东北地区水稻、小麦和玉米镰孢菌鉴定与ZEN毒素检测

在黑龙江、吉林和辽宁三省的13个市县,水稻、小麦和玉米的主要产区共分离到214株镰孢菌株,其中分离频率最高的是禾谷镰孢菌(58.1%)。镰孢菌株产生玉米赤霉烯酮(ZEN),具有较强生物毒性,对人畜有很强的毒害作用,因此检测作物中玉米赤霉烯酮含量是十分必要的。单克隆抗体进行特异性分析结果显示,抗-ZEN单克隆抗体与ZEN、α-玉米赤霉醇、β-玉米赤霉醇和β-玉米赤霉烯醇结合率分别为100%、188.7%、43.9%和25.6%,而与脱氧雪腐镰刀菌烯醇和黄曲霉毒素的结合率则均小于1.0%,由此证明试验制备的单克隆抗体具有较高特异性。以该单抗为依据建立的ELISA检测法,检测限为0.4 ng/m L,检测区间为0.4~25.00 ng/m L,曲线回归方程y=-0.7673x+3.1318,与相似毒素的交叉反应率均小于1.0%,回收率在79%~112%之间。用ELISA产毒能范围在0.27~1.61μg/L,其中有6株禾谷镰孢菌(Fusarium graminearum)菌株具有产毒能力。研究结果说明建立的间接竞争ELISA方法可以用于检测玉米赤霉烯酮。     

抗玉米赤霉烯酮单克隆抗体的制备

为建立快速、简单、灵敏、有效的玉米赤霉烯酮的检测方法,将玉米赤霉烯酮与羧甲氧基胺半盐酸盐反应,合成半抗原ZEN-oxime,通过活泼酯法将半抗原与载体蛋白偶联制备玉米赤霉烯酮人工抗原,以人工抗原ZENBSA免疫BALB/C小鼠,取该鼠脾细胞与SP 2/0鼠骨髓瘤细胞融合,经筛选和克隆,得到了1株能稳定分泌抗玉米赤霉烯酮抗体的单克隆细胞株3D10。3D10的抗体类型及亚类均为IgM,其轻链为Kappa链。制备的单克隆抗体腹水通过间接酶联免疫吸附测定,效价在1×10-6以上。该单克隆抗体对玉米赤霉烯酮的IC50为225 ng/ml,除与玉米赤霉烯酮结构类似物有一定的交叉反应外,与其他参试真菌毒素均无交叉反应。所制备的单克隆抗体可用于玉米赤霉烯酮毒素初筛和定性检测。     

玉米赤酶烯酮降解酶优化表达的应用

为提高ZEN降解酶的表达量,通过利用PCR法从具有玉米赤酶烯酮降解酶序列的载体中扩增玉米赤酶烯酮降解酶基因的手段,构建黑曲霉表达载体pSZHG-ZEN和带有黑曲霉内源高表达融合蛋白阿魏酸酯酶faeA基因的载体pSZHG-faeA-ZEN。结果表明:酶活检测结果显示载体pSZHG-ZEN以及pSZHG-faz分泌表达的最高发酵酶活为383.77U·mL~(-1)和1 378.33U·mL~(-1),表明构建的融合蛋白表达载体具有更高的活力。     

利用PicoGreen作为检测探针建立基于核酸适配体识别的玉米赤霉烯酮快速检测方法

玉米赤霉烯酮(ZEN)是一种能对动物和人类产生毒性的真菌毒素。研发灵敏而准确的玉米赤霉烯酮快速检测技术对于保障食品动物安全至关重要。该研究以PicoGree荧光染料为检测探针,利用其仅与dsDNA结合后才发出荧光的特性(激发波长:480nm,发射波长:520nm),当ZEN不存在时,适配体能够与其互补链结合而形成dsDNA,导致荧光强度增强;当ZEN存在时,适配体与ZEN结合而不能形成dsDNA,导致荧光强度减弱。建立了一种基于核酸适配体识别的ZEN快速检测方法。灵敏度试验表明:该方法的最低检测限为0.1μg/L(0.1ppb),线性范围为0.1~1μg/L(0.1~1ppb)。检测时间可以控制在40min内。特异性试验结果表明:ZEN核酸适配体与桔青毒素(CTN)、赭曲霉毒素A(OTA)、黄曲霉毒素B_1(AFB_1)和伏马毒素B_1(FB_1)等真菌毒素不会出现交叉反应。本研究与传统的基于抗体识别的ELISA快检方法进行比较,Kappa值为0.805,表明二者一致性相当。由于核酸适配体价廉,检测时间短,因此本文开发的ZEN检测方法较常用的ELISA方法更具有推广和应用价值。     

