弯曲菌多重PCR检测方法的建立及其初步应用

以16S rRNA、mapA和ceuE为靶基因,建立检测空肠弯曲菌和结肠弯曲菌的多重PCR方法。特异性试验能分别扩增出空肠弯曲菌和结肠弯曲菌的特异性条带,其他参考菌株均未扩增出条带;敏感性试验表明,基于增菌培养和选择性培养的多重PCR方法对弯曲菌检测限为10 mL或10 g模拟污染样品,最低可检测0.925 pg.μL-1空肠弯曲菌DNA和1.050 pg.μL-1结肠弯曲菌DNA。以国家标准为参照,应用该方法对180份生鲜鸡肉样品进行检测,结果表明多重PCR方法具有快速、简便、特异性强和灵敏度高等特点,可克服传统生化鉴定和血清学方法的不足,为弯曲菌检测提供新的技术。     

江苏市售禽肉中弯曲杆菌的检测及耐药性分析

为了解江苏市售禽肉中弯曲杆菌的污染及耐药情况,从江苏省10个市区农贸市场及超市采集252份新鲜鸡肉、鸭肉、鸽肉样品进行弯曲杆菌的分离鉴定,采用纸片扩散法测定分离菌株对8类10种抗菌药物的耐药性,采用PCR及测序技术检测菌株携带重要耐药基因的情况。结果表明：共分离到34株空肠弯曲杆菌和66株结肠弯曲杆菌,阳性率分别为13.5%和26.2%。鸡肉、鸭肉、鸽肉样品中弯曲杆菌阳性率分别为41.4%、29.6%和38.2%。耐药性检测结果显示,弯曲杆菌对四环素、红霉素、阿奇霉素、妥布霉素、氨苄西林和庆大霉素耐药率分别为60.0%、54.0%、54.0%、52.0%、50.0%和41.0%,对氟苯尼考和磷霉素耐药率分别为13.0%和2.0%,结肠弯曲杆菌的多重耐药率(84.8%)显著高于空肠弯曲杆菌(26.5%)。分离菌株对10种抗生素共产生31种耐药谱,空肠弯曲杆菌和结肠弯曲杆菌的优势耐药谱分别为AMP-CN-TOB-CIP-TE和TOB-E-AZM-SXT-TE。aadE-sat4-aphA-3及RE-cmeABC检出率分别为26.0%和20.0%,其与弯曲杆菌多重耐药表型符合率分别为90.9...     

鸡肉中弯曲杆菌属的分离与鉴定

对从长春地区某一肉鸡屠宰加工厂在９个月期间内抽取的１５２份冻鸡肉样品进行弯曲杆菌检查,发现３８．２％的样品为弯曲杆菌属阳性。经ＡＰＩ Ｃａｍｐｙ鉴定系统鉴定,其中３２．９％为空肠弯曲杆菌（Ｃ．ｊｅｊｕｎｉ）和大肠弯曲杆菌（Ｃ．ｃｏｌｉ）阳性。本次调查结果证实：在我国市场上销售的鸡肉中存在弯曲杆菌属的污染,如果加工不当或加工卫生不良,会对消费者的健康构成潜在的威胁。     

空肠弯曲杆菌PCR-ELISA检测方法的建立

针对空肠弯曲杆菌(Campylobacter jejuni)旋转酶基因(gyrA gene)设计特异性引物和探针,将生物素和地高辛分别标记上游引物5＇端和核酸探针3 ＇端,并对反应条件进行优化,建立空肠弯曲杆菌PCR-ELISA检测方法.结果表明:该方法能特异的检测空肠弯曲杆菌基因组DNA,检测阈值为2fg,敏感性是常规PCR的10倍.对模拟泄殖腔样本进行检测,检测限为50 cfu/mL.对100份临床样品进行检测,PCR和PCR-ELISA方法阳性检出率分别为60％和69％.     

副猪嗜血杆菌PCR检测方法的建立与初步应用

针对副猪嗜血杆菌(Haemophilus parasuis,HPS)16 S rRNA序列设计1对特异性引物,能扩增出821 bp的特异性DNA片段,并据此建立了快速准确鉴定副猪嗜血杆菌PCR方法,临床试验证明该方法具有很好的特异性和敏感性.13份疑似病料检测结果表明,PCR检测结果与传统生化鉴定结果符合率为100％.结果表明已成功建立了副猪嗜血杆菌PCR检测方法,并可应用于临床副猪嗜血杆菌的检测.     

