IgM型单克隆抗体之scFv库的建立与筛选

从一个抗脂磷酸聚糖IgM型单克隆抗体细胞的mRNA中经RT-PCR克隆重链可变区(VH)和轻链可变区(VL),然后将VH、Linker和VL连接成scFv,并克隆到载体pCANTAB-5E,转Escherichia coliTG1感受态细胞,构建了单链抗体库。通过辅助噬菌体M13KO7感染后,使单链抗体展示在噬菌体衣壳蛋白pIII的N端,得到噬菌体展示的抗体库。将抗体库用于"淘洗—富集—扩增"3轮以后,得到针对脂磷酸聚糖特异性的噬菌体抗体。测序结果表明,该scFv的VH基因序列全长390 bp,编码127个氨基酸;VL基因序列全长341 bp,编码113个氨基酸。二者均符合小鼠免疫球蛋白可变区基因特征,含有4个框架区(FR)、3个抗原互补决定区(CDR)及抗体特征性的2个半胱氨酸残基。     

IBV单链抗体的筛选及其互补决定区序列变异分析

【目的】筛选能表达鸡传染性支气管炎病毒(IBV)单链抗体(scFv)的原核阳性克隆,并分析scFv抗原结合位点的氨基酸变化。【方法】采用RT-PCR,从IBV疫苗免疫的鸡脾脏RNA中扩增出抗体编码基因的重链可变区(VH)和轻链可变区(VL)基因。利用重组链延伸反应(SOE-PCR),将linker与VH和VL基因相连构建鸡scFv基因,并将其克隆到原核表达载体pOPE101-XP中,构建重组质粒并转入大肠杆菌表达,间接ELISA筛选原核表达的抗IBVscFv的阳性克隆,对其测序后进行Clustal.W多序列比较,分析scFv骨架区(FR)和互补决定区(CDR)氨基酸序列差异。【结果】筛选到表达IBVscFv的阳性克隆ZL.10和ZL.80;将它们的氨基酸序列与鸡胚系Gemline进行多序列比较,结果显示,ZL.10、ZL.80在CDR中易变异氨基酸占各区氨基酸的比率均在40%以上,其中VH的CDR3达90%,VL的CDR3达60%。此外,ZL.10、ZL.80在VH的CDR3区分别增加5个和7个氨基酸。FR氨基酸变异率较少,且大多均在12%以下,而FR4未发生突变。【结论】通过体外筛选原核表达产物的方法,获得了表达IBVscFv的阳性克隆ZL.10和ZL.80,其VH、VL氨基酸序列中的变异主要发生在各自的CDR,二者VH的CDR3氨基酸序列差异很大,提示这2个scFv阳性克隆针对的是IBV不同的抗原位点。     

抗利巴韦林单链抗体基因构建及其结构分析

【目的】克隆构建利巴韦林(RBV)单链抗体(scFv)基因,对其理化特性进行分析并对蛋白质结构进行模拟,为后期检测方法的建立及分子改造提供参考依据。【方法】以分泌利巴韦林抗体的杂交瘤细胞株总RNA为模板,通过RT-PCR技术扩增抗体的重链可变区(VH)和轻链可变区(VL),然后以柔性连接短肽(Gly_4Ser)_3为接头拼接完整的scFv-RBV。利用生物信息学方法对scFv-RBV的理化性质及蛋白结构功能进行预测分析。【结果】构建的scFv基因编码240个氨基酸,相对分子质量为26 162.27 Da,理论等电点(pI)为8.57。在二级结构中,β-折叠(39.17%)和无规卷曲(45.41%)占主导地位,α-螺旋(5.42%)和β-转角(10%)相对较少。在三级结构中,VH和VL区域被Linker相互牵拉靠近,形成典型的口袋样形状的空间构象,符合单链抗体的结构特征,理论上可以与RBV抗原特异性结合。【结论】成功构建scFv-RBV基因,并利用生物信息学方法预测分析scFv的二级、三级结构,该结果可为后期进行单链抗体的表达、纯化及定向进化提供理论支撑。     

