锦鲤疱疹病毒的PCR鉴定

根据锦鲤疱疹病毒(koi herpesvirus,KHV)的基因序列合成了2对引物,对送检的发病锦鲤样品提取DNA进行PCR检测,分别扩增出KHV的胸腺嘧啶脱氧核苷激酶基因(thymidine kinase,TK)409 bp和AF411803基因序列484 bp的条带,对484 bp的PCR扩增产物经限制性内切酶TaqⅠ和AluⅠ酶切,分别得到200 bp/284 bp和185 bp/299 bp的片段,484 bp的PCR扩增产物的测序结果与GenBank上已发表的KHV序列一致。结果显示发病锦鲤为KHV阳性。     

中国林蛙真伪品的PCR鉴别

本研究根据GenBank发表的哺乳类SRY核酸序列和禽类EcoRI家族序列设计1对引物,对中国林蛙真伪品进行了PCR扩增,并对特征条带进行了克隆测序。结果表明,PCR扩增产物有明显的区别,中国林蛙、黑龙江林蛙、黑斑蛙和中华大蟾蜍分别扩增出约1000、250、450、750bp的特征条带,通过对中国林蛙1000bp条带的克隆序列进行BLAST比对分析,找到了一些禽类的WZ染色体上的相关基因片段。     

伪狂犬病病毒上海株的gI基因的克隆和序列分析

参考Genebank发表的伪狂犬病病毒（Pseudorabies Virus,PRV)的gI糖蛋白基因序列，自行设计合成一对引物，对PRV上海株（PRV－SH）进行PCR扩增，产物经琼脂糖电泳分析，呈现一条约960bp的条带，将其克隆入pGEM-T-easy载体中，并进行序列测定，与PRV Rice株gI基因比较发现，核苷酸的同源性为94．7％，氨基酸的同源性为91．3％，证实为gI基因。     

猪瘟病毒辽宁株E2蛋白部分基因片段的序列分析

应用RT-PCR方法对辽宁地区8份猪瘟临床病料进行了E2蛋白部分基因片段扩增，其中有5份病料扩增产物经2%的琼脂糖凝胶电泳获得大小约为210bp的目的基因片段。经对目的基因片段回收纯化后进行核苷酸序列测定，并与国内外发表的18株猪瘟病毒株的核苷酸序列和氨基酸序列进行同源性比较表明，所分离的5株猪瘟病毒株核苷酸序列及氨基酸序列与C1W、C2W等8个毒株的同源性较高，而与国内的疫苗株和强毒株的同源性则较低，基因型差异比较明显，并不归属于同一个基因亚群。本研究通过对E2基因片段扩增以及相应的核苷酸序列的氨基酸序列分析，揭示了本地区猪瘟病毒的分子流行病学背景。     

马冠状病毒检测试剂盒的研制

参考GenBank发表的马冠状病毒的基因序列,设计合成一对引物,对马冠状病毒进行RT-PCR扩增,产物经琼脂糖电泳分析,呈现一条约427bp的条带,并进行序列测定,与GenBank中发表的基因序列比较发现,与马冠状病毒核苷酸的同源性为98.7%,证实为马冠状病毒基因。通过对RT-PCR反应条件进行优化,研制了用RT-PCR方法检测马冠状病毒的试剂盒,该试剂盒的敏感性和特异性都较好。     

一株猪源大肠埃希氏菌卡那霉素耐药基因的研究

提取一株猪源大肠埃希氏菌卡那霉素耐药菌株E.coliBJ96147的质粒DNA进行转化，转化子能稳定表达其全部抗生素抗性，表明E.coliBJ96147对卡那霉素（K）、庆大霉（GM）、链霉素（S）、氯霉素（C）、四环素（Tc)、复方新诺明等六种抗生素的抗性由耐药性R质粒介导；根据已发表的编码卡那霉素抗性的磷酸转移酶[APH（3′）-Ⅱ]钝化酶基因的核苷酸序列，设计合成了一对引物P1和P2，用PVR技术检测其钝化酶基因，结果该引物扩增出了预期的578bp大小的PCR产物，淫限制性内切酶HindⅢ进行酶切分析，发现产物被切成二条带，与预出现的389bp及189bp二条带相符，说明PCR可用于检测猪源大肠埃希氏菌卡霉那素磷酸转移酶[APH（3′）-Ⅱ]钝化酶基因。     

新城疫病毒B95株HN蛋白基因的克隆及序列分析

根据NDVHN蛋白已知基因序列设计一对引物，以提取的澳大利亚布里斯班NDV分离株B95基因组RNA为模板，利用RT—PCR技术扩增得到一条约1．9kb的条带。将扩增产物克隆到PGEM—T—easy载体中，并对重组质粒进行酶切分析、PCR鉴定，结果证明我们得到了HN基因的阳性重组子，随后采用Sanger’s双脱氧末端终止法对阳性重组子进行核苷酸序列测定，获得该基因全长序列，并进行同源性分析。B95株与其他毒株核苷酸同源性为95．1％～87％，氨基酸同源性为96．1％～92．1％。     

