牛结核分枝杆菌Mce4E蛋白对牛肺泡巨噬细胞iNOs、TNF-α、IL-6和IL-12表达的影响

探讨Mce4E蛋白在牛结核分枝杆菌致病机理中的作用。以Mce4E蛋白刺激肺泡巨噬细胞24和48h后,MTT检测分析表明,Mce4E蛋白对巨噬细胞的活性有显著的抑制作用(P<0.05);用重组表达的Mce4E蛋白、人分枝杆菌纯化蛋白衍生物(Purified Protein Derivative of M.tuberculosis,MtbPPD)、牛结核分枝杆菌纯化蛋白衍生物(Purified Protein Derivative of M.bovis,MbPPD)、卡介苗(Bacille Calmette Guerin,BCG)和刀豆蛋白A(con-canavalin A,ConA)分别刺激肺泡巨噬细胞48h后,real-time PCR方法检测显示,Mce4E蛋白能够促使牛肺泡巨噬细胞TNF-α和IL-6 mRNA的表达上调(P<0.05)、抑制肺泡巨噬细胞iNO的mRNA表达(P<0.05)而对IL-12表达没有影响(P>0.05)。Mce4蛋白能够促使肺泡巨噬细胞分泌炎性细胞因子,并对肺泡巨噬细胞有抑制作用,证实Mce4蛋白在分枝杆菌中具有重要的作用。     

旋毛虫钙网蛋白对小鼠巨噬细胞和大鼠PBMC免疫功能的影响

[目的]本文旨在研究旋毛虫钙网蛋白(TsCRT)对宿主免疫系统的影响。[方法]将原核表达纯化的重组旋毛虫钙网蛋白(rTsCRT))进行Western Blot验证;将rTsCRT与小鼠巨噬细胞共孵育,检测该蛋白对小鼠巨噬细胞增殖、NO释放和凋亡的影响;将rTsCRT与大鼠外周血单核细胞(PBMC)共孵育,检测该蛋白对大鼠PBMC转录因子和细胞因子的影响。[结果]Western blot结果显示,rTsCRT可以被感染旋毛虫的大鼠血清所识别;rTsCRT可促进小鼠巨噬细胞的增殖和NO的分泌,抑制小鼠巨噬细胞的凋亡;rTsCRT下调大鼠PBMC转录因子T-bet、Gata-3和PU.1的转录水平,上调Foxp3、Ahr、RORγt和Bcl-6的转录水平;rTsCRT上调大鼠PBMC细胞因子IFN-γ、IL-17、IL-10、TGF-β、Il-9和IL-22的转录水平,下调IL-4和IL-21的转录水平。[结论]旋毛虫钙网蛋白可刺激宿主产生Th1、Th17、Treg、Th9和Th22等多种类型的免疫反应,抑制Th2和Tfh免疫,对宿主免疫调节作用复杂。     

甘草NRAMP基因家族的鉴定和生物信息学分析

为研究甘草自然抗性相关巨噬细胞蛋白(NRAMP)家族成员的结构和功能,利用生物信息学方法,从甘草全基因组数据库中筛选并鉴定甘草NRAMP家族基因序列,并对该家族成员做进化分析、基因结构分析、保守结构域和保守基序分析、二级结构和三维结构分析。结果显示,从甘草基因组中共鉴定出11个NRAMP基因家族成员,通过进化分析发现,亲缘关系近的NRAMP家族成员基因结构和保守基序都更为相似,甘草和大豆的NRAMP家族成员间亲缘关系更接近。甘草大部分NRAMP家族成员的氨基酸数量差异不大,介于300～549个,且亚细胞定位在细胞膜上,而2个分子质量较大的成员GurNRAMP7和GurNRAMP8亚细胞定位在叶绿体上,各个成员的跨膜结构数量不尽相同。各个基因在染色体上的分布较为分散,只有NRAMP9、NRAMP10、NRAMP11定位在同一条染色体上。α-螺旋是甘草NRAMP家族成员中最主要的二级结构,但各个成员含有的α-螺旋数量不完全一样。     