宁德地区鸡场空肠弯曲杆菌调查与耐药性分析

为了解宁德地区鸡场中空肠弯曲杆菌的流行状况及耐药特征,于2018年9月在宁德地区部分鸡场随机采集100份鸡粪便样品,进行空肠弯曲杆菌的分离鉴定、多位点序列分型,随后采用微量肉汤稀释法检测分离菌株对9种抗生素的敏感性。结果显示,100份样品中共分离得到空肠弯曲杆菌23株,总体分离率为23.0%;23株空肠弯曲杆菌被分为14个序列型,其中优势序列型为ST354,同时鉴定出多个新的序列型;药敏检测结果显示,23株空肠弯曲杆菌对泰利霉素、阿奇霉素和克林霉素具有敏感性,对其他抗生素均产生不同程度的耐药,其中对萘啶酸、四环素和环丙沙星的耐药率分别高达91.3%、91.3%及87.0%;23株空肠弯曲杆菌均表现出至少1种耐药表型,且78.3%的菌株表现多重耐药性。以上结果反映出宁德地区鸡场空肠弯曲杆菌复杂的流行状况及严重的耐药性,相关研究结果为宁德地区空肠弯曲杆菌的流行监测及养殖场用药提供参考依据。     

MPN-PCR法定量检测武汉鸡肉制品中的空肠弯曲菌

空肠弯曲菌(Campylobacter jejuni)是引起人类细菌性腹泻的主要人畜共患病原菌之一,严重时可导致人类格林-巴利综合征。其中鸡肉污染导致的食源性传播是人类感染的重要原因。为了调查武汉市鸡肉制品的空肠弯曲菌污染情况,运用最可能数法(MPN)及聚合酶链式反应(PCR)技术结合,即MPNPCR方法 ,对市场采集的128份鸡肉样品进行了空肠弯曲菌的定量检测,结果阳性检出率为18.75%,其中鲜鸡肉检出率为28.26%,冻鸡肉检出率为13.41%,含菌量范围为3.6~92.0 MPN/g。     

临床型空肠弯曲杆菌生物膜体外模型建立及相关特性研究

空肠弯曲杆菌是一种在世界范围内普遍存在的人畜共患病病原,生存条件严苛。研究发现,该菌在一定条件下可以形成一种能够抵抗外界环境不良影响生物膜,这也是该菌能够在恶劣环境中存活并产生耐药性的重要原因。文章选取临床分离空肠弯曲杆菌为研究对象,建立其生物膜体外模型,通过PCR、扫描电镜等一系列方法对空肠弯曲杆菌生物膜进行鉴定。正交试验法对培养基、温度以及空气条件三种因素对空肠弯曲杆菌生物膜形成影响进行研究。结果表明,体外生物膜形成最佳条件为MHB培养基、37℃和常规空气条件。     

临床型空肠弯曲杆菌生物膜体外模型建立及相关特性研究

空肠弯曲杆菌是一种在世界范围内普遍存在的人畜共患病病原,生存条件严苛.研究发现,该菌在一定条件下可以形成一种能够抵抗外界环境不良影响生物膜,这也是该菌能够在恶劣环境中存活并产生耐药性的重要原因.文章选取临床分离空肠弯曲杆菌为研究对象,建立其生物膜体外模型,通过PCR、扫描电镜等一系列方法对空肠弯曲杆菌生物膜进行鉴定.正交试验法对培养基、温度以及空气条件三种因素对空肠弯曲杆菌生物膜形成影响进行研究.结果表明,体外生物膜形成最佳条件为MHB培养基、37℃和常规空气条件.     

链球菌通用PCR检测方法的建立及应用

为建立链球菌快速检测方法,根据链球菌延伸因子EF-Tu基因设计合成1对通用引物,对链球菌属及其他属细菌进行PCR检测.结果表明,所设计的通用引物对猪链球菌2型和无乳链球菌均能扩增出1条大小为197 bp的特异性DNA条带,而对金黄色葡萄球菌、表皮葡萄球菌、粪肠球菌、大肠埃希氏菌、枯草芽孢杆菌、绿脓杆菌、都柏林沙门氏菌和多杀性巴氏杆菌均呈阴性反应;经对PCR产物进行测序分析表明,扩增片段与GenBank上链球菌相应序列的同源性达90%～98%;对链球菌DNA样本不同稀释度的检测显示,该PCR的最低检出量可达0.1 ng/mL;利用PCR检测方法对11株链球菌分离物进行检测,结果均能扩增出与预期大小相一致的目的条带,与传统生化鉴定结果符合率达到100%.这些结果表明,已成功建立了链球菌PCR检测方法,并可应用于临床链球菌的鉴定.     

