卷首语

<正>为广大农业科研工作者搭建沟通平台,2014年第7期《Agricultural Science&Technology》针对分子生物学、土壤肥料、贮藏加工等栏目发表了诸多有指导意义的成果,这里择编几篇。新疆维吾尔自治区畜牧科技学院刘明军博士采集初生转基因羔羊的子叶、脐带、尾组织以及死亡羔羊的全身各组织,提取基因组DNA作为模版进行PCR检测,以Follistatin基因N+D1片段特异性引物进行PCR检测。同时,对慢病毒载体的CMV启动子、5-LTR等结构元件进行PCR检测,提取死亡羔羊的全身组织以及转基因羔羊的活体肌肉组织总RNA,进行RT-PCR检测。该研究建立的转基     

卷首语

<正>为广大农业科研工作者搭建沟通平台,2014年第7期《Agricultural ScienceTechnology》针对分子生物学、土壤肥料、贮藏加工等栏目发表了诸多有指导意义的成果,这里择编几篇。新疆维吾尔自治区畜牧科技学院刘明军博士采集初生转基因羔羊的子叶、脐带、尾组织以及死亡羔羊的全身各组织,提取基因组DNA作为模版进行PCR检测,以Follistatin基因N+D1片段特异性引物进行PCR检测。同时,对慢病毒载体的CMV启动子、5-LTR等结构元件进行PCR检测,提取死亡羔羊的全身组织以及转基因羔羊的活体肌肉组织总RNA,进行RT-PCR检测。该研究建立的转基     

市售马铃薯转基因成分检测

[目的]检测市售马铃薯转基因成分。[方法]采用CTAB法提取样品的基因组DNA,分别设计花椰菜花叶病毒35s启动子（pro-moter from canliflomer mosaic virus,CaMV 35s）和胭脂碱合成酶3’转录终止子（nopaline synthase lerminator,NOS）作为特异性引物,然后对基因组DNA进行PCR扩增检测,根据扩增后产物的琼脂糖凝胶电泳图可分析出其中是否含有转基因成分。[结果]10份马铃薯样品中5份检测出含有转基因成分,占检测样品的50%。[结论]由结果推断出市场上销售的转基因马铃薯占总马铃薯销售量的50%左右。     

1种适用于转基因玉米PCR检测的DNA快速提取方法

[目的]建立一种快速提取玉米基因组DNA的方法。[方法]对改良CTAB法进行进一步简化,不需要进行沉淀、洗涤、溶解和RNA消化等步骤,建立一种快速提取玉米基因组DNA的方法。[结果]该方法获得的DNA完整性及PCR扩增效果与试剂盒提取方法相比无明显差异;经过对样品ELISA检验可知,该方法得到的DNA用于PCR检测结果准确。[结论]该方法能够满足转基因玉米PCR检测中快速、高效、准确、高通量的要求。     

抗草丁膦转基因玉米不同DNA提取方法及PCR检测

以改良PEX,CTAB和SDS方法从转基因玉米材料中提取基因组DNA,并以外源CaMV35S启动子、bar基因及内源基因Zein的序列设计引物,用PCR方法扩增预期大小的DNA片段。结果显示,3种方法提取的DNA用以PCR检测都获得了预期大小的扩增片段,但改良PEX提取方法更省时省力。研究认为,改良PEX提取方法是一种简捷、快速和高效的植物DNA提取方法。     

人α干扰素转基因小鼠模型的建立

[目的]建立人α干扰素（interferon-α,IFN-α）转基因小鼠,为研究IFN-α在抗病毒中的作用提供模型动物。[方法]将人IFN-α基因插入CMV启动子下游,构建转基因表达载体,通过原核显微注射法建立IFN-α转基因小鼠。[结果]通过特异性引物PCR法和South-ern杂交法检测出4只阳性转基因小鼠。分离4个转基因鼠系F1代PCR阳性小鼠血液中的淋巴细胞进行RT-PCR检测,其中3个鼠系为阳性。收集阳性小鼠血清,用ELISA方法和微量板染色测定法检测出3个转基因鼠系均有IFN-α表达。[结论]成功建立了CMV启动子启动的表达人IFN-α基因转基因小鼠,为研究干扰素抗病毒机制及对其他动物进行抗病毒感染基因工程育种研究奠定了基础。     