鮰爱德华氏菌的红色荧光蛋白标记及其应用

为研究鮰爱德华氏菌与宿主的相互作用关系,本研究构建带有红色荧光蛋白基因的pM DmC herry表达载体,通过电击转化法将载体成功导入鮰爱德华氏菌zbl141菌株中,获得了红色荧光蛋白标记的鮰爱德华氏菌菌株。在倒置荧光显微镜下观察,重组鮰爱德华氏菌显示特异性红色荧光。稳定性检测结果表明,标记菌株传至28代,重组质粒稳定率仍为100%。用标记菌株感染斑马鱼仔鱼后,能在激光共聚焦显微镜下实时观察到细菌在鱼体内的分布情况;标记菌株体外感染小鼠巨噬细胞后,也能观察到病原菌与巨噬细胞的相互作用情况。说明标记菌株具有良好的特异性和可视性,为鮰爱德华氏菌对宿主的致病性研究提供了一种良好的生物材料。     

烟草自然抗性相关巨噬细胞蛋白基因家族的鉴定与分析

自然抗性相关巨噬细胞蛋白(natural resistance associated macrophage proteins,NRAMPs)是一类高度保守的二价金属跨膜转运蛋白,在调控生物体内重金属稳态中发挥着重要作用.为了探究烟草NRAMP基因的多样性,该研究根据烟草基因组数据信息,利用生物信息学方法对烟草NRAMP基因家族成员进行了鉴定,对其基本信息、结构特点、蛋白理化性质及保守序列、启动子元件和组织表达模式等进行了分析.结果表明:烟草基因组含有9个NtNRAMP基因,分别命名为NtNRAMP1.1～6.2,其编码氨基酸长度为500～542 aa,蛋白分子量为54.31～59.11 kD,等电点为5.09～8.73,总平均亲水性为0.475～0.604;除了NRAMP6.1和6.2不含有motif4外,其余NRAMP蛋白都含有motif1～motif10.顺式作用元件分析表明所有NtNRAMP基因启动子中均含有参与基因转录、非生物胁迫、植物激素响应和光应答途径的元件,部分基因含有生物胁迫、次生代谢、组织表达和结合位点的元件.染色体定位发现,6个NtNRAMP基因分别分布在5条烟草染色体上.表达分析表明:NtNRAMP基因组织表达模式差异较大,其中NtNRAMP6.1和NtNRAMP6.2基因表达具有组织特异性.该研究结果为进一步研究烟草NtNRAMP基因的功能奠定了基础.     

LBP基因沉默对LPS诱导水牛单核巨噬细胞炎症相关基因表达的影响

为了探讨抑制脂多糖结合蛋白(LBP)基因表达对水牛单核巨噬细胞在内毒素(LPS)诱导下炎症相关基因的表达,首先采用三质粒慢病毒包装系统包装LBP基因shRNA重组质粒pSicoR-GFP-shLBP774.利用病毒颗粒感染水牛单核巨噬细胞,进行荧光定量qRT-PCR及ELISA检测.结果显示,单核巨噬细胞在用5×108 IU/mL滴度的LBP-shRNA774慢病毒颗粒,感染指数(MOI)为300、感染7d的条件下,感染效率超过50%.qRT-PCR检测结果显示,与LPS对照组相比,shLBP774感染组可极显著抑制LBP基因的表达(p0.01),CD14,TLR4,TNF-α,IL-1β,IL-8等基因表达显著降低(p0.05).ELISA检测结果发现,与对照组相比,细胞分泌的TNF-α,IL-1β蛋白量显著降低(p0.05).以上结果表明,抑制LBP基因表达可以有效降低LPS诱导下单核巨噬细胞炎症相关基因的表达,进而调控LPS引发的炎症反应,提示可将LBP作为靶基因深入研究水牛单核巨噬细胞免疫功能和LPS致炎信号传导分子机制.     

巨噬细胞在肿瘤发展中的作用研究进展

巨噬细胞在机体的非特异免疫功能中发挥着重要的作用。在肿瘤发生初期,来自健康组织的巨噬细胞活化后可以抑制肿瘤细胞的生长,但是在肿瘤恶化阶段。来自瘤体内部的巨噬细胞却促进肿瘤细胞的生长。细菌细胞壁成分和细胞因子可以活化巨噬细胞,活化的巨噬细胞可以高效、专一地杀伤肿瘤细胞,包括对药物有抗性的肿瘤细胞,而对正常细胞的损伤却很少,这是免疫调节剂的优势所在。因此,充分研究巨噬细胞在肿瘤发生中的具体作用,对增强巨噬细胞对肿瘤细胞的杀伤作用,克服TAM的消极作用,开发高效低毒的药物很有必要。对巨噬细胞活化的因素与机理、巨噬细胞对肿瘤细胞生长的抑制以及肿瘤相关巨噬细胞的作用进行了综述。     

