银杏GbERF1转录因子基因的克隆及亚细胞定位分析

ERF是植物中一类重要的转录因子,广泛参与植物对生物和非生物胁迫的响应。以3年生银杏苗为试材,采用RT-PCR与RACE-PCR方法,研究了银杏ERF基因序列,以期深入了解银杏药用成分合成代谢的分子机理。结果表明:GbERF1含有长度为1 314bp的完整开放阅读框,编码437个氨基酸。蛋白序列分析显示,GbERF1蛋白含有2段ERF家族的特殊位点。GbERF1蛋白序列与北美云杉(ADE75663.1)序列的相似性为97%。系统进化树分析,GbERF1与北美云杉、狭叶羽扇豆的序列可划归为同一分支。实时荧光定量PCR结果显示,GbERF1主要在银杏根和叶中表达,逆境胁迫处理后显示,该基因在乙烯、紫外诱导处理下,表达量大幅度提升,随后下降,但仍高于对照组,干旱诱导处理下表达量先升高后降低,矮壮素(CCC)诱导下表达量变化不太明显。烟草叶片下表皮细胞亚细胞定位结果表明GbERF1定位于细胞核。     

蝴蝶兰AP2/ERF家族基因的克隆及在低温下表达特性分析

用RT-PCR方法从‘大辣椒’蝴蝶兰叶片中克隆得到4个AP2/ERF家族基因，命名为PhAP2/ERF1 ~ PhAP2/ERF4。蛋白结构域和序列比对发现PhAP2/ERF1 ~ PhAP2/ERF4均含有1个AP2结构域， PhAP2/ERF2还含有1个B3结构域。进化树分析表明4个蛋白与兰科AP2/ERF家族成员亲缘关系最近，PhAP2/ERF1属于AP2/ERF家族DREB亚家族中的A1类，PhAP2/ERF2属于RAV亚家族，PhAP2/ERF3属于ERF亚家族的B4类，PhAP2/ERF4属于DREB亚家族中的A2类。用实时荧光定量PCR方法检测低温驯化和低温胁迫条件下PhAP2/ERF1 ~ PhAP2/ERF4在‘大辣椒’和‘富乐夕阳’蝴蝶兰叶片中的表达特性，结果表明：4个基因在‘大辣椒’叶片中的表达趋势一致，表达量在低温胁迫早期达到最高，在胁迫中晚期有所下降；而4个基因在‘富乐夕阳’叶片中的表达趋势有较大差异，PhAP2/ERF1和PhAP2/ERF2的表达在低温处理整个过程中没有被诱导或仅有较小幅度增加，PhAP2/ERF3对低温的响应时间显著晚于‘大辣椒’，PhAP2/ERF4的表达趋势与‘大辣椒’差异较小。蝴蝶兰AP2/ERF在抗冷品种‘大辣椒’和不抗冷品种‘富乐夕阳’叶片中的表达差异暗示AP2/ERF基因家族在蝴蝶兰低温胁迫响应中起重要调控作用。     

香蕉抗逆相关基因MaERF的克隆与表达分析

 根据已获得的AP2/ERF基因片段,通过RACE方法获得一个香蕉ERF基因完整编码区序列,命名为MaERF。该基因cDNA全长1 611 bp,其中开放阅读框1 128 bp,编码376个氨基酸,包含一个保守的AP2/ERF结构域,基因组序列全长2 881 bp,含有一个内含子,剪切位点符合“GT-AG”规则;系统进化树表明该基因属于植物ERF转录因子家族的B2亚群。半定量RT-PCR分析表明,该基因在香蕉各个器官中均有表达,其中在根和叶中的表达量较低,而在果实和花中的表达较高;实时荧光定量Real-time PCR检测表明,受尖孢镰刀菌侵染及低温胁迫后,香蕉中该基因表达明显上调,推测其在香蕉胁迫反应中可能发挥重要作用。     

成熟猕猴桃果实中乙烯受体基因Ad-ETR2的克隆与序列分析

在分析GenBank登录的植物乙烯受体家族氨基酸和核苷酸保守区序列基础上,设计简并引物,通过RT-PCR扩增出1个657bp大小的cDNA片段,测序结果表明,该片段穴Ad-ETR2雪编码219个氨基酸,它与其它植物乙烯受体核苷酸同源性为79.9%～86.5%,氨基酸的同源性为85.4%～95.9%,序列分析推断该基因片段可能是与番茄Le-ETR1结构和功能类似的一类乙烯受体。     

