江苏省某猪场猪链球菌分离鉴定及致病特性分析

为了探明2018年3月江苏省某规模化猪场发病猪的病原,本研究对发病猪进行采样和细菌分离,并对细菌进行了PCR鉴定、多位点序列分型(MLST)及小鼠致病力分析。结果发现:在该场4份发病猪组织中分离到猪链球菌2型(SS2)、猪链球菌9型(SS9)菌株各2株,MLST分析显示分离的SS2菌株属于ST7,SS9菌株属于ST243,SS2、SS9分离菌株的毒力基因表现型分别为mrp^+epf^+sly^+orf2^+sao^+fbps^+gdh^+和mrp^-epf^-sly^-orf2^+sao^-fbps^+gdh^+。动物试验显示其中3株猪链球菌分离菌株对BALB/c小鼠有较强致病力。研究结果为该养殖场猪链球菌感染防控措施的制定提供了重要参考。     

猪链球菌2型实时荧光定量PCR检测方法的建立与应用

试验根据猪链球菌2型荚膜多糖（CPS）抗原设计CPS2J基因特异性引物,建立猪链球菌2型实时荧光定量PCR检测方法。结果显示,该方法的标准曲线为y=-3.073x+36.87,r=0.995,熔解曲线只有单一的特异峰。敏感性试验显示,该方法可以检测出模板最低浓度为1.0×10¹拷贝/μL,是普通PCR的10倍;特异性试验显示,对猪链球菌2型具有良好的特异性,能够区分其他血清型猪链球菌和其他细菌;重复性试验变异系数为0.37%~0.63%,均低于2.5%。临床检测显示该方法的敏感性明显高于常规PCR方法和细菌分离的方法。以上结果表明,本研究建立的方法敏感性高、特异性强、重复性好,有利于对猪链球菌2型的快速检测。     

猪链球菌1型临床分离株的鉴定和基因组学分析

从罹患肺炎型猪链球菌病的仔猪气管中分离出1株猪链球菌强毒株,命名为SS2011GZ,经PCR鉴定为血清1型。斑马鱼攻毒试验测得该菌株的半数致死量(LD50)为4.09×10⁴ CFU/mL,有较强毒力;全基因组测序分析显示,毒力基因型为mrp⁺gdh⁺epf⁺sly⁺fbps^-sao^-,存在19个基因岛,24种耐药基因,共线性分析发现该菌株基因有大量重排、倒位、插入、缺失,基因发生树中处于独立的分支。结果表明本研究分离的猪链球菌1型为强毒力株,基因共线性较差,存在大量特殊基因和耐药基因,有重要的公共卫生学意义,需引起足够重视。     

瘤胃厌氧真菌木聚糖酶基因的表达与酶学特性研究

旨在表达来源于瘤胃厌氧真菌基因组的4个木聚糖酶基因A、C、D和F,并比较分析其酶学特性。首先根据大肠杆菌基因编码偏好,合成可在大肠杆菌中表达的木聚糖酶基因序列,然后采用同源重组的方法将各序列分别插入载体pET-28a中,在大肠杆菌BL21(DE3)宿主菌中异源表达,并研究其酶学特性,结果成功表达出来源于厌氧真菌的4个木聚糖酶基因。测定其酶学性质发现,4种木聚糖酶的反应最适pH值均为8.0;木聚糖酶D的反应最适温度为37℃,其余3种木聚糖酶的反应最适温度均为45℃;4种木聚糖酶具有广泛的温度稳定性和pH稳定性;金属离子Ca²⁺、Mg²⁺、Mn²⁺显著促进木聚糖酶活性(P<0.05),而Zn²⁺则有明显的抑制作用(P<0.05);4种木聚糖酶降解山毛榉木聚糖的能力显著高于其他底物(P<0.05)。本研究成功表达了4种来源于厌氧真菌的木聚糖酶,其良好的温度和pH稳定性具有潜在的工业应用价值。     