冰鲜鸡肉中致病菌三重PCR检测方法的建立

【目的】建立在鸡肉生产一线具有较强操作性,并可同时检测沙门氏菌、单增李斯特菌、大肠杆菌O157的三重PCR方法。【方法】利用该3种致病菌的特异性基因invA、HlyA、rfbE设计3对引物,在确定方法特异性和抗干扰能力的基础上,用优化后的反应体系对反应灵敏度进行测定,模拟并检测在鸡肉中常见腐败菌和鸡肉基质对检测方法的干扰影响作用下,在前增菌程序的辅助下该方法的实际样品检测灵敏度。【结果】该方法特异性和抗干扰能力强,3种致病菌测序结果的同源性分别达到100%、99%和99%,反应体系的最佳退火温度为51℃,灵敏度试验中3种致病菌同时检出的检测线达到103 CFU/mL,单重的灵敏度达到101 CFU/g,模拟实际样品检测中,经过20 h的前增菌后,三者同时检出的灵敏度达到101 CFU/g,单重PCR的灵敏度达到100 CFU/g;对60份屠宰线上的鸡胴体样品和32份超市鸡肉样品中沙门氏菌、单增李斯特菌、大肠杆菌O157的检出率分别为20%、3.3%、21.7%(屠宰线样品)和25%、21.9%、6.25%(超市样品)。【结论】成功建立了可同时检出鸡肉中沙门氏菌、单增李斯特菌和大肠杆菌O157的三重PCR方法,可为生产一线的致病菌检测提供参考。     

贵阳市市售鸡肉中五种食源性致病菌污染状况调查研究

对贵阳市市售鸡肉中5种食源性致病菌的污染情况进行调查,结果表明:50份样品中食源性致病菌总检出率为48%,其中空肠弯曲菌、沙门氏菌、金黄色葡萄球菌、志贺氏菌和单核细胞增生李斯特菌的检出率分别为24.0%、22.0%、6.0%、2.0%、0,40份冻鸡肉样品的检出率为55%,10份鲜鸡肉样品的检出率为20%。对农贸市场市售冻鸡肉样品进行抽查,34份样品中5种致病菌的检出率为58.8%,其中空肠弯曲菌、沙门氏菌、金黄色葡萄球菌、志贺氏菌和单核细胞增生李斯特菌的检出率分别为32.3%、17.6%、5.9%、2.9%、0;对6份超市冻鸡肉样品进行检测,食源性致病菌的检出率为33.3%,其中空肠弯曲菌、沙门氏菌、金黄色葡萄球菌、志贺氏菌和单核细胞增生李斯特菌的检出率分别为0、16.7%、16.7%、0、0。     

猪肉及其制品中几种病原微生物芯片检测方法的建立及应用

[目的]建立金黄色葡萄球菌、沙门氏菌、大肠杆菌O157：H7、单增李斯特氏菌和空肠弯曲杆菌检测的基因芯片方法,并在实际应用中检测芯片的效果。[方法]以5种目标菌保守基因片段为模板设计引物,用待检样品增菌后提取的DNA模板进行2个独立的多重PCR扩增。扩增产物与固定有5种目标致病菌特异性探针的基因芯片进行杂交,用芯片扫描仪对芯片杂交结果进行扫描并判定结果。[结果]使用基因芯片检测5种细菌的检测下限分别为：金黄色葡萄球菌8.7×105cell/ml;大肠杆菌O157：H7 5.0×105cell/ml;沙门氏菌4.4×105cell/ml;单增李斯特氏菌2.4×105cell/ml;空肠弯曲杆菌6.2×106cell/ml。[结论]与传统方法比较,芯片法具有较高的特异性和灵敏性,是一种能应用于实际的快速高通量检测细菌的方法。     

襄樊市肉食品大肠杆菌污染状况的检测

采用国家标准法对抽样的肉类食品进行大肠杆菌的检测鉴定,结果表明：从襄樊市的几个大型农贸市场随机抽检的60个样品中,生鸡肉大肠杆菌检出率为30%,生猪肉50%,生牛肉20%,熟肉类20%。襄樊市肉类食品总体上大肠杆菌污染程度较轻,但猪肉类检出率较高,需引起有关部门的重视,特别是夏季,要加强监督检测,以防止出现大规模的食物中毒事件。     