家禽血液基因组DNA的快速提取

[目的]建立一种应用硅胶膜提取禽血DNA的新方法。[方法]应用硅胶膜法和传统的酚/氯仿法提取抗凝禽血基因组DNA,设计合成了一对2.7 kb的鸡卵清蛋白基因的引物,检测这2种方法提取的基因组DNA模板对聚合酶链式反应（PCR）扩增效率的影响。[结果]用硅胶膜法提取的基因组DNA产量和质量均比传统的酚/氯仿法高,将该法提取的基因组DNA作为模板能够消除抗凝剂对后续PCR反应的影响。[结论]硅胶膜法为快速提取高质量的禽血基因组DNA奠定了基础。     

棉花中转基因成分多重PCR检测体系的建立

以棉花内源基因sad1、报告基因GUS、外源抗虫基因Cry1 Ab/Ac、筛选基因NPTⅡ、NOS终止子和CaMV35 S启动子为检测对象,设计的6对引物能扩增长度合适的基因片段且避免了引物二聚体。通过优化PCR扩增体系中不同引物终浓度的配比以及退火温度对多重PCR检测的影响,建立了棉花转基因成分6重PCR检测体系。结果表明:采用本研究建立的棉籽基因组DNA提取方法,该6重PCR检测体系能够有效地从少至1颗棉籽的少量样品里检测出棉花中的转基因成分。     

黑木耳YBS-3菌株ras启动子的克隆与分析（摘要）

[目的]从黑木耳基因组中克隆内源ras启动子,为黑木耳利用基因工程培育优良品种提供启动子元件材料。[方法]利用PCR技术,以黑木耳菌株YBS-3基因组DNA为模版,克隆得到4条ras启动子片段。采用启动子序列分析软件Place、Promoter prediction和TFSEARCH ver1.3对其进行序列结构分析。[结果]4条启动子片段均含有核心启动子序列,除典型的基本作用元件TATA box和CAATbox外,还有许多其他重要作用元件如GATABOX、GCGC BOX和CCAATBOX1等,同时每条片段中均具有至少一个转录起始位点,且检测到HSF、AP-1、GCN4等多个转录因子结合位点。     

酚／氯仿抽提法提取绵羊凝血块中基因组DNA

[目的]对组织DNA提取方法进行改进,建立一种从绵羊凝血块中提取基因组DNA的方法。[方法]将绵羊凝血块用眼科剪剪碎,用组织DNA抽提液裂解细胞,用蛋白酶K消化后,经过酚／氯仿抽提,无水乙醇沉淀获得基因组DNA。用NanoDropND-1000微型分光光度计检测DNA浓度和纯度。用0．8％琼脂糖凝胶电泳检验基因组DNA的完整性。以绵羊微卫星位点BM203为扩增位点,分别以F：5’-GG（汀G11：AcAmGTTCCC-3’,R：5’-CTGCTCCCCACTACTCCTTC-3’为上下游引物,进行PCR扩增试验。PCR产物用1．5％琼脂糖凝胶电泳检测．[结果]提取的DNA浓度为（159．90±0．70）ng／μl,A260／A280比值为1．80±0．01,分子完整,结果理想。以从凝血块中提取的DNA为模板,对绵羊BM203微卫星位点进行了PCR扩增,扩增产物条带整齐、明亮、特导性强,扩增效果好。[结论]该方法简单、实用,提取的DNA可满足后续相关研究对DNA质量的要求,值得推广借鉴。     

靶向PRRSV核衣壳蛋白N基因的siRNA表达载体的构建及鉴定

[目的]研究靶向PRRSV核衣壳蛋白N基因的siRNA表达载体的构建及鉴定：[方法]设计并人工合成靶向PRRSV核蛋白N基因的3个siRNA靶序列,将其插入CMV启动子下游,克隆到真核表达载体pSilencer4．1-CMV中,对该重组表达载体进行酶切鉴定及DNA测序。[结果]成功构建了靶向核蛋白基因表达的siRNA干扰重组质粒载体pSilencer—N。[结论]该研究为进一步运用RNA干扰技术进行PRRSV防治研究奠定了基础。     