抗猪瘟病毒单链抗体基因的构建及其推导的蛋白质三级结构的分子模拟

为利用抗猪瘟病毒(Classical swine fever virus,CSFV)单链抗体基因(ScFv)建立CSFV病原快速检测方法,以抗猪瘟病毒单克隆抗体杂交瘤细胞株总RNA为模板,通过RT-PCR扩增重链可变区基因(VH)和轻链可变区基因(VL),以柔性多肽(Gly4Ser)3为接头(Linker),经重叠延伸反应将VH、VL基因拼接为完整的CSFV-ScFv基因,并进行克隆、测序分析。结果显示,所克隆单链抗体基因全长732 bp,包括363 bp的VH、45 bp的Linker和324 bp的VL,为VH-Linker-VL结构,编码的氨基酸序列含有明确的互补决定区(CDR)和框架区(FR)以及特征性的半胱氨酸残基,并与多种鼠源单链抗体基因高度同源,具有重组功能性鼠源抗体可变区特征。对CSFV-ScFv基因所编码蛋白质三级结构进行预测,显示其形成口袋样形状的空间构象,理论上具有良好的抗原结合活性。表明本研究成功构建了CSFV-ScFv基因。     

磺胺二甲氧嘧啶免疫小鼠抗体重链可变区基因的克隆及序列分析

应用RT-PCR方法从磺胺二甲氧嘧啶免疫小鼠B细胞扩增和克隆抗SDM抗体VH基因。测序结果表明:抗SDM抗体VH基因为339 bp,编码113个氨基酸。用NCBI GenBank分析表明,抗SDM抗体VH基因符合小鼠抗体重链可变区特征,隶属于小鼠抗体重链SM7家族,由胚系基因VHSM7.a3.93-DSP2.9-JH1功能性重排形成。抗SDM抗体VH基因的克隆为抗SDM单链抗体的构建与表达奠定了基础。     

抗O型口蹄疫病毒单克隆抗体轻链可变区的克隆及序列分析

应用分子生物学技术,从分泌抗O型口蹄疫病毒单克隆抗体的杂交瘤细胞9F12中提取总RNA,经反转录,PCR扩增及克隆,得到VL基因。序列测定结果表明,9F12的VL基因为336 bp,可编码112个氨基酸。用NCBI GenBank分析表明,VL基因符合小鼠抗体可变区特征,为功能性重排的抗体可变区基因。根据Kabat分类体系,9F12的VL基因片段隶属于抗体κ轻链20家族。9F12的VL基因的克隆为抗O型口蹄疫病毒单链抗体的构建与表达奠定了基础。     

木薯ETR1基因克隆及表达分析

[目的]克隆木薯乙烯受体基因(MeETR1)并检测其在木薯采后生理性变质(PPD)过程中的表达情况,为研究ETR基因家族在木薯PPD过程中的功能作用提供参考依据.[方法]以木薯品种华南8号为材料,应用PCR扩增MeETR1基因编码区(CDS)序列,采用生物信息学分析方法对其编码蛋白的理化性质、亲/疏水性、保守结构域及二、三级结构等进行预测分析,通过亚细胞定位确定MeETR1蛋白在植物细胞中的表达分布,并利用实时荧光定量PCR检测MeETR1基因在木薯采后PPD过程的表达情况.[结果]克隆获得MeETR1基因CDS序列全长2220 bp,共编码739个氨基酸,蛋白分子量为82.88 kD,理论等电点(pI)为6.76;MeETR1基因编码蛋白属于疏水蛋白,含有ETR1家族4个典型模块,即GAF结构域、HisKA结构域、HATPase_c结构域和REC结构域;其二级结构中α-螺旋占47.43%、延伸链占14.46%、无规则卷曲占38.11%.MeETR1氨基酸序列(XP_021625986.1)与同属大戟科的蓖麻(Ricinus communis)ETR1氨基酸序列(XP_002533252.1)相似性为92.42%,亲缘关系较近;MeETR1蛋白定位在细胞质中.与0 h(PPD前)相比,MeETR1基因的相对表达量在木薯采后PPD过程中(12、24、48和96 h)均呈显著下降趋势(P<0.05),即MeETR1基因表达受木薯采后PPD过程的抑制.[结论]MeETR1基因编码蛋白含有GAF、HisKA、HATPase_c和REC等4个典型的结构域,与其他植物ETR1在生物学功能上具有一致性;MeETR1基因表达在木薯采后PPD过程中受抑制,可能在此过程中发挥负调控作用.     