T6SS在调控细菌竞争性优势过程中的作用及分子机制

<正>细菌为了在宿主体内生存、繁殖和扩散,必须分泌一些毒力因子。革兰氏阳性细菌(G⁺)具有单一胞浆膜,胞浆膜外是一层由肽聚糖组成的细胞壁;革兰阴性细菌(G^-)则有两层生物膜,分为内膜(胞浆膜)和外膜,内膜和外膜之间为一层肽聚糖层和外周质间隙。毒力蛋白质的分泌需要跨膜,蛋白质跨膜所依赖的分泌通路称为分泌系统^[1]。截至目前,已经在细菌中发现了5种主要类型的分泌系统：Ⅰ型分泌系统(TypeⅠsecretory system,T1SS)、Ⅲ型分泌系统(TypeⅢsecretory system,T3SS)、Ⅳ型分泌系统(TypeⅣsecretory system,T4SS)、Ⅴ型分泌系统(TypeⅤsecretory system,T5SS)和Ⅵ型分泌系统(TypeⅥsecretory system,T6SS)^[2-4]。     

猪链球菌2型Ⅲ型溶血素的研究

为了探讨猪链球菌2型(Streptococcus suis serotype 2,SS2)的Ⅲ型溶血素是否具有溶血活性以及Ⅲ型溶血素在SS2致病过程中的作用,本研究利用同源重组基因敲除法成功构建了SS205ZY的Ⅲ型溶血素(slyrp)基因缺失突变菌株△slyrp及双基因缺失突变菌株△sly/△slyrp,并比较了野生菌株和基因缺失突变菌株的溶血能力以及对小鼠的致病力.结果表明,slyrp基因敲除后可导致SS2裂解红细胞的能力有所下降,而双基因缺失突变菌株△sly/△slyrp的溶血能力完全丧失;slyrp基因敲除后对小鼠的致病力没有影响.结果提示猪链球菌2型Ⅲ型溶血素具有一定的溶血能力,该Ⅲ型溶血素在SS2感染过程中,对溶血素(sly)起协同作用,不是SS2主要的毒力相关基因.     

猪链球菌种与9型猪链球菌二重PCR检测方法的建立及应用

为了建立猪链球菌(Streptococcus suis,SS)种与9型猪链球菌(SS9)的快速诊断方法,本研究根据GenBank已登录的SS种特异性基因gdh和SS9型特异性基因CPS9H设计引物,以标准SS9株基因组DNA为模板,建立了SS种和SS9的二重PCR检测方法,并进行了特异性、敏感性和重复性试验;利用所建立的方法对检测疑似猪链球菌感染猪临床样品,并与常规细菌分离鉴定方法进行了比对。结果表明成功建立SS种和SS9型猪链球菌二重PCR检测方法,该方法的检测灵敏度可达100个CFU,特异性和重复性好;利用该方法对34份临床分离自疑似猪链球菌感染样品的细菌培养物进行了应用检测试验,其中有11份样品为gdh阳性,11份gdh阳性样品中有3份样品同时为SS9阳性。本研究成功建立了SS种与SS9型猪链球菌二重PCR检测方法,可用于猪链球菌种和SS9型猪链球菌的快速诊断。     

猪呼吸道病原菌多重PCR检测方法的建立及应用

为建立一种快速诊断由猪链球菌(SS)、猪胸膜肺炎放线杆菌(App)、猪多杀性巴氏杆菌(Pm)、副猪嗜血杆菌(Hps)、猪支气管败血波氏杆菌(Bb)和猪肺炎支原体(Mhp)单独或混合感染引起的猪呼吸道疾病的检测方法,基于上述6种病原菌对应的gdh(SS)、apxⅣA(App)、KMT1(Pm)、16S rRNA(Hps)、fla(Bb)和p36 ldh(Mhp)基因设计特异性引物,通过优化各反应条件建立了能同时检测SS、App、Pm、Hps、Bb和Mhp的多重PCR方法。结果显示,该方法特异性强,仅对SS、App、Pm、Hps、Bb和Mhp有特异性扩增,对大肠埃希氏菌、奇异变形杆菌、停乳链球菌和金黄色葡萄球菌等其他病原菌的扩增结果均为阴性;敏感性较高,对6种病原菌DNA的最低检出限分别为SS 8.66×10²拷贝/μL、App 1.05×10⁴拷贝/μL、Pm 8.61×10²拷贝/μL、Hps 9.01×10²拷贝/μL、Bb 7.54×10²拷贝/μL、Mhp 3.86×10...     