柑橘转基因成分多重PCR检测体系的建立

[目的]建立柑橘转基因成分的多重PCR检测体系。[方法]根据GenBank中pBI121质粒序列和柑橘(Citrus.)Actin基因序列,分别设计CaMV35S启动子、NOS启动子、NOS终止子特异引物和Actin基因的特异引物,建立能同时检测出4种序列的多重PCR检测体系,同时通过正交试验确定该体系的最佳引物浓度和比例及PCR反应体系中各因素的浓度及反应程序,并对该方法的灵敏度进行验证。[结果]试验得到的最佳MPCR反应体系为:10×buffer 2.5μl,25 mmol/L MgCl22.0μl;dNTP Mixture(2.5 mmol/L each)2.0μl,10μmol/L的Actin基因、35S启动子、NOS启动子、NOS终止子引物分别加入1.0、1.0、1.5、0.5μl,模板DNA 0.1μg,Taq DNA聚合酶1.25U,加ddH2O至25μl。PCR反应程序为:94℃预变性5 min;94℃30 s,64.1℃45 s,72℃50 s,31个循环;72℃10 min。试验中,经正交优化后的4重PCR反应灵敏度达0.1%。[结论]该研究建立的MPCR检测体系,理论上已能满足柑橘或其深加工产品的转基因成分检测。     

柑橘转基因成分多重PCR检测体系的建立(英文)

[目的]建立柑橘转基因成分的多重 PCR 检测体系。[方法]根据 GenBank 中 pBI121 质粒序列和柑橘(Citrus.)Actin 基因序列,分别设计CaMV35S 启动子、NOS 启动子、NOS 终止子特异引物和 Actin 基因的特异引物,建立能同时检测出 4 种序列的多重 PCR 检测体系,同时通过正交试验确定该体系的最佳引物浓度和比例及 PCR 反应体系中各因素的浓度及反应程序,并对该方法的灵敏度进行验证。[结果]试验得到的最佳MPCR 反应体系为:10×buffer 2.5 μl,25 mmol/L MgCl22.0 μl;dNTP Mixture (2.5 mmol/L each)2.0 μl,10 μmol/L 的 Actin 基因、35S 启动子、NOS 启动子、NOS 终止子引物分别加入 1.0、1.0、1.5、0.5 μl,模板 DNA 0.1 μg,Taq DNA 聚合酶 1.25 U,加 ddH2O 至 25 μl。PCR 反应程序为:94 ℃预变性5 min;94 ℃ 30 s,64.1 ℃ 45 s,72 ℃ 50 s,31个循环;72 ℃ 10 min。试验中,经正交优化后的4重PCR反应灵敏度达0.1%。[结论]该研究建立的MPCR检测体系,理论上已能满足柑橘或其深加工产品的转基因成分检测。     

草莓角斑病菌PCR检测研究

[目的]研究草莓角斑病菌的快速检测方法。[方法]根据草莓角斑病菌的hrp基因,设计了1对引物XF-F/R,进行该病菌PCR特异性扩增。[结果]该引物可特异性地扩增草莓角斑病菌的DNA、菌悬液、人工接种样品。[结论]该检测方法特异性强、灵敏度高,可适用于草莓角斑病菌的检测。     

转基因大豆MON89788转化体特异性定性PCR检测（摘要）（英文）

[目的]建立MON89788大豆转化体特异性定性PCR检测方法。[方法]利用TAIL-PCR技术分离MON89788大豆的3′端旁侧序列,据此序列设计3条特异性引物用于旁侧序列的扩增。经过3轮PCR扩增,获得特异性扩增产物,将此产物回收后克隆到pMD-18T载体上测序,所得序列用Vector NTI分析,并提交NCBI进行序列比对。并对该方法的特异性和灵敏度进行测试。[结果]获得了1 142 bp的3′端旁侧序列。经Blast检索比对,该序列包括2部分,1 ～618 bp为载体序列（E9终止子部分序列和LB序列）,619 ～1 142 bp为大豆基因组序列;依据该序列建立的PCR检测方法能特异性地从MON89788大豆中扩增出170 bp的产物,检测灵敏度达到0.05%,约为40个起始模板拷贝。[结论]该研究建立的方法特异性强、灵敏度高,可适用于MON89788大豆检测。     