草莓FaCBF1基因的克隆及表达分析

以‘丰香’草莓为试材,通过SON-PCR结合RT-PCR技术获得了1个冷诱导转录因子CBF/DREB家族基因编码区全长cDNA序列,命名为FaCBF1,GenBank登录号为FJ767754。该基因包含1个长为636 bp的完整开放阅读框,编码211个氨基酸,预测分子量为23.4 kD,等电点为6.53。氨基酸同源性分析表明,FaCBF1与GenBank中登录的蔷薇科植物CBF/DREB具有较高的同源性。进化树分析表明,草莓FaCBF1与近缘属的月季、苹果和沙梨处于同一进化枝上,而与李属植物进化关系较远。半定量RT-PCR分析显示,FaCBF1能被低温、干旱和高盐胁迫诱导,但对ABA诱导不敏感;在同一诱导时期在根中的表达量高于叶和茎中的表达量。     

牡丹切花ERF转录因子基因的分离与表达分析

利用已获得的‘洛阳红’牡丹花瓣转录组数据库,筛选得到3个与植物乙烯响应因子ERF蛋白同源性较高的Unigene序列,利用RACE及RT-PCR技术,设计特异性引物对3个ERF基因最大阅读框进行扩增并测序。生物信息学分析表明PsERF1、PsERF2和PsERF3分别含有长为1 158、747和609 bp的开放阅读框,编码383、248和202个氨基酸残基,且均含有1个典型的AP2结构域。进化分析表明3个牡丹ERF转录因子分别属于ERF亚家族的B2组、B1组和B3组。利用实时定量PCR分析了3个ERF基因在牡丹乙烯敏感型品种‘洛阳红’和乙烯不敏感型品种‘雪映桃花’不同花器官（花瓣、雄蕊、雌蕊和萼片）以及不同发育级别切花花瓣中的表达情况。结果表明,PsERF1在2个品种花瓣中的表达量显著高于其他花器官,其表达量在‘洛阳红’切花发育过程中逐渐增加,而在‘雪映桃花’切花发育过程中逐渐降低,推测PsERF1可能对牡丹切花的乙烯响应具有重要的调控作用,PsERF2和PsERF3则可能同时参与了多种信号途径。     

龙眼水通道蛋白基因(DLPIP1)的克隆与表达分析

应用蛋白质组学研究低温胁迫下龙眼叶片蛋白质组变化时,发现PIP1蛋白在龙眼低温胁迫中上调表达。应用RACE技术克隆龙眼水通道蛋白基因全长cDNA,命名为DLPIP1,基因登陆号为JN572691,长度为1 132 bp,包括1个900 bp的开放阅读框,编码299个氨基酸序列,同源性分析表明,DLPIP1在21个不同植物中的一致性为90%~93%。应用生物信息学软件对DLPIP1氨基酸序列分析表明,含有7个跨膜区,有2个NPA单元,其氨基酸残基与MIP家族蛋白保守区序列完全一致。氨基酸序列比对发现,该序列与其他物种PIP质膜水通道蛋白氨基酸序列有很高的同源性。利用实时荧光定量技术对DLPIP1在低温胁迫下不同组织表达谱分析表明,DLPIP1在龙眼根、茎、叶中都有表达,在根中的表达量最高,其次是茎和叶。DLPIP1在低温胁迫时,随着低温胁迫时间的延长而发生变化。这说明DLPIP1蛋白在龙眼低温逆境过程中起作用。     

低温胁迫下佛手和枳乙烯应答因子6（ERF6）表达变化的比较分析

 以柑橘属寒敏感植物佛手‘青皮’品种叶片cDNA为模板,通过RT-PCR与RACE扩增,获得一个1 160 bp的乙烯应答因子（ethylene response factor,ERF）基因的cDNA序列,其基因编码区共999 bp,含有一个保守的AP2/EREBP结构域,与拟南芥AtERF6为同源基因,命名为CmsERF6（GenBank登录号为HQ698835）。4 ℃低温处理佛手和枳（柑橘属近缘种耐寒植物）植株,测定其寒胁迫生理指标（电解质渗出率、丙二醛含量）。使用实时荧光定量PCR,对佛手和枳叶中的ERF6表达含量进行测定分析,结果表明：低温对佛手与枳的ERF6表达均具有诱导作用,且表达量的变化趋势存在明显的差异。尤其在枳中,ERF6的表达较对照组上升约4 000倍,且电解质外渗率的变化与ERF6基因表达量变化具有一致性,说明ERF6基因参与低温胁迫应答。     