水牛肺泡巨噬细胞的分离、培养及鉴定

为了深入研究水牛巨噬细胞（Macrophage,Mφ）的生物学特性,探索一种简便的水牛肺泡巨噬细胞（Alveolarmacrophage,AM）分离、培养方法,采用肺气管冷PBS灌洗法分离获得水牛肺泡细胞,并进行鉴定和功能检测。结果表明,采用肺气管冷PBS灌洗法可获得大量贴壁细胞,经光学显微镜和电子显微镜观察,其形态具备巨噬细胞的典型特征;酸性磷酸酶和非特异性酯酶阳性率分别为（89.4±3.5）%和（83.6±3.4）%;细胞表面抗原MHCⅡ阳性率为（96.6±1.3）%;鸡红细胞吞噬率为（23.6±4.2）%,墨汁吞噬率为（92.3±0.6）%。可见,肺气管冷PBS灌洗法是一种获取水牛肺泡巨噬细胞的可行方法。     

猪肺泡巨噬细胞的分离、纯化和冷冻保存研究

通过冷PBS气管灌洗法分离猪肺泡巨噬细胞(porcine alveolar macrophages,PAM),优化了PAM的纯化和冷冻保存方法,并进行了PAM纯度鉴定、细胞吞噬功能和存活率检测.结果表明:RPMI-1640培养液比DMEM培养液更适于PAM的培养和冷冻保存;巨噬细胞抗体MAC387免疫荧光检测表明,贴壁2h后更换培养液获得的PAM纯度最高(P＜0.05);用70％ RPMI-1640+20％新生牛血清+10％ DMSO的体系冷冻保存细胞密度为1×107个/mL的PAM可获得高达98.09％的存活率,冻存前后PAM的墨汁吞噬率无显著差异(P＞0.05).     

急性冠状动脉综合征患者血浆M-CSF水平的检测及临床意义

目的 :观察急性冠状动脉综合征 (ACS)患者发病后各时间段血浆的巨噬细胞集落因子 (M- CSF)水平的变化及其临床意义。方法 :随机选择 ACS患者和健康成人各 30例 ,采用 ELISA法检测 ACS患者发病后第 1、2、3、7、1 4天血浆中的 M- CSF、肿瘤坏死因子α(TNF-α)和 C-反应蛋白 (CRP)的水平 ,同时检测 30例健康成人的 M- CSF、CRP和 TNF-α作为对照。结果 :ACS患者发病后第 1、2天血清M- CSF、CRP和 TNF- α的水平均较对照组高 (P<0 .0 1 ) ;但 ACS患者血清 CRP和 TNF- α的水平只在发病初期 (1～ 3d)增高 ,而 M- CSF在整个急性炎症过程中均显著增高 (P<0 .0 1 )。结论 :M- CSF是反映炎症过程的敏感指标 ,检测 M- CSF有助于临床医生判断 ACS急性炎症过程是否结束 ,对 ACS的诊断、治疗和预后具有重要的临床价值。     

HLA-G1的基因表达、纯化及其活性分析

在获得HLA-G1cDNA克隆序列的基础上,构建了pGEX-4T2-HLA-G1原核表达载体,对HLA-G1的诱导表达发现,融合蛋白以包涵体形式存在于表达菌中。进一步溶解包涵体,改善复性条件,最终获得高纯度的GST/HLA-G1融和蛋白。51Gr释放试验表明,纯化的HLA-G1具有抑制NK细胞对靶细胞的杀伤活性。     

五谷杂粮营养丰

玉米富含植物性蛋白、脂肪、糖类、纤维素、无机盐以及多种维生素、大量的亚油酸、谷胱甘肽。谷胱甘肽氧化物含有硒，硒为保持人体健康不可或缺的元素。玉米中镁元素也较多，它可与体内的维生素A协同作用，阻抑癌组织发展；玉米中的木质素可使人体免疫细胞的巨噬细胞的活性提升2至3倍，能强化吞噬病毒或细菌毒力的作用。     