3个绵羊群体BMPR-IB基因多态性与产羔数的相关分析

[目的]为解决多胎肉用绵羊杂交育种技术的关键问题提供依据。[方法]以BMPR-IB基因作为候选基因,采用PCR-RFLP方法检测其在萨福克羊、小尾寒羊及萨寒F1代杂交羊中的多态性分布,分析其与产羔数的相关性。[结果]在萨福克绵羊中只有1种基因型野生型(++);在小尾寒羊中检测到3种基因型纯合突变型(BB)、杂合突变型(B+)和野生型(++),基因型频率分别为0.14、0.80和0.06。在萨寒杂交绵羊中,检测到2种基因型(B+和++),基因型频率分别为0.99和0.01。3种绵羊的产羔数差异极显著,萨寒杂交羊的多羔率和平均产羔率均明显高于纯种萨福克羊。[结论]BMPR-IB基因的遗传方式符合孟德尔遗传规律。利用小尾寒羊对萨福克羊的繁殖性能进行杂交改良是有效可行的。     

外源Toll样受体2转基因绵羊的构建与鉴定

Toll样受体2（Toll-likereceptor2,TLR2）是识别革兰氏阳性细菌如引起羊乳腺炎、炭疽病、破伤风等病原体的一种重要受体,而TLR2过表达转基因羊为研究TLR2在防卫细菌侵染中的作用提供了一个理想的模型。因此,研究首先通过显微注射TLR-2过表达载体3S—Loxp—TLR2的方法对绵羊进行外源基因TLR2整合,然后采用PCR和Southernblot方法对其进行鉴定、拷贝数验证和表达量分析。结果表明,注射148个受精卵,共产下15只小羊,其中8只小羊检测为阳性,转基因率为53．3％;Southern杂交结果发现转TLR2小羊的基因组中外源TLR2基因均为单拷贝;且转基因羊TLR2mRNA表达高于对照。说明成功构建了转TLR2基因羊。     

cNHX1基因转化草莓的研究

[目的]探讨将完整的含柑橘cNHX1基因转化为草莓植株。[方法]以弗吉尼亚草莓品种为试材构建了含柑橘cNHX1基因的植物表达载体,并进行了酶切鉴定,然后将表达载体导入农杆菌EHA105中,获得了工程菌株;利用农杆菌转化法,把cNHX1基因转化成草莓植株,并利用PCR方法鉴定了转化植株。[结果]利用农杆菌转化法获得了转cNHX1基因,通过进一步利用含Kam的平板进行筛选,获得了纯合的转基因植株;对获得的转基因草莓植株提取叶片DNA,利用引物F01和R02进行扩增,结果在草莓基因组中可以扩增出1.63kb的目的条带,证明cNHX1基因已经整合到草莓基因组。[结论]为获得耐盐程度显著提高的转基因草莓奠定了初步基础。     

水稻线粒体基因atp6超表达载体的构建及遗传转化

[目的]克隆水稻线粒体基因atp6,构建转基因表达载体,获得35S∷Rf1b5'∷atp6转基因水稻植株。[方法]设计目的基因的特异引物,采用TRIzol法提取水稻叶片总RNA,借助Toyobo反转录试剂盒反转录为cDNA,通过PCR扩增得到atp6全序列;将atp6连接到含线粒体信号肽(Rf1b5')的pCAMBIA1302双元表达载体上,采用农杆菌介导的愈伤组织侵染法进行水稻的遗传转化。[结果]利用目的基因atp6成功构建了35S∷Rf1b5'∷atp6植物表达载体,并获得了转atp6基因的阳性植株。[结论]为探讨水稻中超表达atp6对水稻生长的影响奠定基础。