特异性抗IBDV单链抗体基因的构建及序列分析

从抗 IBDV杂交瘤细胞系 SJS中分离总 RNA,经 RT-PCR体外扩增重、轻链可变区基因 ,通过一连接肽 (Giy4 Ser) 3基因拚接形成 Sc Fv基因 ,经 IBDV抗原亲和筛选出特异性阳性克隆进行核苷酸序列测定及氨基酸序列推导。所获得的特异性抗 IBDV单链抗体基因为 VH-Linker-VL 结构 ,其含有编码 (Giy4 Ser) 3的连接肽基因及维持抗体结构所必须的半胱氨酸残基 ,编码产物具有与亲本抗体相同的抗原结合活性和特异性 ,从而为研制具有应用潜力的高表达工程化抗体奠定了基础。     

抗磺胺二甲嘧啶单链抗体基因的克隆与序列分析

采用RT-PCR方法成功克隆出抗磺胺二甲嘧啶（SM2）单抗的杂交瘤细胞中396 bp的VH和339 bp的VL可变区基因,再通过重叠延伸PCR方法,由引入的（Gly4Ser）3柔性肽体外组装抗717bp的SM2-ScFv基因。测序经NCBI Blast比较分析和Expasy预测分析。结果表明：所得ScFv具有重组功能性鼠抗体可变区基因的特征,单链抗体的结构符合抗体可变区的功能区的框架区和可变区的结构特点,是抗磺胺二甲嘧啶的可变区基因,且经lingker连接后为影响轻重链的结构。     

高羊茅FaGST1基因克隆、亚细胞定位及表达分析

[目的]克隆高羊茅谷胱甘肽-S-转移酶(GST)基因FaGST1,并进行亚细胞定位及表达分析,为深入研究该基因的抗逆分子调控提供理论依据.[方法]采用RT-PCR和RACE从高羊茅黔草1号中克隆FaGST1基因,对其进行生物信息学分析,构建植物融合表达载体pCAMBIA1300-FaGST1-GFP,通过农杆菌介导转入烟草叶片表皮细胞,观察FaGST1基因亚细胞定位情况,并利用实时荧光定量PCR检测高盐、高温、干旱及低氮胁迫处理下高羊茅叶片中该基因的表达情况.[结果]克隆获得FaGST1基因cDNA全长序列为1003 bp,开放阅读框(ORF)为681 bp,编码227个氨基酸残基,其编码蛋白的分子量约25.60 kD,理论等电点(pI)为5.58,亲水指数平均值-0.342,不稳定系数32.96,为稳定的亲水蛋白,定位于细胞核.FaGST1蛋白二级结构中,α-螺旋占50.44%,β-转角占5.75%,无规则卷曲占30.54%,延伸链占13.27%.FaGST1蛋白的保守结构区域为含有G位点的N末端结构域和含有H位点的C末端结构域.FaGST1蛋白与黑麦草GST蛋白(AMY26594.1)的氨基酸序列相似性最高,为93%,其次是海滨雀稗GST蛋白(AMN87043.1),为91%,与玉米(ACG39365.1)和小米(KQK86785.1)GST蛋白氨基酸序列相似性均在80%以上,与系统发育进化树分析结果基本相符,即FaGST1蛋白与黑麦草、海滨雀稗、玉米和小米等禾本科植物GST蛋白亲缘关系较近.高羊茅FaGST1基因在干旱、高温、高盐胁迫和低氮胁迫处理下均出现抑制表达.[结论]FaGST1基因负向调控高羊茅逆境胁迫响应.     