盐地碱蓬高亲和性K+转运蛋白基因SsHAK2的克隆与表达模式分析

盐地碱蓬在高盐生境中可以有效吸收K⁺,并维持细胞内K⁺浓度的相对稳定。高亲和性K⁺转运蛋白KT/HAK/KUP家族成员在植物K⁺吸收过程中发挥重要作用。本研究从盐地碱蓬中克隆到一个KT/HAK/KUP家族成员HAK2的同源基因SsHAK2,并对其进行生物信息学分析和表达模式分析。SsHAK2编码788个氨基酸,与不同植物的HAK2类蛋白具有较高的同源性(80%92%)。系统进化分析表明,SsHAK2属于KT/HAK/KUP家族亚族Ⅱ成员,与拟南芥AtKUP2位于同一进化分枝。实时定量qPCR分析显示,SsHAK2在盐地碱蓬的根和叶中均有高丰度表达,且叶中的表达丰度显著高于根中。SsHAK2的表达受外界不同浓度K⁺ (2.5和0.01 mmol/L)的诱导。2.5 mmol/L K⁺处理下,根和叶中SsHAK2的表达受25 mmol/L NaCl的显著诱导;0.01 mmol/L K⁺处理下,25和150 mmol/L NaCl的添加抑制根中SsHAK2的表达,却显著促进其在叶中的表达。以上研究结果表明,SsHAK2可能参与盐地碱蓬K⁺吸收及转运过程,在根和叶中发挥不同的功能。     

猪源链球菌的分离鉴定及特性

为了解猪链球菌及其血清型流行情况,对2010-2012年从河北省各地区临床病死猪分离获得的32株链球菌进行了生物学特性鉴定及血清分型。结果表明,分离的链球菌以兰氏D群为主,占34.4%,其次为C群(18.8%)。利用PCR扩增猪链球菌的种特异性16SrRNA基因以及荚膜多糖cpslI、eps2J、cps7H和eps9H基因,对32株链球菌分离株进行猪链球菌种的鉴定和分型。结果显示,属于猪链球菌的为16株,其中猪链球菌2型(SS2)为56.25%(9/16),SS7占6.25%(1/16),SS9占12.5%(2/16),其他血清型占25%(4/16)。     

镉胁迫对野燕麦幼苗生长及其生理特性的影响

为了解植物幼苗对金属镉(Cd)的反应,以野燕麦(Avena fatua)幼苗为材料,采用1/2 MS营养液水培试验,研究野燕麦幼苗对不同Cd²⁺浓度胁迫的反应积累特性。结果表明:低浓度的Cd²⁺(0.6,2,8 mg·L^-1)能够促进野燕麦幼苗生长,具体表现在促进植物株高、叶长、根长、茎粗的增加,地上、地下部分干、鲜重量的积累;高浓度Cd²⁺(15,30 mg·L^-1)抑制野燕麦幼苗生长,各项生长指标在该浓度下都显示不同程度的降低;随Cd²⁺胁迫浓度的升高,野燕麦叶片细胞膜透性、植株地上、地下部分游离脯氨酸含量大量积累;超氧化物歧化酶和过氧化物酶都呈先升后降的趋势,至Cd²⁺浓度为8 mg·L^-1时达到最大值,随后在Cd²⁺浓度为15 mg·L^-1时,表现为活性下降。表明野燕麦适用于浓度小于8 mg·L^-1 Cd²⁺污染土壤的修复。主成分分析结果表明,在第一主成分上野燕麦幼苗地下干重具有最高的载荷,说明地下干重可以很好的反映镉胁迫下野燕麦幼苗的生长状态。     