重组抗LMP1单链抗体/鱼精蛋白截短体融合蛋白的基因构建及表达

目的体外拼装人抗EB病毒编码的潜伏膜蛋白1单链抗体(LMP1 scFv)/截断的鱼精蛋白截短体(truncatedprotamine,tP)融合基因,将其克隆至原核表达载体pET32a,并在大肠杆菌中诱导表达LMP1 scFv/tP融合蛋白。方法设计融合基因LMP1 scFv/tP,在LMP1 scFv/tP的5’和3’端设计EcoRⅠ和HindⅢ酶切位点;在DNAWORKS程序指导下设计成22个相互互补的寡核苷酸序列,经PCR扩增获得融合基因LMP1 scFv/tP,再将目的基因片段亚克隆至pMD 18-Tsi mple载体中,经过酶切鉴定和测序验证。进一步将目的基因片段克隆至原核表达载体pET32a,在大肠杆菌中诱导表达融合蛋白并经SDS-PAGE和western blot验证。结果各寡核苷酸片段经PCR扩增后可见明确的产物带,将获得的LMP1 scFv/tP融合基因构建至原核表达载体pET32a,经IPTG诱导后成功表达目的蛋白。结论成功获得LMP1 scFv/tp融合基因,并在大肠杆菌中成功诱导表达LMP1 scFv/tP融合蛋白,为该融合蛋白用于LMP1相关肿瘤的基因治疗奠定基础。     

基于结构类似物的交叉反应性制备高灵敏度 玉米赤霉醇单克隆抗体

【目的】获取高灵敏度的玉米赤霉醇（zearalanol,ZAL）单克隆抗体,为提高玉米赤霉醇免疫学检测方法灵敏度研究奠定基础。【方法】利用ZAL的结构类似物玉米赤霉酮（zearalanone, ZAN）制备人工完全抗原。肟化改造ZAN得到ZAN-O;碳二亚胺（EDC）法把ZAN-O分别连接到牛血清白蛋白（BSA）和卵清蛋白（OVA）上制备出ZAN-O-BSA和ZAN-O-OVA。ZAN-O-BSA免疫小鼠,免疫剂量为50 μg蛋白/只鼠。选取血清效价高、灵敏度好的小鼠进行细胞融合。阳性杂交瘤筛选过程中,利用ZAL替代ZAN作为阻断剂,筛选能分泌抗ZAL单克隆抗体的杂交瘤细胞。体内诱生腹水法来批量制备ZAL单抗,并对单抗的免疫学性能进行了鉴定。【结果】通过细胞融合,阳性杂交瘤筛选得到了1株能分泌抗ZAL单克隆抗体的杂交瘤细胞,命名为12B10A7,其分泌的ZAL单抗灵敏度(半数抑制浓度, IC₅₀)为577 pg?mL ^-1,亲和力常数Ka=6.21×10 ⁷L?mol ^-1,与结构类似物β-玉米赤霉醇（β-zearalanol, β-ZAL）、α-玉米赤霉烯醇（α-zearalenol, α-ZEL）、β-玉米赤霉烯醇（β-zearalenol, β-ZEL）、玉米赤霉酮、玉米赤霉烯酮（zearalenone, ZEN）分别有43.06%、15.51%、15.22%、77.65%及9.79%的交叉反应率,而与其他霉菌毒素及载体蛋白交叉反应率均<0.06%。【结论】基于抗体交叉反应特性,利用ZAN制备人工抗原,得到了ZAL的单克隆抗体,所制备的单克隆抗体亲和力高,灵敏度好,特异性强。     

玉米赤霉烯酮的危害及物理吸附剂脱毒研究进展

玉米赤霉烯酮（Zearalenone, ZEN）主要是由镰刀真菌所产生的一种非甾体类真菌毒素。大量分布于玉米、大麦、小麦、高粱等作物中，对动物和人体健康造成严重危害。本文综述了ZEN的理化性质、毒性危害、检测方法及物理吸附剂对ZEN吸附脱毒的研究进展。     