抗红斑丹毒丝菌的rSpaA蛋白猪源单链抗体库构建及单链抗体淘选

从免疫过rSpaA的猪的脾淋巴细胞中提取总RNA,采用RT–PCR技术反转录合成cDNA。设计兼并引物扩增抗体重链可变区(VH)和轻链可变区(VL)基因片段,采用重叠延伸PCR方法,将VH和VL通过Linker连接成重组单链抗体(以下简写为sc Fv)的基因片段。将sc Fv的基因连接至噬菌粒载体p Comb3Xss,将重组载体电转化至宿主菌XL1-Blue,并经辅助噬菌体M13KO7拯救,获得猪源噬菌体单链抗体库,库容约为2.5×106。以rSpaA为靶抗原,经免疫亲和筛选,获得8株特异性较好的阳性克隆。本研究结果可为制备抗红斑丹毒丝菌的重组sc Fv提供新途径,并为猪丹毒的免疫检测和综合防制提供材料基础。     

抗玉米赤霉烯酮毒素单链抗体-碱性磷酸酶融合蛋白的表达

根据抗玉米赤霉烯酮毒素单链抗体的氨基酸序列及大肠杆菌偏爱密码子,用重叠延伸PCR法合成了单链抗体的重链和轻链,经（Gly4Ser）2Linker连接,获得完整的单链抗体基因ZEN2 scFv。将ZEN2 scFv与碱性磷酸酶（AP）编码序列连接形成融合蛋白基因ZEN2 scFv-AP,构建到pET载体,转化大肠杆菌菌株BL21（DE3）,经IPTG诱导表达及亲和层析纯化,在SDS-PAGE和Western blot分析中均检测到1条分子质量为75 ku的可溶性蛋白条带,ELISA分析证实,细菌表达的ZEN2 scFv-AP融合蛋白具有碱性磷酸酶活性。这一研究结果为建立快速、灵敏、经济的玉米赤霉烯酮毒素的ELISA检测奠定了基础。     

抗犬细小病毒单链抗体库构建及其亲和力检测

为获得高亲和力抗犬细小病毒单链抗体,构建抗犬细小病毒(CPV)细菌展示单链抗体文库。研究提取犬脾脏总RNA,反转录c DNA,以此为模板,分别扩增犬抗体VH和VL编码序列,插入克隆载体p Tlinker。利用SfiⅠ酶切位点将sc Fv基因构建至细菌展示载体p BSD中,将重组质粒电转化入E.coli DH5α构建p BFD-sc Fv细菌展示库。通过标记FITC的VP2蛋白,利用流式细胞术筛选12株阳性sc Fv。将12株sc Fv基因分别插入p ET-28a,构建重组表达质粒p ET28a-sc Fv。转化到E.coli Rosetta中诱导表达,获得约28 ku目的蛋白。经ELISA检测,纯化sc Fv对VP2蛋白P/N值均大于2.1,其中sc Fv-23、sc Fv-33、sc Fv-34对VP2蛋白亲和力较强。研究通过免疫本动物源动物,在获得高价抗体同时,避免传统单克隆抗体的免疫排斥现象;结合流式细胞术和细菌展示技术可对单链抗体文库高效、快速筛选。抗犬细小病毒同源单链抗体研究在填补市场同源基因工程抗体空白的同时,可为研制具有中和活性全长抗体奠定基础。     

梨苯丙氨酸解氨酶基因的生物信息学分析

[目的]对梨苯丙氨酸解氨酶(PAL)的基因进行生物信息学分析。[方法]以梨的苯丙氨酸解氨酶基因为研究对象,运用生物信息学方法对其编码的蛋白质结构、理化性质及功能结构域进行分析。[结果]梨pal基因的全长编码区序列(Coding sequences,CDS)长2 160 bp,编码720个氨基酸;序列比对结果显示,梨的pal基因与葡萄、树莓、甜樱桃、烟草、毛果杨、柠檬、水稻pal基因的同源性分别为86%、90%、94%、85%、88%、88%和73%;系统进化分析结果显示,梨pal基因与甜樱桃的进化关系最为密切;梨苯丙氨酸解氨酶定位于细胞基质,二级结构以随机卷曲和α-螺旋为主要构件,三维建模成功。[结论]为今后研究PAL和梨木质素合成的分子机理提供了一定的理论参考。     

抗堆型艾美耳球虫子孢子单链抗体的构建及表达

应用RT-PCR技术,从稳定分泌抗堆型艾美耳球虫子孢子抗原的单克隆抗体(McAb)的杂交瘤细胞Easp-3G3中扩增出抗体VH和VL基因,通过在VH和VL可变区基因之间引入连接肽(Gly4Ser)3,体外构建抗堆型艾美耳球虫的单链抗体基因,并将其克隆至表达载体pET28a( )载体中进行表达,用Ni-NTA的金属亲和层析法进行纯化,通过SDS-PAGE和ELISA测定其纯度和生物学活性.电泳结果分析表明重组蛋白的相对分子量为32kDa,纯度为94%;ELISA反应结果证明该单链抗体保持了单克隆抗体的生物学特性,并能与堆型艾美耳球虫子孢子抗原发生特异性反应.     