禽大肠杆菌O2、O78及其耐药、融合菌株的外膜蛋白免疫研究

为了研究大肠杆菌O2、O78及其耐药、融合菌株外膜蛋白的免疫原性,用Sarkosyl处理和超速离心技术相结合的方法分别提取禽大肠杆菌强毒株O2、O78,耐药弱毒株O2(Nor^rChl^s)、O78(Not^sChl^r)及其融合双价弱毒株O2.78(Nor^rCll^r)等5个菌株的外膜蛋白(OMPs),经SDS-PAGE,结果均出现1条相同的相对分子质量在31000-43000之间的主要OMPs条带,表明5个菌株存在相同的OMPs成分,将3个耐药菌株的OMPs分别免疫小白鼠和鸡,结果均产生对O2、O78良好的同源及交叉免疫保护效果,用各耐药菌株的OMPs做包被抗原,ELISA方法都能交叉检测3个耐药菌株OMPs免疫鸡血清中IgG水平,且各IgG的消长曲线基本一致。     

粘虫卵子发生的组织化学研究——I、DNA、RNA、蛋白卵黄的动态

用组织化学方法研究了粘虫卵子发生各时期中卵巢内核酸、卵黄蛋白的动态。滋养细胞与卵细胞的核均为多倍体,其DNA含量随生长而增加。卵核迁至卵的边缘后不久,DNA即解聚而表现为Feulgen阴性。滋养细胞的核及发育早期的卵细胞核内都有核仁排出。观察四个滋养细胞,其活动期间仅以RNA供应給卵,未见其他成分经细胞间桥进入卵内。蛋白、磷脂与解聚状态的DNA均在滋养细胞最后被卵吸收时方始入卵。蛋白卵黄粒为中性粘多糖,其前体来自卵包上皮,与蛋白卵黄的主要区别在于它为PAS阴性,且不含半胱氨酸或甲硫氨酸,故認为蛋白卵黄一部份原料由卵包细胞供应,另一部份由卵直接以胞飲方式自血淋巴中吸收。     

小麦条锈菌效应蛋白原核表达、纯化及其溶解性研究

将3个小麦条锈菌效应蛋白基因pst-1374、pst-1178和pst-8713,构建原核表达载体pET-32a-PPpst-1374、pET-22b-pst-1178/8713,并将其转入大肠杆菌BL21(DE3),重组阳性克隆经IPTG诱导表达和SDS-PAGE检测。结果表明:效应蛋白pst-1374和pst-8713正确表达且分子质量与理论值一致,而pst-1178基因表达后可能是以多聚体的形式存在,采用镍柱亲和层析、HPLC和离子交换柱进行纯化,获得可溶性的效应蛋白。     

牛IgG2 Fc受体的真核表达、纯化与结晶

【目的】制备牛IgG2 Fc受体(boFcγ2R)蛋白并分析其结构与生物学功能,为进一步研究其免疫学功能奠定基础。【方法】PCR扩增boFcγ2R的胞外区基因片段,将其克隆至真核表达载体pMT/BiP/V5-His A构建重组pMT/BiP-boFcγ2R-His质粒,利用果蝇胚胎Drosophila Schneider 2(S2)细胞表达boFcγ2R胞外区重组蛋白,通过镍柱亲和层析、凝胶过滤层析对目的蛋白进行纯化,利用Dot-blot验证其生物学功能;采用蒸汽扩散坐滴法对目的蛋白进行结晶,对晶体进行X-ray衍射分析;利用去糖基化酶Endo Hf和PNGase F对目的蛋白进行处理,以验证其糖基化修饰与晶体无衍射之间是否存在因果关系。【结果】PCR扩增获得了663 bp的boFcγ2R基因胞外区片段。成功构建了pMT/BiP-boFcγ2R-His载体,将其转染S2细胞后诱导表达出26 ku的boFcγ2R胞外区重组蛋白。SDS-PAGE结果显示,通过镍柱亲和层析、凝胶过滤层析的纯化方法得到了高纯度的boFcγ2R胞外区重组蛋白;Dot-blot结果显示,该蛋白具有较好的生物学功能。蛋白结晶的2个条件是:体积分数15%Tacsimate~(TM)(pH 7.0)、0.1 mol/L HEPES (pH 7.0)、20 g/L PEG 3350和0.1 mol/L HEPES (pH 7.5)、250 g/L PEG 3350。蛋白初筛晶体无衍射,去糖基化试验验证了boFcγ2R胞外区蛋白初筛晶体无衍射可能与其糖基化有关的推测。【结论】得到了高纯度的boFcγ2R胞外区重组蛋白,获得其初筛晶体。     