高效液相色谱-二极管阵列法对中药中玉米赤霉烯酮毒素的检测效果

为建立简便易行、快速准确检测中药中玉米赤霉烯酮毒素的方法,对107个中药样品中的玉米赤霉烯酮毒素采用高效液相色谱-二极管阵列检测法进行测定。结果表明:玉米赤霉烯酮毒素在5～1 000ng/mL范围内线性关系良好,检测限(LOD)为25.7μg/kg,回收率82.4%～92.8%,RSD2.4%～8.8%。高效液相色谱-二极管阵列检测法简便快速、通用性强、结果准确可靠,可满足不同基质中药中玉米赤霉烯酮毒素检测的需要。     

荆州周边地区猪场饲料真菌及霉菌毒素的检测

以湖北荆州周边地区3个猪场所使用的饲料为研究对象,采用吸水纸检测法对饲料中的真菌种类进行了调查,并采用真菌毒素ELISA试剂盒对饲料样品中黄曲霉毒素B_1、玉米赤霉烯酮、赭曲霉毒素、T-2毒素、呕吐毒素和伏马毒素进行了检测,分析了饲料被污染的程度。结果表明,所检测的配合饲料、全价饲料、玉米和豆粕普遍受到了以上6种霉菌毒素的污染。饲料样品中玉米赤霉烯酮和赭曲霉毒素的检出率高达100%,黄曲霉毒素B_1和T-2毒素的检出率平均在80%以上。     

应用生物素-链霉亲和素的酶联免疫吸附法检测谷物中的玉米赤霉烯酮

基于生物素-链霉亲和素的酶联免疫吸附法(ELISA),建立了玉米赤霉烯酮(ZEN)的ZEN-ELISA检测方法。该方法的检测灵敏度为0.8 ng/ml,批内、批间变异系数分别为5.1%和8.6%,平均加样回收率为91.2%;抗ZEN单克隆抗体与玉米赤霉醇的交叉反应度为12.3%,而其与赭曲霉素A、脱氧雪腐镰刀菌烯醇、黄曲霉素B1无交叉反应;相关试剂在4℃存180 d后各检测参数基本无变化;该方法与商品ELISA试剂盒对同一样品ZEN测定结果的相关系数为0.943 2。说明该方法的特异性和稳定性较好,测定结果准确,可用于ZEN的大量筛查。     

抗O型口蹄疫病毒猪源单链抗体的筛选

为获得抗O型口蹄疫病毒(FMDV)高亲和力猪源单链抗体(scFv),建立抗原抗体(Ag-Ab)共表达细菌展示文库,抗原为FMDV结构蛋白VP1、抗体为高免猪抗体文库。采用细菌展示与流式细胞术结合方法,筛选出14株抗FMDV的scFv。将筛选获得scFv构建至pET28a载体中,经E. coli Rosetta表达,目的蛋白长度约为30ku,与scFv分子质量相符。Western blot结果表明,14株scFv均可与VP1特异性结合。ELISA结果表明,14株scFv均可与灭活O型FMDV特异性结合。应用共表达细菌展示技术,可避免抗原制备,简化操作流程,适用范围广泛;应用流式细胞仪筛选抗体库,可实现准确、快速、高通量筛选。抗FMDV猪源scFv研究可填补同源基因工程抗体空白,为进一步筛选中和抗体奠定基础。     

抗犬细小病毒单链抗体库构建及其亲和力检测

为获得高亲和力抗犬细小病毒单链抗体,构建抗犬细小病毒(CPV)细菌展示单链抗体文库。研究提取犬脾脏总RNA,反转录c DNA,以此为模板,分别扩增犬抗体VH和VL编码序列,插入克隆载体p Tlinker。利用SfiⅠ酶切位点将sc Fv基因构建至细菌展示载体p BSD中,将重组质粒电转化入E.coli DH5α构建p BFD-sc Fv细菌展示库。通过标记FITC的VP2蛋白,利用流式细胞术筛选12株阳性sc Fv。将12株sc Fv基因分别插入p ET-28a,构建重组表达质粒p ET28a-sc Fv。转化到E.coli Rosetta中诱导表达,获得约28 ku目的蛋白。经ELISA检测,纯化sc Fv对VP2蛋白P/N值均大于2.1,其中sc Fv-23、sc Fv-33、sc Fv-34对VP2蛋白亲和力较强。研究通过免疫本动物源动物,在获得高价抗体同时,避免传统单克隆抗体的免疫排斥现象;结合流式细胞术和细菌展示技术可对单链抗体文库高效、快速筛选。抗犬细小病毒同源单链抗体研究在填补市场同源基因工程抗体空白的同时,可为研制具有中和活性全长抗体奠定基础。     

