显著下降（P<0.01）,G2期细胞比例显著下降（P<0.05）,提示细胞阻滞在G0/G1期。相反,过表达DDR1能显著促进细胞增殖（P<0.05）,显著抑制细胞晚期凋亡（P<0.05）,G1期细胞比例极显著下降（P<0.01）,S期细胞比例极显著上升（P<0.01）,促进细胞由G1期向S期的转换。qRT-PCR检测结果显示,干扰DDR1后显著上调BAX、Caspase9基因的表达（P<0.05）,极显著上调P53、FAS基因的表达（P<0.01）,且显著下调PCNA、CyclinB1基因的表达（P<0.05）;过表达DDR1后,分别显著和极显著下调Cytc与BAX基因的表达（P<0.05,P<0.01）,并极显著上调CyclinB1基因的表达（P<0.01）。综上可见,DDR1能够调控奶牛乳腺上皮细胞的增殖、凋亡和周期,可为阐明DDR1参与奶牛乳腺上皮细胞生长发育的分子机制提供参考。     

Effects of Interference and Overexpression of DDR1 on Proliferation and Apoptosis of Mammary Epithelial Cells in Dairy Cows

The aim of this study was to investigate the effect of discoidin domain receptor 1 (DDR1) gene on the proliferation, apoptosis and cell cycle of dairy cow mammary epithelial cells through interfering and overexpressing DDR1. The small RNA interference fragment of DDR1 gene and overexpression vector pcDNA3.1-DDR1 were transfected into dairy cow mammary epithelial cells, qRT-PCR and Western blot were used to detect the interference and overexpression efficiency of DDR1; CCK-8 was employed to detect cell proliferation; Flow cytometry was performed to detect the changes of cell cycle and apoptosis (early apoptosis and late apoptosis). qRT-PCR was used to detect the expression of genes related to proliferation and apoptosis. After interfering DDR1 gene in dairy cow mammary epithelial cells, mRNA and protein expression levels of DDR1 were down-regulated by 94% and 30%, respectively; While after overexpressing DDR1 gene, its mRNA and protein expression were up-regulated 68.24 and 1.38 times, respectively. Interfering DDR1 extremely significantly inhibited the proliferation of cells (P<0.01), the ratio of early and late apoptotic cells was extremely significantly increased (P<0.01); the ratio of G1 phase cells in the interference group was extremely significantly increased (P<0.01), and the proportions of S and G2 phase cells were significantly decreased (P<0.01 and P<0.05), which suggested that the cells were blocked in G0/G1 phase. Conversely, overexpression of DDR1 could significantly promote cell proliferation (P<0.05), significantly inhibit the late apoptosis of cells (P<0.05), the proportion of G1 phase cells was extremely significantly decreased (P<0.01), and the proportion of S phase cells was extremely significantly increased (P<0.01), suggesting the enhancement of transition from G1 to S phase. The results of qRT-PCR detection showed that after interfering DDR1, the expressions of BAX and Caspase9 genes were significantly up-regulated (P<0.05), and the expressions of P53 and FAS genes were extremely significantly up-regulated (P<0.01), while the expressions of PCNA and CyclinB1 genes were significantly down-regulated (P<0.05). After overexpression of DDR1, the expressions of Cytc and BAX genes were significantly (P<0.05) and extremely significantly down-regulated(P<0.01), respectively, and the expression of CyclinB1 gene was extremely significantly up-regulated (P<0.01). In summary, DDR1 can regulate the proliferation, apoptosis and cycle of dairy cow mammary epithelial cells, this result will provide a reference for elucidating the molecular mechanism of DDR1 involved in the growth and development of dairy cow mammary epithelial cells.     

干扰和过表达BAMBI基因对猪卵泡颗粒细胞表型和功能的影响

为研究转化生长因子-β（TGF-β）信号通路中的骨形态发生蛋白和激活素膜结合抑制剂（bone morphogenetic protein and activin membrane-bound inhibitor,BAMBI）基因对猪卵泡颗粒细胞的调控作用,本研究设计构建BAMBI干扰和过表达载体,并将构建好的干扰（pSIREN-BAMBI-sh1、pSIREN-BAMBI-sh2、pSIREN-BAMBI-sh3）和过表达（pcDNA3.1-BAMBI）重组质粒转染猪卵泡颗粒细胞,通过实时荧光定量PCR技术进行有效片段的筛选,并对TGF-β信号通路下游基因（TGF-βRⅠ、TGF-βRⅡ、SMAD1、SMAD2、SMAD3、SMAD4、SMAD5）和细胞凋亡基因（Bax、Bcl-2）mRNA的表达水平进行检测。最后,用MTT法和流式细胞术检测BAMBI干扰和过表达对卵泡颗粒细胞增殖及凋亡的影响。结果表明,BAMBI干扰和过表达载体成功构建,pSIREN-BAMBI-sh2抑制BAMBI表达的效果最好,干扰效率最高。干扰BAMBI时,TGF-βRⅡ表达量显著上升（P<0.05）,使得SMAD2、SMAD3的表达量显著上升（P<0.05）;过表达BAMBI时,TGF-βRⅡ表达显著下降（P<0.05）,使得SMAD2、SMAD3的表达量显著下降（P<0.05）;上调BAMBI可显著抑制猪卵泡颗粒细胞增殖,极显著促进猪卵泡颗粒细胞凋亡（P<0.01）。研究结果表明,BAMBI基因显著影响猪卵泡颗粒细胞的生长发育,可能通过调节TGF-β信号通路间接影响猪的繁殖性能。