甜菜ISSR-PCR反应体系的优化

以甜菜基因组DNA为模板,研究了ISSR的主要影响因素,建立一套适宜于甜菜的ISSR优化反应体系及程序,并对该优化体系进行了验证.实验结果表明:①优化的ISSR扩增的反应体系为:20μL的反应体积中包括2.5mmol/L MgCl2,0.25mmol/L dNTPs,1.5U Taq DNA聚合酶,0.5μmol/L引物,10×PCR Buffer 2μL,100ng DNA模板.②优化的PCR扩增条件为:94℃预变性3min,然后94℃变性30s,45℃退火30s,72℃延伸1min,35个循环后,72℃延伸5min.③利用优化的反应体系仅用1条引物就能将10份甜菜材料区分开.     

大豆SSR检测体系的优化研究

以大豆为试材,研究了大豆SSR检测体系中PCR扩增的各主要成分对检测结果的影响,确立了适宜的退火温度和反应体积,改进了PCR扩增程序和银染方法,进一步优化了适用于大豆的SSR检测体系.优化后的SSR反应体系为:10×Buffer 1.00μL、2.00 ng/μL模板DNA、0.15μmol/L SSR引物、150.00μmol/L dNTPs、0.50 U Taq酶、2.00mmol/L Mg2 ,加ddH20至终体积10.00μL.优化的PCR扩增程序为:94℃预变性3 min;94℃变性25s,47℃退火25s,72℃延伸30s,共35个循环;72℃延伸5min,4℃保存.优化后的检测体系更为经济有效.     

胡椒ISSR反应体系的建立与优化

通过单因子、双因子实验研究了胡椒ISSR-PCR反应体系中热参数和5个主要成分,即退火温度、循环数、变性时间、退火时间、延伸时间以及Mg2+、dNTPS、引物、模板DNA、Taq DNA聚合酶对扩增结果的影响,建立了适合胡椒ISSR分析的反应体系和扩增程序,即在25 μL反应体系中,内含2 mmol/L Mg2+、200 μmol/L dNTPS、1×PCR Buffer、2 μmol/L引物、100 ng模板、1 U Taq DNA聚合酶。扩增程序为94℃预变性3 min, 94℃变性120 s,复性60 s,72℃延伸 3 min,循环35个,结束后72℃延伸7 min。这一优化体系的建立为今后利用ISSR标记技术进行胡椒种质鉴定、遗传多样性分析奠定了基础。     

十里香茶基因组DNA高效提取与RAPD方法建立

本文以嫩芽和鲜叶为材料,建立了十里香茶高效、微量基因组DNA提取方法,提取的DNAOD260/280在1.7～2.0之间,DNA产率在81.8～483.5 ng/mg之间,能够满足RPAD的需要。同时建立了十里香茶RAPD分子标记方法,25μL PCR反应体系中包含:50 ng DNA模板,1.2μL引物,2.5μL 10×PCR Buffer,2.5μL 25 mMMgCl2,2μL 10 mM dNTP,14.8μL ddH2 O1,U Taq聚合酶。PCR扩增程序为94℃预变性3 min,94℃变性1 min,36℃退火1 min 20 s,72℃延伸2 min4,0个循环后72℃延伸10 min。15个RAPD随机引物以十里香1号DNA为模板,分别扩增出1～7条带。     

假臭草DNA提取及RAPD反应体系的优化

以假臭草叶片为材料，对影响其随机扩增多态DNA(RAPD)反应的各因素进行优化，建立了假臭草RAPD的优化反应体系和程序，即在10 μL反应体系中，5 ng(/10 μL)模板DNA，1.0 μmol/L随机引物F15，150 μmol/L dNTPs，2.0 mmol/L Mg2+，1.0 U Taq DNA聚合酶；扩增程序为95℃预变性4 min，95℃变性40 s，36℃退火40 s，72℃延伸1 min，10个循环，后94℃变性30 s，35℃退火30 s，72℃延伸1 min，35个循环，72℃     