抗红斑丹毒丝菌的rSpaA蛋白猪源单链抗体库构建及单链抗体淘选

从免疫过rSpaA的猪的脾淋巴细胞中提取总RNA,采用RT–PCR技术反转录合成cDNA。设计兼并引物扩增抗体重链可变区(VH)和轻链可变区(VL)基因片段,采用重叠延伸PCR方法,将VH和VL通过Linker连接成重组单链抗体(以下简写为sc Fv)的基因片段。将sc Fv的基因连接至噬菌粒载体p Comb3Xss,将重组载体电转化至宿主菌XL1-Blue,并经辅助噬菌体M13KO7拯救,获得猪源噬菌体单链抗体库,库容约为2.5×106。以rSpaA为靶抗原,经免疫亲和筛选,获得8株特异性较好的阳性克隆。本研究结果可为制备抗红斑丹毒丝菌的重组sc Fv提供新途径,并为猪丹毒的免疫检测和综合防制提供材料基础。     

胰腺癌人源噬菌体单链抗体库的构建及初步筛选

提取胰腺癌患者的外周淋巴细胞总RNA,以RT-PCR技术分别扩增出人源抗体H链和L链的可变区基因,采用SOE-PCR法将VH和VL片段随机拼接成scFv片段,然后将scFv片段克隆至pCANTAB5E载体,并电转化至感受态TG1菌,经辅助噬菌体M13K07拯救,获得胰腺癌人源噬菌体单链抗体库。结果表明,从外周血淋巴细胞中获取可变区基因,利用噬菌体抗体库技术制备人源抗胰腺癌单链抗体的策略是可行的。     

Preparation of Monoclonal Antibody Against PthA-NLS and Cloning of the Relative ScFv Gene

The present study aimed at the preparation of monoclonal antibody against the recombinant PthA-NLS and the isolation of the relative ScFv （single chain variable fragment） genes, providing the possibility to better understand the pathogenesis mechanism via PthA, and developing proper construct for future experimentation to obtain citrus plants resistant to canker disease by transformation and plant antibody techniques. The recombinant polypeptide PthA-NLS was injected into Balb/c mice to produce monoclonal antibody. Total RNA was isolated from the hybridoma cell line 3D10H2 which secreted anti- PthA-NLS McAb, and the variable region genes were amplified with specific primers by RT-PCR and SOE-PCR （splicing by overlap extension）, and then the ScFv gene was isolated. The recombinant ScFv gene was cloned into pGEM-T and pET32a（＋） vector. The later plasmid was transferred into E. coli BL21 （DE3） and the expression of the recombinant protein was induced. Three cell lines producing monoclonal antibody against PthA-NLS were acquired and named 1C8H1, 2D12B6, and 3D8A10. The recombinant ScFv gene of about 750 bp was constructed. The sequencing results showed that the ScFv gene consists of a 360 bp heavy chain, a 342 bp light chain, and a 45 bp linker region. The recombinant fusion ScFv protein was expressed by IPTG induction, and a 44.5 kDa of recombinant fusion protein was obtained. In conclusion, we obtained three cell lines stably producing monoclonal antibody specifically bound to PthA-NLS, and the relative ScFv gene was constructed and successfully expressed in E. coli. These results may play an important role in further understanding the pathogenesis mechanism and in the development of possible citrus resistant to canker disease by genetic transformation and plant antibiobody.     

创伤弧菌铁调基因fur的原核表达及多克隆抗体制备

应用PCR方法克隆了创伤弧菌Vibrio vulnificus FJ03-X2株的铁调基因fur(Ferric uptake regulator),该基因片段大小为450bp,编码149个氨基酸;以pET32a为表达载体,构建了原核表达质粒pET32a-FUR,表达质粒测序结果表明目的基因与GenBank中报道的创伤弧菌fur基因的同源性达98%以上;诱导表达获得可溶性的重组表达蛋白rFUR。镍离子金属螯合亲和层析介质(Ni-NTA)纯化rFUR,SDS-PAGE电泳分析其分子量约33kD。以纯化后的融合蛋白rFUR为抗原,4次免疫SD大鼠,制备抗rFUR蛋白大鼠多克隆抗体。用ELISA方法检测鼠多克隆抗体的效价达到1∶256 000,表明融合蛋白rFUR具有良好的免疫原性。     