中国芦荟AlDREB2基因的克隆及其胁迫表达

 为了研究中国芦荟的抗逆机理, 以cDNA为模板, 利用3′RACE和PCR扩增方法, 克隆得到了一个编码DREB蛋白的基因, 命名为AlDREB2, GenBank登录号为FJ560460。其cDNA序列全长为886bp, 包含一个636 bp的开放阅读框, 推导编码的氨基酸序列(212个氨基酸) 与库拉索芦荟AlDREB1的序列相似性很高。进化树分析结果将AlDREB2 归入DREB 亚家族中A26亚组。利用RT-PCR 技术分析了AlDREB2 基因的表达与胁迫的关系, 表明AlDREB2 基因在非生物胁迫与生物胁迫中能够被不同程度诱导表达。     

南瓜肌醇单磷酸酶基因CmIMP1和CmIMP2的克隆与表达分析

以中国南瓜（Cucurbita moschata）为试验材料,利用同源克隆和南瓜转录组unigene序列获得2个IMP基因的全长cDNA序列,将两个基因命名为CmIMP1和CmIMP2,GenBank登录号为KP735607和KP735608。CmIMP1基因cDNA全长1 053 bp,包含1个810 bp的ORF,共编码269个氨基酸;CmIMP2基因cDNA全长945 bp,包含1个807 bp的ORF,共编码268个氨基酸。序列分析发现两个基因均含有磷酸酶家族锂敏感的3个特殊结构域,系统进化树分析表明这2个南瓜CmIMP与其他植物IMP有较高同源性（63.8% ~ 94.0%）,并与葫芦科作物最接近。采用荧光定量PCR研究CmIMP在各组织及逆境条件下的表达模式显示,其表达具有组织特异性,在叶中表达最高,须和幼果次之;盐胁迫和干旱胁迫可强烈诱导CmIMP表达,ABA对CmIMP的诱导较微弱,推测CmIMP在南瓜响应非生物胁迫的分子调控机制方面发挥重要作用。     

桃乙烯应答因子PpERF1a的克隆与功能分析

以‘丰光’油桃嫩梢组织为试材，克隆了1个ERF家族基因并命名为PpERF1a（ppa018178m）。该基因全长为600 bp，编码199个氨基酸，含有1 个典型的AP2 结构域。亚细胞定位结果显示PpERF1a定位于细胞膜和细胞核。在拟南芥中超量表达PpERF1a，共获得15个阳性转基因株系。与对照相比，转基因植株出现发育不良的表型，其中6株持续长出莲座叶，但不抽薹；6株能够抽薹开花，但不结实且生长势明显弱于对照；3株能够开花结实，但种子产量极低。这些结果表明PpERF1a在转基因拟南芥中具有调控生长发育的功能，为后期在桃中开展PpERF1a的功能研究提供了有益的启示。     

ERF转录因子新成员JERF3提高百合的耐盐性

以麝香百合鳞片愈伤组织为受体,通过对农杆菌浓度、培养时间及抗生素敏感性的比较试验,建立了农杆菌介导的麝香百合愈伤组织遗传转化的优化体系,并利用该体系将ERF转录因子JERF3基因导入百合中,通过PCR、RT-PCR及Southern blot检测,证明JERF3已整合到百合基因组中并在转录水平上表达。对T0代转基因株系耐盐性鉴定表明,与未经转化的对照相比,转基因百合的耐盐性能明显提高,说明JERF3基因的超表达能有效提高转基因百合抵抗盐害的能力。     

月季RhRTE1 的克隆及其对乙烯响应特性分析

 利用数据库中已发表的拟南芥AtRTE1基因序列,从构建的月季花朵乙烯响应EST数据库中筛选得到一个RTE1同源片段,结合RACE技术,从月季切花品种‘Samantha’花瓣中克隆得到全长为1 233 bp的RTE1同源基因。该基因包含一个732 bp的开放阅读框、339 bp的5′非翻译区和162 bp的3′非翻译区,编码一个243 aa的肽链,其理论分子量为27.6 kD,等电点为6.87。该基因推定的氨基酸序列与拟南芥AtRTE1同源性较高,属于RTE家族中的第1组别基因,命名为RhRTE1。该基因在月季花朵自然开放中表达逐步增强,并能够被外源乙烯和切伤处理所显著诱导。将35S::GFP-RhRTE1融合蛋白转入拟南芥,发现RhRTE1蛋白主要定位于细胞膜上,并且转化植株降低了对乙烯的敏感性。以上结果说明RhRTE1可能参与了乙烯介导的月季花朵开放过程,并可能参与了花朵响应伤害的修复过程。     