新疆野生盘羊TLR9基因的克隆·序列分析及其编码氨基酸结构预测

[目的]克隆鉴定新疆天山亚种野生盘羊Toll样受体9（TLR9）基因,预测其结构与功能,并对序列进行分析。[方法]以外周血液的总DNA为模板,运用PCR方法分3段克隆了新疆野生盘羊TLR9基因,PCR产物经凝胶回收纯化后测序,并运用分子生物学软件将测序结果进行分析及结构预测。[结果]克隆得到的新疆野生盘羊TLR9基因大小是3 192 bp,含1个完整的开放阅读框（ORF）,共编码1 064个氨基酸,其氨基酸组成中亮氨酸的含量高达18.51%,含有30个氨基酸的信号肽序列;在野生盘羊TLR9蛋白455～4757、40～760和780～800位氨基酸有3个跨膜区;新疆野生盘羊TLR9蛋白的3D结构是由胞外段富含亮氨酸的重复序列（LRR）和胞内段TIL（Toll/IL IR）结构域构成的。[结论]上述结构特征为TLR9发挥生物学功能奠定了基础,同时也为进一步研究新疆野生盘羊TLR9基因提供了理论依据。     

番茄脯氨酸脱氢酶基因的克隆与RNAi植物表达载体的构建

[目的]克隆了脯氨酸脱氢酶ProDH基因的全长cDNA,构建了ProDH基因的RNA干扰植物表达载体,并转化到农杆菌.[方法]以“耐运2000番茄”幼苗为试材,根据GenBan中公布的番茄脯氨酸脱氢酶ProDH基因的序列信息设计了一对特异性引物,克隆了该基因的全长cDNA,分析基因序列选择正反向片段并扩增,并通过酶切、连接的方法构建了ProDH基因的RNA干扰植物表达载体PBI121-PDHi利用冻融法将表达载体转化到农杆菌EHA105中.[结果]所克隆到的ProDH基因片段长2 001 bp,其中CDS为1 491 bp,编码380个氨基酸.测序结果与公布序列同源性100％,因此可以用来构建干扰载体;通过酶切与测序鉴定,证明表达载体构建成功.[结论]经特异性引物扩增检测,证明表达载体已转入农杆菌,为进一步的研究该基因奠定了基础.     

刺五加ATP合酶β亚基基因的克隆与序列分析

[目的]克隆刺五加叶绿体的ATP合酶β亚基cDNA并对其进行生物信息学分析。[方法]根据已知物种叶绿体ATP合酶β亚基基因的序列,设计1对同源引物,通过RT-PCR扩增得到刺五加ATP合酶β亚基cDNA,并对其进行序列比对及结构预测分析。[结果]RT-PCR扩增获得了长1 099 bp的刺五加ATP合酶β亚基cDNA,该基因编码366个氨基酸。序列比对及结构预测分析表明,刺五加ATP合酶β亚基基因编码的氨基酸与水稻的同源性最高,达96.41%。其二级结构中含有171个α螺旋(alpha helix),占46.72%;53个延伸链(extended strand),占14.48%;27个β折叠(beta turn),占7.38%;115个无规则蜷曲(random coil),占31.42%。第262～271位氨基酸为ATP合酶β亚基的标志性位点。整个多肽链无明显的疏水区域,初步认定为亲水性蛋白。[结论]该试验克隆得到的ATP合酶β亚基基因为叶绿体ATP合酶β亚基基因,为研究刺五加能量代谢对植物次生代谢的影响及了解植物ATP合酶的结构与功能提供了必要的信息。