人参基因组RAPD条件的优化

目的确定药用人参最佳随机扩增多态DNA(RAPD)分析方法。方法以药用人参新鲜叶为材料,研究对影响RAPD反应的各因素进行优化。结果药用人参RAPD反应体系及程序为:在25μL反应体系中,含40ng模板DNA,0.3μmol/L随机引物,0.2mmol/LdNTPs,2.5μL10×PCRBuffer,2.0UTaq酶;扩增程序为:第一步94℃预变性2min,第二步94℃变性1min,第三步36℃退火45s,第四步72℃延伸90s,返回至第二步重复40个循环,第六步72℃延伸10min,最后4℃保存以备电泳。结论建立了人参RAPD的优化反应体系及程序。     

小麦显性多子房基因RAPD反应体系的研究

为了建立显性多子房小麦RAPD反应的最佳体系,保证反应结果的稳定性和可靠性,降低反应成本,在相同PCR扩增程序(94℃预变性5min,94℃变性1min,36℃退火1min,72℃延伸2min,45个循环,72℃延伸10min,4℃保存)下,对多子房小麦基因组DNA的RAPD扩增体系各参数进行比较筛选,创建其最佳反应体系为:25μl反应体系中,模板DNA50ng,10×PCR缓冲液2.5μl,dNTPs0.2mmol/L,Taq酶1u,Mg2+浓度为2.0mmol/L,ddH2O12.17μl,随机引物10ng。     

荷花ISSR—PCR反应体系的建立及优化

以荷花叶片提取的基因组DNA为材料,通过对影响ISSR—PCR扩增效果的一些因素,如dNTPs浓度、Mg2＋浓度、TαDNA聚合酶用量、引物用量、模板DNA用量以及退火温度等进行筛选和优化,确立了可用于荷花ISSR—PCR分析的最适宜的PCR反应体系：20μL PCR反应体积含O．4mmol·L-1 dNTPs、3．5mmol·L-1Mg2＋、1．5U TαqDNA聚合酶、0．4μmol·μL-1引物、3ng模板DNA。PCR扩增程序为：94℃预变性2min,94oC变性30s,54．5℃退火30s,72℃延伸1min,45个循环,最后72℃延伸7min,置4℃保存。应用该ISSR体系对6份荷花种质进行了扩增,证实了该体系的适用性和稳定性。     

茶树RAPD反应系统和扩增程序优化

以龙井43为材料，使用国产PCR仪，对茶树RAPD分析中影响PCR扩增结果的因素进行了研究，确定了茶树RAPD的最适反应系统和扩增程序，即在25μl反应体系中，含25～50ng模板DNA、2mmol／LMgCl2、各0．2mmo／LdNTPs、0．2μmol／L引物和0．5～1．0UTanDNA聚合酶；扩增程序为：94℃预变性180s，94℃变性60s，38℃退火90s，72℃延伸120s，共进行40～45个循环，最后72℃延伸300～600s，这样可以取得较好的扩增结果。     

巨竹ISSR反应体系的建立与优化

以巨竹叶片提取的基因组DNA为材料,用引物UBC810（序列为GAGAGAGAGAGAGAGAT）研究了PCR反应体系的主要成分、退火温度及循环次数对该种植物ISSR扩增结果的影响。结果表明,20μL的反应体系含40ng模板DNA、0．6μmol·L^-1引物,1．0UTaqDNA聚合酶,2．5mmol·L^-1 Mg^2＋,0．25mmol·L^-1dNTPs,1×Buffer。PCR扩增程序为：94℃预变性5min;94℃变性45s,54．5℃复性30S,70℃延伸90S,循环40次;72℃延伸10min,置4c℃保存。     

石斛属部分植物SRAP-PCR反应体系的建立与优化

建立石斛属(Dendrobium)植物SRAP-PCR反应体系,为石斛的品种鉴定与分类提供理论和技术基础.采用单因素及正交试验对反应体系中的各因子进行优化,确定最优退火温度,并筛选有效引物.结果表明:适用于石斛属植物SRAP 最佳的反应体系为:Mg2+2.5 mmol/L,dNTPs 0.25 mmol/L,Taq D...     

