荧光定量PCR作为猪瘟兔化弱毒疫苗效价检验 替代方法的研究与应用

【目的】建立一种快速、敏感、特异的检测猪瘟兔化弱毒疫苗（HCLV）的荧光定量PCR方法(FQ-PCR),为猪瘟兔化弱毒疫苗的效力检验提供一替代方法。【方法】在猪瘟兔化弱毒疫苗基因组3′非编码区设计一对针对猪瘟兔化弱毒株的特异性引物和一条MGB探针,并进行反应体系及反应条件优化,以及特异性、灵敏度、稳定性及符合性试验。将此方法用于部分批次疫苗厂疫苗半成品的定量检验,与兔热反应进行比较,寻求两方法的相关性。【结果】试验结果证实,CT值与模板之间呈现良好的相关性,相关系数为0.9998,扩增效率为101.14%;该方法仅扩增HCLV,不扩增HCLV以外的其它病原,显示良好的特异性;具有较高的灵敏度,能检测模板中4.35个cDNA拷贝量,比CSFV-RT-nPCR高1个数量级。将此方法应用于4个厂家17个批次的34份猪瘟兔化弱毒疫苗效力检验,两只兔子均无热反应（不合格）样品共11份,FQ-PCR CT值为21.15—27.30;两只兔子一只呈现定型热,一只无热反应的样品12份,CT值为17.47—23.70;两只兔子都呈现定型热或者一只呈现定型热一只呈现轻热反应（合格品）样品共11份,CT值为17.10—20.8。【结论】建立的HCLV-FQ-PCR方法能特异性的检测疫苗核酸含量,与家兔热反应测定结果存在良好的相关性,可以用于猪瘟疫苗半成品中HCLV定量检测。     

酷暑对兔体温和猪瘟定型热比率的影响

选用无猪瘟抗体原料兔作试验,研究酷暑对兔体温变化及注射猪瘟兔化弱毒脾淋乳浆液后产生定型热比率的影响。结果表明,当兔体周围气温达38℃时,100%的兔体温超过41℃;当环境温度达35.5℃时,100%的兔体温超过40℃。这些试验兔群表现出不同程度的中暑症状。发生中暑的试验兔群,在22℃的GMP生产动物房内饲养3 d后,每只注射含4 000个发热单位的猪瘟兔化弱毒脾淋乳浆液,5个试验组所产生的定型热比率分别为47%、65%、73%、54%、63%;而饲养于17~25℃舒适气温中的无猪瘟抗体兔群,转移到22℃的GMP生产动物房,注射相同病毒量后,产生定型热比率为98%、96%。上述结果表明在猪瘟兔化弱毒脾淋疫苗生产中,GMP生产动物房必须给兔子提供最舒适的室温,原料兔在生产后期和运输过程中也应避免中暑。但中暑过的试验兔,若能产生定型热,其脾淋毒价仍符合制造活疫苗的要求。     

不同水质对猪瘟病毒在犊牛睾丸细胞上复制的影响

为了探讨水质对猪瘟兔化弱毒培养增殖影响。采用不同地域的水制备的注射用水，在其他条件相同的条件下，用犊牛睾丸细胞培养增殖猪瘟兔化弱毒，其结果是培养增殖的猪瘟兔化弱毒的病毒含量有显著的差异，这就为培养增殖猪瘟兔化弱毒用水提供技术参考。     

猪瘟病毒强毒株和兔化弱毒疫苗株RT-PCR快速鉴别检测方法的建立

【目的】建立猪瘟病毒强毒株和兔化弱毒疫苗株的RT-PCR快速鉴别检测方法。【方法】根据Gen-Bank中36株猪瘟病毒(CSFV)强毒株和兔化弱毒疫苗株的基因序列,分别设计了针对CSFV强毒和兔化弱毒疫苗株的特异性引物,建立了一种能区分CSFV强毒和兔化弱毒疫苗株的RT-PCR检测方法。【结果】建立的RT-PCR检测方法可以从CSFV强毒株和兔化弱毒疫苗株中分别扩增出大小为187和492 bp的特异性片段,对猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)、猪圆环病毒2型(PCV2)和猪传染性胃肠炎病毒(TGEV)等猪源性病毒的检测结果均为阴性,说明该方法具有较好的特异性。对10份疑似猪瘟临床样品进行检测后发现,利用该方法可以从中分别检测出CSFV强毒和疫苗毒。【结论】建立了可鉴别检测CSFV强毒株和弱毒疫苗株的RT-PCR方法,为猪瘟的早期诊断及疫苗免疫猪和野毒感染猪的鉴别提供了技术参考。     