应用Sry-PCR扩增鉴定狍(Capreolus capreolus)的性别

根据人的SRY基因核心序列设计合成1对引物C1、C2，应用PCR技术对野生狍(Capreolus capreolus)Sry基因(哺乳动物Y染色体DNA雄性特异区)进行扩增．结果在野生狍雄性样本扩增出1条带(221bp)．而在雌性样本未见扩增带．显示了Sry基因的性别特异性。应用这1对引物对42个未知性别狍肌肉组织样本进行了性别鉴定．结果雄性22个，雌性20个。对Sry-PCR产物克隆测序，得到185bp的Sry基因部分核苷酸序列。本试验为狍种群性别比率及其种群动态变化机制研究提供了资料。     

伪狂犬病病毒上海株gE和gI基因的克隆及序列分析

参考Genebank发表的伪犬病病毒（Pseudorabies Virus,PRV）的gI和gE基因序列，自行设计并合成了两对引物，对PRV上海株（PRV－SH）进行PCR扩增，产物经琼脂糖电泳分析，均呈现一条约960bp和1740bp的条带，将其克隆入pGEM-T-easy载体中，进行了序旬测定，将PRV－SH株的gI基因与Rice株gI基因比较发现,核苷酸的同源性为94.7%，氨基酸的同源性为91.3%，证实为gI基因，将PRV－SH gE基因序列与Ea株、Ruce株gE基因序列进行比较，结果显示，该序列与PRV Ea株、Rice株gE基因的同源性分别为98.5%、97.5%；的氨基酸序列与Ea株，Rice株和I型单纯疱疹病毒（HSV－1）17株gE的同源性分别为97.2%、94.8%和15.6%。     

鹅副黏病毒辽宁分离株HN基因的克隆与序列分析

采用RT—PCR技术对鹅副黏病毒辽宁分离株DG-01的HN基因进行了扩增，获得了1条1．8kb的特异性条带。将此扩增产物克隆至pGEM—T载体，重组克隆质粒经鉴定后进行DNA序列测定。测序结果表明，所克隆的基因片段长度为1810bp，含有1个1716bp的开放性阅读框架，编码571个氨基酸。核苷酸同源性分析表明：DG-01株与我国其他9株鹅副黏病毒的同源性为89．9％～95．1％；与国内外NDVHN基因的同源性为82．1％～95．2％，与国内标准强毒F48E9的同源性为84．79／6，与Taiwan95和NL／96株的同源性分别为94．1％和95．2％。     

西尼罗病毒套式RT-PCR检测方法的建立

从GenBank上调取西尼罗病毒的基因序列,经过分析,设计并合成2套套式RT-PCR引物,分别对西尼罗病毒灭活苗进行扩增,结果扩增出与目的片段大小一致的条带,将其克隆入pMD18-T-Vector中,进行序列测定,证实为WNV的基因。建立了套式RT-PCR检测方法,经各反应条件的优化后,发现2套nest-PCR引物能分别扩增出85个拷贝和62个拷贝的双链DNA,对乙型脑炎病毒、黄热病毒等11种病毒核酸进行扩增,发现具有良好的特异性,显示建立套式RT-PCR具有高效、快速、特异、灵敏的特点,可用于口岸WNV的检测和监测。     

猪瘟病毒石门株在ST细胞连续传代后E0基因变异分析

为了解猪瘟病毒(CSFV)石门(Shimen)株连续传代后变异情况,根据已发表的CSFV E0基因序列(AF092448.2),设计合成引物,以在ST细胞中连续传代培养的CSFV石门株细胞毒总RNA为模板,每5代通过RT-PCR方法扩增病毒的E0基因,测定其核苷酸序列和氨基酸序列,用DNA Star软件分析比较原代、5代、10代、15代、20代、25代接毒细胞中CSFV E0基因的变异性。结果显示,接种病毒第10代的病毒E0基因在630核苷酸位点出现变异,第15代病毒在632核苷酸位点出现变异。本研究通过分子生物学方法发现CSFV Shimen株在ST细胞连续传代过程中E0基因能保持遗传的稳定性。     

West Nile virus infection in reindeer (Rangifer tarandus).

West Nile virus (WNV) infection in 4 reindeer (Rangifer tarandus) resulted in lymphohistiocytic encephalomyelitis within the medulla oblongata and cervical spinal cord. Immunohistochemistry revealed WNV antigen within neurons and among mononuclear cell infiltrates. These represent the first known cases of clinical WNV infection in Cervidae. Clinical signs and lesions were similar to those described in horses. Nucleotide sequence of a 768-bp region of the WNV E-glycoprotein gene revealed 1 nucleotide mutation, which resulted in a single amino acid substitution from a serine to a glycine (position 227 of E-glycoprotein) when compared with the prototype WNV-NY99 strain (isolated from Bronx zoo flamingo 382-99).     