绿色荧光蛋白在大肠杆菌中的表达条件优化、纯化及鉴定

为了将绿色荧光蛋白(GFP)引入大肠杆菌中表达并且进行蛋白的纯化,以提高GFP在大肠杆菌中的表达量,用于传统检测方法的改进及目的菌的应用研究.将人工重组质粒转入大肠杆菌BL21(DE3),研究大肠杆菌菌株在温度、诱导时间以及诱导剂IPTG浓度等不同条件对HIS-GFP融合蛋白表达量的影响.结果:大肠杆菌菌株BL21(DE3)在37℃培养下,D600为0.6～0.8,使用终浓度为0.5 mmol/L的IPTG在15℃诱导培养12 h时,HIS-GFP融合蛋白表达量最高,表达的HIS-GFP融合蛋白可占细菌总蛋白的40％以上.用Ni-IDA亲和层析柱对HIS-GFP融合蛋白进行纯化,SDS-PAGE分析表明HIS-GFP融合蛋白大小约为68 ku,与预计的分子量大小一致,Western blotting分析表明其能与Anti-HIS单克隆抗体起特异性反应.     

口蹄疫病毒3ABC、3AB、3BC基因克隆、表达及其抗体消长规律的研究

 成功克隆了FMDV太保毒株3ABC全基因片段,并将ABC、3AB、3BC片段插入pGEX-4T-1表达载体构建了重组表达质粒,经Western blotting 分析表明,表达的3ABC、3AB蛋白与FMDV阳性血清有反应性,表达的3BC蛋白反应性差。以纯化的3ABC、3AB表达蛋白为抗原建立间接ELISA方法,对背景清楚的试验牛血清进行检测。结果3ABC、3AB表达蛋白与空白对照组(C组)、灭活疫苗反复免疫组(CI组)和部分免疫后攻毒组(I组)牛血清均不发生反应,与未免疫直接攻毒组(D组)和部分I组血清均     

杨树KT、HAK、KUP基因家族鉴定及钾肥处理对杨树生长的影响

KT、HAK、KUP基因家族是植物进行K⁺转运的最大蛋白系统。以毛果杨(Populus trichocarpa Torr.&Gray)全基因组数据为基础,利用生物信息学方法对杨树KT、HAK、KUP家族进行了全基因组鉴定,并在毛果杨全基因组中鉴定出20个KT、HAK、KUP家族成员。理化性质预测分析表明：KT、HAK、KUP基因家族成员均为疏水性蛋白,等电点在5.30～9.16;亚细胞定位预测显示家族成员蛋白集中在细胞质膜上。应用拟南芥和杨树构建系统进化树显示,KT、HAK、KUP基因家族可分为5个亚家族。基因结构及基序(motif)分析表明,KT、HAK、KUP基因进化过程相对保守。顺式作用元件分析表明,KT、HAK、KUP基因家族成员含有诸多与激素、逆境胁迫的响应元件。杨树不同钾离子浓度处理下,植株的净生长情况呈现了显著的差异,说明钾元素对杨树生长影响较大。     

大豆花叶病毒东北3号株系NIb蛋白表达、纯化及单克隆抗体制备

本研究利用PCR方法从大豆花叶病毒阳性叶片中成功克隆出大豆花叶病毒东北3号株系nib基因。序列分析表明,大豆花叶病毒东北3号株系与Ar33株系亲缘关系最近,序列同源性高达99.48%,其次为WS160、G4、G2、L株系,同源性分别为98.97%、94.88%、90.95%、90.35%,与6202-2、6067-1株系亲缘关系最远,分别为83.82%、84%;利用大肠杆菌中表达NIb蛋白,并通过亲和层析获得纯化的NIb蛋白,将纯化的NIb蛋白免疫小鼠,制备了2G3、1D6、6F9和6B2共4株NIb蛋白单克隆抗体,为大豆花叶病毒基因nib的功能研究及抗病育种提供材料。