一株临床2型猪链球菌的分离鉴定及生物学特性分析

为了确定2013年9月至2013年11月江西省某规模猪场仔猪疑似发生猪链球菌病的病原菌及其毒力特性,本试验将病猪剖杀,采取脑脊液和关节液在血平板上划线进行细菌分离培养,将分离到的菌株进行生化试验、16S rDNA序列分析及基因血清分型鉴定,进一步对其进行毒力基因(gdh、orf2、fbps、sly、epf、mrp)检测和药敏性测定。结果显示,分离菌株在血平板上形成灰色"半透明"边缘整齐的有草绿色狭窄溶血环的光滑型圆形细小菌落,镜检呈散在排列的革兰氏阳性短链球菌,结合生化试验、16S rDNA序列分析及基因血清型分型,确定其病原为2型猪链球菌,命名为JMS2。毒力因子基因检测结果显示,JMS2主要毒力因子分布为gdh⁺/orf2⁺/fbps⁺/sly^-/epf^-/mrp^-,预示JMS2可能不是强毒力菌株。药敏试验结果显示,JMS2对β-内酰胺类抗生素如青霉素、阿莫西林等敏感,但对阿奇霉素、复方新诺明等细菌蛋白质合成抑制剂类抗生素耐药。本研究对临床防控猪链球菌病具有参考意义。     

一株猪链球菌8型菌株的分离鉴定及其生物学特性研究

为明确天津市某猪场保育猪疑似发生猪链球菌病的病原菌及其致病力等生物学特性,将猪场一头发病猪扑杀,无菌采集病料于哥伦比亚血琼脂平板上划线培养,对分离的疑似菌株进行形态学观察、生化试验、16S rDNA序列分析和血清型鉴定,确定分离菌株为猪链球菌8型,命名为TJS31。药敏试验结果显示,TJS31株对8种受试药物耐药,4种受试药物中介,1种受试药物敏感。致病性试验结果显示,TJS31株经腹腔接种昆明小鼠,24 h内可以引起小鼠出现精神萎靡、扎堆、呼吸急促、发抖、运动迟缓、死亡等,LD50为1.8×10⁸ CFU/mL。毒力基因检测发现TJS31的毒力基因型为sly⁺/gdh⁺/orf2⁺/gapdh⁺,不携带mrp、epf和fbps基因。研究结果丰富了我国猪链球菌病病原的生物学资料,为猪链球菌8型的防控提供了依据,也为深入开展猪链球菌8型的致病机制和耐药机理奠定了基础。     

盐胁迫对小报春生长及生理特性的影响

为探讨小报春对盐(NaCl)胁迫的抗性及适应机制,采用盆栽法研究不同浓度的NaCl(0、50、100、150、200、250 mmol·L^-1)对小报春生长发育和生理特性的影响。结果表明:1)不同浓度NaCl胁迫下,小报春的生长呈现低促高抑的现象。随着NaCl胁迫浓度的增加,植株的株高、冠幅、叶面积、地上和地下干重以及叶片含水量显著降低,相对电导率显著提高。2)NaCl胁迫后,小报春植株叶片净光合速率(P_n)、胞间CO₂浓度(C_i)、蒸腾速率(T_r)、气孔导度(G_s)、可溶性蛋白(SP)、游离脯氨酸(Pro)、可溶性糖(SS),以及超氧化物歧化酶(SOD)、过氧化物酶(POD)和过氧化氢酶(CAT)活性均随NaCl浓度增加呈现先上升后下降的变化趋势;丙二醛(MDA)含量呈持续升高趋势,说明植株的光合作用系统、细胞的渗透调节以及抗氧化酶系统对NaCl胁迫具有积极的响应策略。3)NaCl胁迫显著提高了小报春植株叶、叶柄、根中Na⁺的含量,根系中Na⁺含量的增幅最大;植株各器官中K⁺、Ca²⁺含量随着NaCl胁迫浓度增加呈现先上升后下降的趋势,且K⁺、Ca²⁺在叶片中保持较高的含量。综上所述,小报春具有一定的耐盐性,是盐渍土园林应用的潜力花卉。低浓度NaCl(50 mmol·L^-1)胁迫对其生长有促进作用,但NaCl浓度≥150 mmol·L^-1抑制其生长发育。     