春季前后猪瘟免疫“十”要点

一、要使用猪瘟兔化弱毒单苗疫苗包括猪瘟兔化弱毒犊牛睾丸细胞苗和猪瘟兔化弱毒兔脾淋组织苗,不要使用猪瘟—猪丹毒—猪肺疫＂三联苗＂防猪瘟。重要的是用猪瘟单苗防好猪瘟,猪丹毒可以不防。在怀疑有猪肺疫的猪场,可用猪巴氏杆菌A型及B型（E0630）单苗联用,且应于猪瘟单苗免疫间隔7天后使用。另外,对猪瘟单苗的选择也有讲究,最好能选用两个不同知名品牌的产品,这叫双保险。     

50年中国农业科技成就（四）

（九）畜禽疫病防治５０年代初期，研制出安全有效的牛瘟兔化、山羊化弱毒疫苗，猪瘟兔化、绵羊化弱毒疫苗，仅用６年的时间，就消灭了牛瘟、猪瘟。１９７６年，在联合国粮农组织和西欧经济共同体召开的会议上，一致认为中国的猪瘟兔化弱毒疫苗为控制和消灭欧洲的猪瘟起了重要作用。１９６８—１９８３年，研制成功的马传染性贫血病弱毒疫苗是国际兽医科学的创举。据１９８２年底统计，全国１３个省、市、自治区已免疫注射２００万匹马次，使这种毁灭性病毒病已基本得到控制。研制出的牛肺疫兔化弱毒菌苗和兔化绵羊化适应菌苗综合防治措施，…     

猪瘟兔化弱毒苗在免疫猪体内动态分布研究

研究猪瘟兔化弱毒苗在免疫猪体内的动态分布,在注射猪瘟兔化弱毒苗后第1、7、14、21、28、35、63天采集免疫猪的脾、肾、肺、腹股沟淋巴结、扁桃体及血清,应用免疫组化、RT-PCR、猪瘟抗原、抗体检测试剂盒等方法,检测分析猪瘟病毒在猪体内的动态分布、存留时间及抗体水平。结果表明:应用免疫组化方法于免疫后第7~14天在脾脏、第7~21天在腹股沟淋巴结、第14~28天在肾脏组织分别检测到猪瘟病毒。在免疫后第7天检测到猪瘟病毒抗体,随后抗体水平持续上升至免疫后第63天;病毒抗原的分布与RT-PCR检测结果吻合。结论:猪瘟兔化弱毒苗在猪体内主要分布器官为脾、肾和腹股沟淋巴结,免疫后第7天脾和腹股沟淋巴结最早检测到猪瘟病毒,猪瘟病毒在肾停留时间可至免疫后第28天。实验过程中未在扁桃体、肺、外周血检测到猪瘟病毒。     

常见猪疫苗怎么用

一、猪瘟、猪丹毒、猪肺疫三联活疫苗该疫苗是采用猪瘟兔化弱毒株接种乳兔或敏感细胞,收获含毒乳兔组织或细胞培养病毒液,以适当比例和猪丹毒弱毒苗液及猪肺疫弱毒菌液混合,加入优选保护剂,充分振荡,混合均匀,经冷冻干燥制成。用于猪瘟、猪丹毒和猪肺疫的免疫预防,猪瘟免疫期为     

猪瘟兔化弱毒荧光定量PCR检测方法的建立及初步应用

【目的】建立一种能够实际应用于猪瘟兔化弱毒疫苗中猪瘟病毒含量检测的荧光定量PCR方法。【方法】根据GenBank中登录号为AF091507的猪瘟病毒(CSFV)兔化弱毒株的全长基因组序列,在其5′非编码区设计2对特异性引物(标准品引物、定量引物)和1条探针(qPCR-P),通过标准品引物进行RT-PCR扩增及T7 RNA聚合酶体外转录构建标准品RNA。对荧光定量PCR方法的各项条件进行优化,建立猪瘟兔化弱毒荧光定量PCR检测方法,并采用该法对成品猪瘟兔化弱毒疫苗中的病毒含量进行检测。【结果】成功构建了体外转录的标准品RNA,建立了检测猪瘟兔化弱毒的荧光定量PCR方法。该方法检测灵敏度可达10拷贝/μL,比RT-nPCR方法的灵敏度高出1个数量级;该法对标准品RNA检测的线性范围为1.0×108~1.0×102拷贝/μL。对1.0×108,1.0×106,1.0×103拷贝/μL 3种稀释度的标准品RNA进行重复性试验,批内变异系数分别为0.54%,0.52%和0.39%;批间变异系数分别为1.47%,1.85%和1.01%,具有良好的可重复性。应用该方法对不同厂家猪瘟兔化弱毒疫苗中的病毒含量进行测定,可知同一厂家脾淋苗中的病毒含量比细胞苗高出1~2个数量级,而不同厂家同一类型疫苗中病毒含量也有差异,其中脾淋苗差异不大,而细胞苗间的差异较大,最高可达27.2倍。【结论】建立的猪瘟兔化弱毒荧光定量PCR方法,具有敏感性高、特异性强、重复性好的特点,为实际工作中对猪瘟兔化弱毒疫苗的质量监控提供了重要的技术支撑。     