广州市售肉类食品源大肠埃希菌耐药性分析

【目的】了解广州市售肉类食品源大肠埃希菌的污染和耐药情况。【方法】自2011年7月至8月,从广州市各大农贸市场和超市采集市售肉类样品310份,其中猪肉253份,鸡肉57份。采用选择性培养基分离鉴定大肠埃希菌Escherichia coli,琼脂稀释法测定大肠埃希菌对19种抗菌药物的最小抑菌浓度(MIC)。【结果】310份样品中共分离到213株大肠埃希菌,分离率为68.7%,其中猪肉源177株,鸡肉源36株。受试菌株对复方新诺明、链霉素和四环素的耐药率超过75.0%,对氨苄西林、萘啶酸、氯霉素、新霉素、氟苯尼考、磷霉素、环丙沙星、安普霉素、恩诺沙星、庆大霉素和头孢唑啉的耐药率为10.0%~60.0%,而对头孢西丁、头孢曲松、头孢他啶、黏菌素和阿米卡星表现较为敏感,耐药率小于5.0%。鸡肉源大肠埃希菌对头孢唑啉、头孢西丁、头孢曲松、头孢他啶和磷霉素的耐药率均高于猪肉源大肠埃希菌,差异极显著(P0.01)。213株大肠埃希菌中82.2%为多重耐药菌。【结论】广州市售肉类食品存在较为严重的多重耐药大肠埃希菌污染,且鸡肉源大肠埃希菌耐药性较猪肉源大肠埃希菌严重。     

抗鸡念珠菌卵黄抗体的研制及应用

本试验以龙岩某肉鸡场发病鸡嗉囔中分离得到的念珠菌作为免疫抗原,免疫25周龄产蛋鸡.经效力检验合格后,试制成抗鸡念珠菌卵黄抗体液.抑菌活性试验表明:效价为5 log2以上的高免卵黄表现出明显的抑菌活性,完全抑制了念珠菌的生长和繁殖.用抗鸡念珠菌卵黄抗体液分别喂服20日龄肉鸡和100日龄孔雀.结果表明:试验组鸡群嗉囔和咽喉念珠菌检出率较对照组显著降低(P<0.05);平均日采食量和日增重较对照组分别提高了80%和400%,死亡率则下降了7%.对孔雀的治疗效果与常规药物CuSO4相当.     

利用PCR技术鉴别畜禽肉中禽源性成分研究

为了建立一种快速、特异的禽源性成分检测方法,以线粒体16S r RNA基因序列为靶位点设计鸡、鸽、鹌鹑特异性引物,以常见畜禽肉(包括羊肉、牛肉、猪肉、兔肉、鸽肉、鹌鹑肉、鸡肉、鸭肉、鹅肉等)DNA为模板,进行PCR扩增和特异性检测。结果表明,筛选的引物能够有效地对动物源性成分进行检测,方便简洁,可快速鉴别畜禽肉食品中含有的鸡源性、鸽源性、鹌鹑源性成分。     

鸡肠道大肠杆菌多抗菌株C20耐药性基因的预测和分析

为揭示动物源大肠杆菌耐药性机制,追踪潜在的抗性基因传播机制及其来源,在先前公布的分离自鸡肠道的多抗耐药性菌株大肠杆菌Escherichia coli C20基因组基础上,对E.coli C20抗生素抗性基因种类、数量、来源及其耐药性机制进行分析。通过与已知的抗生素抗性基因数据库进行对比和注释,一共预测和注释了80个潜在的耐药性基因,包括与先前筛选的7种抗生素抗性对应的抗性基因。其中,喹诺酮类抗生素抗性基因位于C20基因组上,四环素、磺胺类、氯霉素、氨基糖苷类以及大环内酯类抗生素的抗性基因则位于C20环状质粒分子上。基因组聚类分析表明,菌株C20与大肠杆菌K-12菌株DH1、BW2952和MG1655亲缘关系较近,序列相似性97%~99%。3株K-12菌株基因组中没有发现与C20质粒类似的序列,表明C20菌株的抗性基因主要是通过质粒介导的水平基因转移方式从其他环境微生物中获得。     

鸡肉中三聚氰胺残留量检测方法研究

[目的]为检测动物性食品中的三聚氰胺提供参考方法。[方法]以鸡肉匀浆为材料,用高效液相色谱法和气相质谱法检测其中的三聚氰胺含量,并对检测方法的回收率和精密度进行测定。[结果]高效液相色谱法确定的鸡肉中三聚氰胺的最低检测限为1μg／g,最低定量限为2μg/g,在0．05-50μg范围内线性关系良好;方法的回收率大于80％,测定结果的日内变异系数小于7％,日间变异系数小于10％。气相质谱法确定的三聚氰胺的最低检测限为30ng／g,最低定量限为5030ng/g,在5—500ng／g范围内线性关系良好;方法的回收率在80％以上,测定结果的日内变异系数小于8％,日间变异系数小于10％。[结论]该研究为鸡肉中三聚氰胺的检测提供了新方法。