茶树简化EcoTILLING技术的建立

EcoTILLING(Ecotype Targeting Induced Local Lesions IN Genomes)可快速检测自然群体中的SNP(Single Nucleotide Polymorphism)等DNA变异。第一次建立了简化的茶树EcoTILLING技术体系:首先筛选扩增目的基因的特异PCR引物;然后通过CELⅠ酶切PCR产物优化实验,确定酶切时间20 min、10×buffer组成为250 mmol/L Tris-HCl(pH7.4)、150 mmol/L KCl、15 mmol/L MgSO4、4μg/mL BSA和0.04%Triton x-100,反应温度为47.5℃,酶量为1.8μL CJE(Celery Juice Extract)/10μL反应体系时,酶切的谱带信号较强、特异性高;初步确定合适的非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳检测条件为凝胶浓度5%、上样量4～5μL、有效分离长度要达到15 cm。利用上述简化的EcoTILLING对6份茶树种质870 bp的PPO基因片段实现了分型,经测序验证酶切产生的谱带与6份种质内部或不同种质间的SNP位置吻合。     

马铃薯SSR-PCR体系的优化与建立

以马铃薯叶片DNA为模板,采用单因素试验的方法,对影响马铃薯SSR-PCR反应体系的主要成分模板DNA、dNTP浓度、引物浓度、Mg2+浓度、Taq酶浓度及退火温度进行了优化,并建立最优化的马铃薯SSR扩增反应体系。结果表明:在20μL反应体系中,模板DNA用量为60 ng,dNTP为0.3125 mmol/L,引物浓度为2.4pmol,Mg2+为1.5 mmol/L,Taq酶为0.5 U,筛选各引物最适宜的退火温度,经2.0%琼脂糖凝胶电泳检测,扩增条带清晰,优化后的SSR反应体系稳定性好,可用于马铃薯遗传多样性分析。     

根癌农杆菌介导的水稻纹枯病菌转化系统的建立

为建立水稻纹枯病菌的T-DNA插入诱变转化系统,以水稻纹枯病菌(Rhizoctonia solani AG-1ⅠA)强致病力菌株GD118为转化的初始菌株,从预诱导时间、共培养时间、共培养时乙酰丁香酮的浓度、共培养温度和共培养时固体诱导培养基(SIM)的pH值等5个方面对转化条件进行了优化,成功地建立了适合于水稻纹枯病菌根癌农杆菌介导转化(ATMT)的优化系统。这个优化系统的转化条件如下:以30μg/mL的潮霉素B作为转化子的筛选浓度,预诱导8h,共培养20h,共培养时固体诱导培养基上的乙酰丁香酮浓度为200μmol/L,共培养温度25℃,共培养时固体诱导培养基pH5.6～5.8。采用这个系统筛选到的转化子继代培养5代后,在含30μg/mL潮霉素B的PDA平板上仍表现明显的抗性。从得到的转化子中随机抽取10个,利用根据抗潮霉素hph基因设计的特异性引物进行PCR扩增,转化子均能扩增出500bp左右的预期条带;与此同时,以4个根癌农杆菌作为阳性对照,用根癌农杆菌Vir基因特异引物对转化子进行PCR扩增,以排除转化子受农杆菌污染所致的假阳性,结果表明:4个根癌农杆菌均能扩增出Vir基因条带(730bp),而10个转化子均未能扩增出相应条带。以上两个PCR扩增的实验结果清楚地表明,T-DNA已经插入到目标菌株GD118中。     

马铃薯RAPD标记的PCR技术影响因素的探讨

试验采用不同的马铃薯材料进行ＰＣＲ 技术体系的研究, 建立和完善了马铃薯少量材料的ＤＮＡ提取方法, 研究了ＰＣＲ扩增中Ｍｇ２ ＋ 浓度、引物和底物浓度对ＰＣＲ产物的影响。试验结果表明, 在以引物为１０ ｍｅｒ 的ＰＣＲ反应体系中, 适当提高Ｍｇ２ ＋ 浓度（１－５ ～２－７ ｍＭ） 有利于ＰＣＲ反应的进行, 而引物与底物只有在一个相对适当浓度范围内才能获得理想的结果, 过低会使扩增产物达不到可检测的水平, 过高则会影响扩增产物的特异性。本试验中引物的适宜浓度为０－８ μＭ, 底物为８０ ～１８０ μＭ。所建立的优化马铃薯ＰＣＲ 体系同样适用于水稻、玉米、番茄和油菜等作物。