常见猪疫苗怎么用

一、猪瘟、猪丹毒、猪肺疫三联活疫苗 该疫苗是采用猪瘟兔化弱毒株接种乳兔或敏感细胞,收获含毒乳兔组织或细胞培养病毒液,以适当比例和猪丹毒弱毒苗液及猪肺疫弱毒菌液混合,加入优选保护剂,充分振荡,混合均匀,经冷冻干燥制成.用于猪瘟、猪丹毒和猪肺疫的免疫预防.猪瘟免疫期为1年,猪丹毒和猪肺疫免疫期为6个月.     

仔猪乳前攻击猪瘟强毒免疫试验

仔猪乳前猪瘟免疫,经前一阶段试验证实,在仔猪生后即行猪瘟兔化弱毒苗注射,间隔0.5,1.5,3.5,4.5小时后令其吸吮初乳,饲养155天行兔体中和抗体测定,0.5小时组5头猪的血清对10只家兔有90%(9/10)获得中和.为进一步验证其免疫效果,应用石门系猪瘟强毒进行攻击试验.     

抗猪瘟高免卵黄抗体的制备

猪瘟是由猪瘟病毒引起的一种急性、热性、高度接触性传染病。近年来,在养猪生产中尽管普遍对猪群用猪瘟兔化弱毒苗进行免疫接种,但免疫失败的现象时有发生,给养猪业造成了很大的经济损失。为了找到一个治疗猪瘟的经济有效方法,我们进行了抗猪瘟高免卵黄的制备。1材料与方法1·1试验动物186日龄罗曼商品蛋鸡,杜洛克仔猪均由郑州牧业工程高等专科学校微生物学教研室提供。1·2疫苗及毒株猪瘟兔化弱毒苗购自农业部郑州生物药品厂;石门系猪瘟强毒购自中国兽药监察所。1·3免疫方法1·3·1基础免疫对罗曼商品蛋鸡进行免疫,第一次每羽肌注猪瘟兔化…     

猪瘟兔化弱毒绵羊羔肾细胞培养疫苗的试验研究

猪瘟兔化弱毒(简称兔化弱毒)疫苗是我国的重要兽医生物药品之一。过去制备疫苗需要大量的动物,原料来源困难。改用仔猪肾细胞培养物制备猪瘟疫苗以后,曾在生产中取得了明显的经济效益,但因仔猪有感染猪瘟病毒的危险,而且目前的检验手段尚不完善,稍有疏忽就会造成严重经济损失。为此,急需进行猪瘟的非猪源细胞培养疫苗的研究。     

猪瘟母源抗体对猪瘟ST传代细胞源疫苗免疫效果的影响

正通过近几年对朝阳地区部分养猪场和散户的猪群疫病流行病学调查发现,病死猪中因猪瘟引起直接死亡或猪瘟感染并发其他疫病引起间接死亡的病例占总死亡数的21%左右,对本地区的养猪业造成非常大经济损失。朝阳地区目前使用的猪瘟疫苗有猪瘟兔化弱毒脾淋苗、猪瘟兔化弱毒组织苗、猪瘟ST传代细胞源苗等,其中ST苗应用最多,该疫苗有良好的安全性,应用于猪体免疫非常安全,并且疫苗的免疫效果高出原有的牛睾丸源代细胞苗近20倍。实验室免     

猪瘟流行新特点与防治对策（上）

猪瘟是猪的一种烈性传染病。其特征为发病急，高热稽留和细小血管壁变性，引起全身泛发性小点出血，脾梗死。随着我国猪瘟免化弱毒疫苗研制成功和使用，猪瘟流行程度得到有效控制，有的国家使用猪瘟兔化弱毒苗消灭了猪瘟，但猪瘟在我国仍然存在，有的地方甚至很严重。并且其流行也表现出一此新特点[第一段]     