天津地区猪链球菌3型菌株的致病性及耐药特性研究

试验旨在对分离自天津地区发病猪场的7株猪链球菌3型菌株（Streptococcus suis type 3,SS 3）进行致病性和耐药特性研究。应用剂量为1.0×10⁷、1.0×10⁸和1.0×10⁹ CFU/只的细菌对小鼠进行致病力研究,用PCR方法检测7株SS 3型菌株的毒力基因mrp、ef、sly、gdh、gapdh、fbps和orf2,并对这7株SS 3型菌株进行药物敏感试验。致病力试验结果显示,接种剂量为1.0×10⁹和1.0×10⁸ CFU/只时分别有6和3株SS 3型菌株可使小鼠100.0%（5/5）发病死亡,接种剂量1.0×10⁷ CFU时仍有1株SS 3型菌株可使80.0%（4/5）小鼠发病死亡,这7株SS 3型菌株对小鼠的致病力依次为R15056 > R15042=S15030 > Y12024=Y09011 > Y13125 > Y13164。毒力基因检测结果表明,共有3种毒力基因型,R12024、Y13164、R15042和S15030株为gdh、gapdh、fbps和orf2毒力基因阳性,Y13125和R15056株为sly、gdh、gapdh、fbps和orf2毒力基因阳性,Y09011株为gdh、fbps和orf2毒力基因阳性。药物敏感性试验结果显示,7株SS 3型对头孢喹肟相对最敏感,其次为阿莫西林、环丙沙星和磺胺间甲氧嘧啶钠,但对强力霉素100.0%耐药,且所有菌株均呈现3重以上的耐药性。本研究为进一步开展天津地区SS 3型流行特点及致病机理研究奠定了基础,可为天津地区SS 3型菌株的综合防控提供理论指导。     

猪链球菌2型调控因子Rex缺失株的构建及其致病性鉴定

为鉴定猪链球菌2型强毒株SS2-1调控因子Rex基因的缺失对细菌毒力的影响,本研究利用同源重组方法构建猪链球菌Rex缺失株,命名为SS2-1△Rex,并通过缺失株的生物学特性及其小鼠致病性试验进行鉴定。结果显示亲本株、缺失株及互补株在溶血能力、增殖特性和革兰染色形态无显著差异;在对小鼠致病性试验中,接种SS2-1组小鼠死亡率为87.5%,而SS2-1△Rex组死亡率为12.5%,SS2-1△Rex/p Rex对小鼠的毒力有所恢复,死亡率为50%;Log-Rank(Mantel-Cox)对数秩检验分析结果显示亲本株和缺失株对小鼠致病性存在显著差异。本研究结果表明调节因子Rex是猪链球菌2型的毒力相关因子。本实验为深入研究Rex调控毒力因子的转录和表达及其具体的机制奠定了实验基础。     

广西部分地区猪链球菌血清型及其毒力因子流行性调查分析

为探究广西部分地区猪链球菌(Streptococcus suis,SS)流行菌株主要血清型及毒力因子分布情况。本试验于2018年1月至2018年6月对从多个猪场采集到的116份疑似链球菌感染的组织病料(脑、肺脏、淋巴结等)进行病原菌检测,采用细菌分离鉴定、形态学观察及PCR扩增等方法对病原菌及其血清型和部分毒力因子进行鉴定。结果显示,116份样品共分离到链球菌32株,阳性率为27.59%(32/116),其血清型主要以SS2和SS9为主,分离率分别为40.63%(13/32)和43.75%(14/32),其他血清型为15.63%(5/32);毒力因子检测结果表明:SLY、MRP、EPF以及SBP2′因子的检出率分别为:81.25%(26/32)、59.38%(19/32)、50.00%(16/32)和71.88%(23/32)。32株链球菌中以SLY^+MRP^+EPF^+SBP2′^+(13株)、SLY^+MRP^-EPF^-SBP2′^-(5株)、SLY^+MRP^+EPF^-SBP2′^+(5株)为主要的毒力基因型,其中SS2均能检测出3个或3个以上的毒力因子。玉林、柳州市主要分布SS9型,南宁、百色市主要分布SS2型;广西不同地区毒力因子的分布情况存在差异且不同血清型或同一血清型的链球菌毒力因子的分布情况也各不相同,其中SS2携带的毒力因子检出率明显高于其他血清型。该研究可为今后猪链球菌疫苗及致病机理研究提供理论依据,为广西地区猪场链球菌血清型疫苗选择提供指导。     