抗PthA-NLS多肽单克隆抗体的制备及单链抗体基因的构建

 【目的】制备抗PthA-NLS多肽单克隆抗体并构建其单链抗体（single chain variable fragment,ScFv）基因,为从PthA角度进一步研究柑橘溃疡病致病机理创造条件,并为构建单链抗体基因植物表达载体,尝试利用转基因和植物抗体技术创制抗溃疡病柑橘新种质奠定基础。【方法】利用PthA-NLS重组多肽免疫Balb/c小鼠,制备抗PthA-NLS多肽单克隆抗体,从分泌抗PthA-NLS多肽单克隆抗体的杂交瘤细胞中提取总RNA,采用RT-PCR和重叠延伸PCR（splicing by overlap extension PCR,SOE-PCR）法构建其单链抗体基因,并克隆到pGEM-T载体和原核表达载体pET32a(+)中,重组原核表达质粒转化大肠杆菌BL21(DE3)后诱导重组蛋白的表达。【结果】获得了3株能稳定分泌抗PthA-NLS多肽的单克隆抗体杂交瘤细胞株1C8H1、2D12B6、3D8A10。成功构建了单链抗体基因ScFv,获得的ScFv基因大小约750 bp,其中重链可变区（VH）基因有360 bp,轻链可变区（VL）基因有342 bp,中间连接肽基因45 bp,经过IPTG诱导ScFv原核表达,获得了大小为44.5 kD的ScFv重组蛋白。【结论】试验获得了3株能稳定分泌抗PthA-NLS多肽的单克隆抗体杂交瘤细胞株,成功构建了ScFv基因,并实现了原核表达,为进一步探索PthA的致病机理和下一步利用抗体技术获得抗溃疡病柑橘种质的研究打下了基础。     

新加坡石斑鱼虹彩病毒ORF39L基因克隆、表达及抗体的制备

为研究新加坡石斑鱼虹彩病毒(Singapore grouper iridovirus,SGIV)核心基因ORF39L在病毒侵染过程中的作用,制备了SGIV ORF39L表达蛋白的抗体;通过生物信息学软件预测SGIV ORF39L的抗原表位基因,并以所选抗原表位基因片段39Ag1和39Ag2构建原核表达质粒pET32a-39Ag1和pET32a-39Ag2;将质粒转入大肠杆菌BL21(DE3)中成功表达融合蛋白pET32a-VP39Ag1和pET32a-VP39Ag2;用所得融合蛋白分别免疫小鼠,获得了高效特异抗体39Ab1和39Ab2;利用制备的抗体进行间接免疫荧光试验,结果显示,VP39参与了SGIV的装配。本研究结果为进一步研究ORF39L基因在SGIV感染过程中的作用机制提供了数据资料。     

抗堆型艾美耳球虫子孢子单链抗体的构建及表达

应用RT-PCR技术,从稳定分泌抗堆型艾美耳球虫子孢子抗原的单克隆抗体(McAb)的杂交瘤细胞Easp-3G3中扩增出抗体VH和VL基因,通过在VH和VL可变区基因之间引入连接肽(Gly4Ser)3,体外构建抗堆型艾美耳球虫的单链抗体基因,并将其克隆至表达载体pET28a( )载体中进行表达,用Ni-NTA的金属亲和层析法进行纯化,通过SDS-PAGE和ELISA测定其纯度和生物学活性.电泳结果分析表明重组蛋白的相对分子量为32kDa,纯度为94%;ELISA反应结果证明该单链抗体保持了单克隆抗体的生物学特性,并能与堆型艾美耳球虫子孢子抗原发生特异性反应.     

猪肠球菌溶血素cylA基因原核表达载体的构建

以猪致病性粪肠球菌染色体DNA为模板,PCR扩增溶血素cylA基因,相应酶切后,克隆到原核表达载体pET32a中,构建pET32a-cylA重组质粒,并将pET32a-cylA质粒转化入大肠杆菌BL21(DE3)。经HindⅢ、XhoI双酶切及测序鉴定,并与已发表的肠球菌溶血素cylA基因序列比较,同源性达99.8%。表明成功构建猪肠球菌溶血素cylA基因的重组表达质粒,为制备单抗、开发疫苗及其致病机制研究奠定了基础。