野鸭源H6N2亚型禽流感NS基因的克隆及序列分析

根据GenBank上已发表的H6N2亚型的非结构蛋白基因（NS）序列,设计一对特异性引物,成功从本实验室分离、保存的H6N2禽流感病毒分离株A／Mallard／SanJiang/151／06（H6N2）中克隆到NS基因序列。该克隆基因全长860bp,编码NS1和NS2两种非结构蛋白,与其他H6N2亚型的NS基因进行同源性比较,同源性为71．1％～97．2％,推导的氨基酸序列同源性为62．0％～94．6％。     

鹅副粘病毒F蛋白基因的克隆和序列分析

鹅副粘病毒分离株ＹＧ９７经１０日龄鸡胚增殖后纯化,提取病毒的基因组ＲＮＡ,采用ＲＴ－ＰＣＲ一次性扩增出与预期设计的１．７ｋｂ大小相符的特异性条带。将扩增产物提纯后克隆入ｐＣＥＭ＾Ｒ载体,经转化、筛选及酶切鉴定后,初步获得了含鹅副粘病毒Ｆ基因的阳性克隆。将所获得的阳性重组质粒进一步进行了序列鉴定。序列分析表明扩增的Ｆ基因片段的长度为１６９５ｂｐ,共编码５３３个氨基酸,Ｆ蛋白裂解位点的氨基酸顺序为＾１１２Ｒ－Ｒ－Ｑ－Ｋ－Ｐ－Ｆ＾１１７,与ＮＤＶ强毒株特征相符,同时也与鹅副粘病毒分离株致病性实验结果相符,同源性分析表明,与国内标准强毒株Ｆ４８Ｅ９的核苷酸同源性为８６％,与国内外其它毒株的核苷酸同源性在８２％～８９％之间,表明该毒株相对于经典的ＮＤＶ在Ｆ片段上发生了较大的变异。     

鸭Ⅰ型禽副粘病毒YH99V株HN基因的克隆和序列分析

在浙江地区进行鸭病病因的调查过程中，从患病鸭群中分离到一株引起鸭产蛋锐减而不死亡的病毒，经鉴定该病毒属于禽副粘病毒Ⅰ型，命名为YH99V株。以YH99V株的基因组RNA为模板，通过RT—PCR一步法扩增出其HN基因的cDNA片段，然后将其克隆至pMD18-T载体中，对其进行序列测定。测序后拼接出HN基因的序列长度为1785bp，该基因的ORF总长为1734bp，编码577个氨基酸。将YH99V株HN基因序列和推导的氨基酸序列与新城疫毒株的HN基因相应序列比较后发现，它们的核苷酸序列同源性分别在82．1％～99．7％，氨基酸序列同源性为87．2％～99．5％。在同源性比较的基础上，进一步绘制了Ⅰ型禽副粘病毒株HN基因的系统发育树。这对于Ⅰ型禽副粘病毒毒力基因的功能分析和该病的分子流行病调查有着重要的意义。     

牦牛病毒性腹泻病毒E 1基因的克隆及生物信息学分析

参考GenBank中发表的BVDV毒株的基因组序列设计2对引物,利用套式RT-PCR方法首次成功克隆牦牛体内分离鉴定出的牛病毒性腹泻病毒E 1基因,并扩增出预期的585 bp目的片段。将扩增产物克隆至pMD18-T Vector,经质粒PCR鉴定及酶切鉴定获得阳性重组质粒并进行测序。测序结果经BLAST同源性比较分析,克隆得到的E 1基因与Osloss株同源性最高,但核苷酸同源性仅为73.3%,推导氨基酸同源性仅为82.6%,表明牦牛病毒性腹泻病毒存在较大的基因突变。这可能是该病毒为适应牦牛这种特有生物体和牦牛所生活的高原生态环境的结果,或该病毒也可能具有独立的遗传衍化来源。     

猪瘟病毒E2基因的扩增及序列分析

本研究利用RT—PCR技术，对流行于国内部分地区的9株猪瘟病毒（CSFV）E2基因进行扩增，与C-株等4株参考毒株做了同源性比较，绘制了遗传进化关系发生树，结果表明，所测序列共由442个氮基酸残基组成。可将13株CSFV分为两个组群，其E2基因间的核苷酸序列同源性为81．9％～99．7％，所推导氨基酸序列同源性为88．2％～99．5％，其中9株CSFVE2基因的长度均为1324bp，编码的氨基酸序列均包括完整信号肽序列和跨膜区序列，9株流行毒株与C-株之间核苷酸序列同源性为81．9％～95．3％。所推导氨基酸序列同源性为88．2％～95．5％。说明近期流行毒株的变异呈现一定的多样性，并且多数毒株已向远离疫菌株方向变异。     

新疆地区蚊类携带西尼罗病毒情况调查研究

为查明新疆地区蚊体内携带西尼罗病毒的情况,从2005年-2007年每年的7月~10月采集新疆不同地区的蚊子共计16000余只,并提取总RNA,通过RT-nest PCR的方法检测样品中西尼罗病毒。结果表明,调查样品中没有检测到西尼罗病毒,但不能就此推测新疆是否存在西尼罗病毒,至少对新疆地区和全国制定针对不同动物和人的积极防御政策有重要的公共卫生学意义。