月季Rh-ADF1基因在花瓣扩展中响应乙烯的表达特性分析

 为探讨肌动蛋白解聚因子（actin depolymerizing factor,ADF）是否参与乙烯对月季花瓣细胞扩展的调节,以切花月季‘Samantha’为试材,从花瓣中分离到响应乙烯的ADF基因,并将其命名为Rh-ADF1,在GenBank中的登录号为JN048105。推定的氨基酸序列分析表明,Rh-ADF1的开放阅读框长度为423 bp,编码140个氨基酸。半定量RT-PCR分析结果表明,Rh-ADF1在花朵的各个器官中均有表达,在花瓣中略高于其他器官;该基因表达能够被乙烯处理强烈诱导升高,被乙烯作用抑制剂1-MCP（1-Methylcyclopropene）处理明显降低。在洋葱表皮细胞中进行的瞬时表达分析表明,Rh-ADF1蛋白分布在整个细胞中,主要与actin组成的微丝网络结合。据此推测,Rh-ADF1基因在转录水平上参与乙烯对花瓣扩展的调节,乙烯可能通过Rh-ADF1基因调控了花瓣细胞骨架的动态变化,进而影响花瓣细胞扩展和形态变化。     

Isolation of a citrus ethylene-responsive element binding factor gene and its expression in response to abiotic stress,girdling and shading

Information about citrus ethylene-responsive element binding factor (ERF) genes and their functions in fruit ripening or in stress tolerance is still scarce. In the present study, one of ERF genes, CitERF was isolated from fruit of Citrus unshiu with a maximal putative open reading frame encoding 207 amino acids. The deduced protein contains a region rich in acidic amino acids, an AP2/ERF domain and a KRRK nuclear localization signal. It belongs to group B of Class I in the ERF subfamily in which MdERF2 (Malus × domestica ethylene-response factor 2) and PsERF1b (Prunus salicina ethylene-response factor 1b) were involved in the progress of fruit ripening. CitERF mRNA level in fruit peel and pulp increased obviously along with fruit ripening. However, its expression could be reduced significantly by treatments of total shading and fruit-bear-shoot girdling plus defoliation during fruit ripening. As for the response to abiotic stresses, CitERF expression was found to be induced continuously during the treatment of 10% polyethylene glycol. On the other hand, it could be induced to high level at 1 h after the treatment of 4 °C or 250 mM NaCl and then declined continuously. Taken together, the results suggested that CitERF may play an important role in some biological processes during fruit ripening and in improving tolerance to drought, low temperature and salt stress.     

月季乙烯受体基因的全长克隆及原核表达分析

 利用已构建的月季花朵转录组数据库,筛选得到了22个与乙烯受体同源性较高的UniGene片段,并利用这些片段从月季花瓣中克隆得到了3个乙烯受体基因全长,分别为RhETR1、RhETR3和RhETR5。其中,RhETR1全长为2 814 bp,编码一个595 aa的肽链;RhETR3全长为2 468 bp,编码一个765 aa的肽链;RhETR5全长2740 bp,编码一个742 aa的肽链。这3个基因推定的编码蛋白分别与枣（Ziziphus jujuba）中的ZjETR1、杨树（Populus trichocarpa）中的PtETR2和砂梨（Pyrus pyrifolia）中的PpERS2同源性最高,依次为85.2%、75.8%和80.3%。蛋白同源性及结构分析表明,RhETR1和RhETR5分别与拟南芥中的ERS1和ETR1结构相似,属于第1亚家族成员,RhETR3与ERS2结构相似,属于第2亚家族成员。在花朵自然瓶插过程中,这3个基因分别表现为下调、上调和组成型表达。利用原核表达载体,选择和月季花朵开放最为相关的RhETR3,获得了和理论分子量一致的重组蛋白,表明克隆得到的RhETR3具有完整的读码框。     

月季切花乙烯受体RhETR3互作蛋白RhTSPO1的筛选和鉴定

利用已构建的月季分裂泛素酵母双杂文库,以月季乙烯受体蛋白RhETR3为诱饵,筛选能够与RhETR3结合的互作蛋白。经酵母回转验证共得到26个阳性克隆。在候选蛋白中发现一个TspO/MBR蛋白家族的成员,命名为RhTSPO1。通过RACE分离了RhTSPO1基因全长,共777 bp,开放阅读框（ORF）为579 bp,编码192个氨基酸。在酵母中,利用酵母生长和β–半乳糖苷酶活性（β-gal）验证了RhETR3和RhTSPO1之间确实存在互作。将RhETR3-GFP和RhTSPO1-mCherry融合蛋白共转入烟草,激光共聚焦显微镜观察发现RhTSPO1和RhETR3蛋白共同定位于内质网上。月季花朵自然开放过程中,RhTSPO1在花瓣中的表达呈现先增强后减弱的趋势,与开放和衰老过程紧密联系,表明RhTSPO1可能参与了花朵开放过程。本试验结果表明乙烯受体蛋白水平的互作调节可能也参与月季花朵开放和衰老的调节。