结缕草ZjCSD基因的克隆及表达分析

铜锌超氧化物歧化酶是植物响应逆境胁迫过程中的关键酶,其含量和活性与植物抗逆性密切相关。本研究以结缕草cDNA为模板,利用同源克隆法,从结缕草转录组数据库中克隆获得了结缕草ZjCSD基因,该基因编码一个含有152个氨基酸的蛋白质。生物信息学分析结果显示:ZjCSD基因编码蛋白为稳定的、亲水的、酸性、非分泌脂溶蛋白,定位于细胞质中,含有CSD蛋白家族特有的保守结构域,具有典型的Cu²⁺和Zn²⁺结合位点;与小米、玉米等禾本科植物具有较高的同源性,进化关系较近。采用实时荧光定量PCR研究该基因在不同组织中、不同胁迫处理下的表达模式,结果表明,ZjCSD基因在根、茎、叶中都有表达,叶中表达量最高;干旱胁迫(30% PEG)、盐胁迫(150 mmol/L NaCl)和Cd²⁺胁迫(200 mg/L Cd²⁺)均能诱导ZjCSD基因表达量上调,Pb²⁺胁迫(1 g/L Pb²⁺)诱导ZjCSD基因表达量下调。故推测结缕草ZjCSD基因在结缕草应对干旱、盐和重金属胁迫的过程中发挥作用。     

辽宁省猪链球菌流行株主要血清型毒力因子检测及其致病性

为了解辽宁省猪链球菌流行菌株主要血清型毒力因子分布特征及致病性,依据猪链球菌属保守基因及血清型特异性基因,从辽宁地区采集猪链球菌疑似病例肺脏、肝脾、脑、关节液等样品进行猪链球菌及其血清类型鉴定;应用猪链球菌6种主要毒力因子特异性基因扩增检测方法,检测所分离到的不同血清类型猪链球菌的毒力因子分布情况,并应用小鼠攻毒试验和病理学技术对其致病性进行观察研究。结果显示:从辽宁地区采集的72个样品中共分离到23株猪链球菌,主要血清型有1,2,7型,其中SS1型4株,SS2型2株,SS7型5株。其余12株未确定血清型。SS1、SS2、SS7型阳性率分别为17.39%,8.69%,30.43%。毒力因子检测结果显示,上述6种毒力因子检出率分别为100%,66.6%,25%,16.7%,75.0%,58.3%,其中SS2均具备6种毒力因子,SS1、SS7和血清型阴性株猪链球菌均具有部分毒力因子,与SS2的差异毒力因子为epf。SS2可引起小鼠的急性败血症以及脑膜炎,SS1、SS7均可引起小鼠发病,但各器官的损伤则较轻。SS1、SS2、SS7脑内接种均可引起小鼠脑膜炎,炎症反应SS2最重,SS1次之,SS7最轻。     

广西部分地区猪链球菌血清型及其毒力因子流行性调查分析

为探究广西部分地区猪链球菌(Streptococcus suis,SS)流行菌株主要血清型及毒力因子分布情况。本试验于2018年1月至2018年6月对从多个猪场采集到的116份疑似链球菌感染的组织病料(脑、肺脏、淋巴结等)进行病原菌检测,采用细菌分离鉴定、形态学观察及PCR扩增等方法对病原菌及其血清型和部分毒力因子进行鉴定。结果显示,116份样品共分离到链球菌32株,阳性率为27.59%(32/116),其血清型主要以SS2和SS9为主,分离率分别为40.63%(13/32)和43.75%(14/32),其他血清型为15.63%(5/32);毒力因子检测结果表明:SLY、MRP、EPF以及SBP2′因子的检出率分别为:81.25%(26/32)、59.38%(19/32)、50.00%(16/32)和71.88%(23/32)。32株链球菌中以SLY~+MRP~+EPF~+SBP2′~+(13株)、SLY~+MRP~-EPF~-SBP2′~-(5株)、SLY~+MRP~+EPF~-SBP2′~+(5株)为主要的毒力基因型,其中SS2均能检测出3个或3个以上的毒力因子。玉林、柳州市主要分布SS9型,南宁、百色市主要分布SS2型;广西不同地区毒力因子的分布情况存在差异且不同血清型或同一血清型的链球菌毒力因子的分布情况也各不相同,其中SS2携带的毒力因子检出率明显高于其他血清型。该研究可为今后猪链球菌疫苗及致病机理研究提供理论依据,为广西地区猪场链球菌血清型疫苗选择提供指导。