诊断猪瘟病的理想试剂——抗猪瘟病毒单克隆抗体

<正> 目前,我国普遍应用猪瘟兔化弱毒苗,因而绝大多数猪的体液内都含有特异性抗体,也就无法应用检查特异性抗体的办法来诊断猪瘟病。近年来,应用猪瘟病毒高免血清标记荧光素诊断新技术,比传统的动物实验、血清学鉴定方法发展了一步。但由于受到同属病毒交叉反应的影响,仍然有相当程度的假阳性,如猪瘟荧光抗体对牛腹泻病毒(称BVDV)、猪瘟兔化弱毒均呈阳性反应. 能够认别单一抗原决定簇的单克隆抗体的出现和应用,解决了这一难题。现将荷兰     

应用猪瘟荧光抗体对猪瘟自然病例的诊断

在用自制的猪瘟荧光抗体检查猪瘟强毒人工感染猪取得圆满结果的基础上,进行了检查猪瘟自然病例的研究,并以部分自然病例的病料进行猪瘟兔体交互免疫试验,证实该荧光抗体为一种特异性强、检出率高的制品。另外确定,猪只在接种兔化猪瘟弱毒疫苗12天后,其病料即不再对猪瘟荧光抗体诊断产生干扰现象。     

ELISA法检测猪瘟抗体消长规律的试验研究

本试验采用间接ELISA方法,对猪瘟（CSF）常规免疫的仔猪CSF抗体水平进行检测。试验分A、B两组,A组首免注射4头份猪瘟兔化弱毒疫苗,B组首免注射2头份猪瘟兔化弱毒疫苗;二免两组均注射2头份猪瘟兔化弱毒疫苗。试验结果表明,注射疫苗后10d,开始产生抗体,20~30d抗体达到峰值,二免后抗体峰值维持40d以上。首免4头份的仔猪比首免2头份的仔猪CSF抗体峰值出现的早,维持的时间长。     

鉴别猪瘟强毒和弱毒的反转录-复合套式聚合酶链式反应(RT-nPCR)检测方法的建立

[目的]建立一种能区分猪瘟病毒（classical swine fever，CSFV）强毒和弱毒的反转录-复合套式聚合酶链式反应（RT-nPCR）检测方法。[方法]根据GenBank上登录的现有CSFV基因组全序列，选择高度保守区设计了一对CSFV通用引物，并在该对引物跨越区域的内部设计了猪瘟兔化弱毒疫苗和强毒特异性引物，建立了一种能区分猪瘟强毒和弱毒的RT-nPCR鉴别诊断方法。[结果]应用该方法从猪瘟兔化弱毒疫苗和石门强毒株基因组中扩增出了大小分别为447和343bp的一条特异性片段，从两种病毒基因组混合物中扩增出了大小为447和343bp的两条特异性片段，但对牛病毒性腹泻病毒和其它常见猪源病毒细胞培养物以及正常细胞基因组进行检测时均为阴性。该方法可以检测出0．04pg的CSFV RNA。对从黑龙江省采集的15份疑似猪瘟病料进行了检测，结果表明，有14份类似猪瘟强毒，1份类似弱毒疫苗。限制性片段长度多态性和种系发生分析证实了RT-nPCR的检测结果。[结论]本研究建立的RT-nPCR可以有效区分猪瘟强毒和弱毒，减少了未感染的免疫猪被误杀的可能性。     

猪瘟病毒石门株E2基因序列分析

经非猪瘟免疫猪增殖猪瘟病毒石门株,从抗凝血中直接提取病毒RNA进行RT-PCR,获得了猪瘟病毒石门株E2基因片段。克隆后测序,结果表明石门株的E2囊膜糖蛋白与国外报道的5株猪瘟病毒的E2囊膜糖蛋白具有相同的骨架结构,即均具有15个半胱氨酸残基和5个潜在糖基化位点,此外石门株也具有保守序列RYLASLH。同源性比较表明,石门株与日本的ALD株和GPE#+-株同源性最高,而与欧洲的Alfort株同源性最低。与国内的疫苗种毒（482代）、疫苗毒以及国外使用的中国猪瘟兔化弱毒株同源性比较表明,石门株与种毒(482代)同源性最高,其次为国外使用的中国猪瘟兔化弱毒株,而与国内使用的疫苗毒同源性最低。本研究提示国内疫苗毒的E2基因在生产中有较大变异,可能导致抗原漂移。