大豆RAPD影响因素的探讨

为确保ＲＡＰＤ结果的重复性和真实性,本文对影响大豆ＲＡＰＤ结果的主要因素进行了研究,这些因素包括：Ｔａｑ酶、ＭｇＣｌ２、模板、ｄＮＴＰｓ引物浓度、双引物扩增及热徨数。最终优化的大豆ＲＡＰＤ反应体系为：２５ｕｌ反应液中,１０倍反应缓冲液（１００ｍＭＴｒｉｓ－ＨＣｌｐＨ８．０,５００ｍＭＫＣｌ,０．１％ｇｅｌａｔｉｎ）,２．０ｍＭＭｇＣｌ２,ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＴＴＰ、ｄＡＴＰ和０．２ｍＭ,１５ｎｍ     

花生RAPD反应条件的研究

在ＲＡＰＤ反应中,有许多因素影响结果的稳定性和准确性,本文以花生为材料,对ＲＡＰＤ各种反应条件的优化组合进行了探索。结果表明,花生ＲＡＰＤ的较为理想的反应体系如下,１０μｌ反应体积中含;５０ｍｍｏｌ／Ｌ ＫＣｌ,１０ｍｍｏｌ／ＬＴｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ９．０）,０．１％Ｔｒｉｔｏｎ－１００,２０￣４０ｎｇ引物,０．２ｎｍｏｌ／μｌ的ｄＮＴＰｓ,１￣２μｇ／μｌ的ＢＳＡ,１５ｎｍｏｌ／μｌＭｇＣｌ２０     

马铃薯SSR-PCR体系的优化与建立

以马铃薯叶片DNA为模板,采用单因素试验的方法,对影响马铃薯SSR-PCR反应体系的主要成分模板DNA、dNTP浓度、引物浓度、Mg2+浓度、Taq酶浓度及退火温度进行了优化,并建立最优化的马铃薯SSR扩增反应体系。结果表明:在20μL反应体系中,模板DNA用量为60 ng,dNTP为0.3125 mmol/L,引物浓度为2.4pmol,Mg2+为1.5 mmol/L,Taq酶为0.5 U,筛选各引物最适宜的退火温度,经2.0%琼脂糖凝胶电泳检测,扩增条带清晰,优化后的SSR反应体系稳定性好,可用于马铃薯遗传多样性分析。     

大豆ISSR-PCR反应体系的优化

以黑龙江省大豆为材料,利用正交试验设计,对大豆ISSR-PCR反应体系中的5种主要因素(Mg2+、引物、dNTPs、模板DNA量、Taq酶量)在4个水平上进行体系优化.结果确定了大豆ISSR-PCR反应的最佳体系(25 μL)为:Mg2+浓度1.85 mmol·L-1、dNTPs浓度1.2 mmol·L-1、引物浓度1.2 μmol·L-1、模板DNA60 ng、Taq酶量0.7 U.利用该最佳体系,选取引物855对25份材料进行扩增,以验证该体系的稳定性.建立了适于大豆的ISSR-PCR反应体系,为利用ISSR标记技术开展黑龙江省大豆遗传多样性分析提供了依据.     

茶树ISSR-PCR反应体系的建立

通过优化影响茶树 ISSR-PCR 的主要参数,确立了适用于茶树的 ISSR 反应体系和扩增条件。结果表明在 20 μl 反应体系中,模板 DNA、引物、Mg++、dNTP 和 Taq DNA 聚合酶五种主要成分的最适浓度分别为 10ng、150 nmol/L、1.5 mmol/L、150 μmol/L、0.5 U。在扩增过程中,引物的适宜退火温度比其 Tm 值平均高 4.5℃,扩增出足量产物至少需要 30 个热循环。利用该优化反应体系和扩增条件,对 13 份不同茶树种质资源进行ISSR-PCR 扩增,扩增产物的多态性为 77.6%。引物 TRI18 构建的 ISSR 指纹图谱,可以区分 13 份茶树资源中的 12 份,分辨率达 92.3%。     

基于B/S结构的农产品质量安全追溯系统研究

以蝴蝶兰嫩叶提取的DNA为材料,蝴蝶兰SRAP反应体系中的重要参数Mg2+、Taq酶、模板DNA及随机引物,建立了一套适合蝴蝶兰基因扩增的SRAP反应体系：25 μL的反应体系中Mg2+浓度为2.0 mmol/L,Taq酶1.0 U,DNA模板40 ng,上下游引物0.8 mmol/L。该体系扩增条带清晰,重复性好,有望在蝴蝶兰属植物的遗传育种研究中运用。     

建立番木瓜性别研究的cDNA-AFLP分析体系

以番木瓜幼苗为材料,利用多重PCB技术快速鉴定其性别.建立适合番木瓜性别研究的cDNA-AFLP分析体系,分析影响cDNA-AFLP分析体系的各种可能因素(RNA提取、酶切与连接效率、预扩增效果等),并对影响选择性扩增反应的各因子进行优化.结果表明,选择性扩增的最佳体系,即在反应体系中,各因素终浓度分别为:Ta[酶0.06U/μL;L;Mg2+2.4mmol/L;dNTP 2.0mmol/L;引物0.48 μmol/L.通过优化体系得到的选择性扩增产物,银染检测后条带清晰稳定.表明成功建立了适合番木瓜性别研究的cDNA-AnLP分析体系.     

大量元素对茶愈伤组织生长及儿茶素累积的影响

本文分别研究了培养基中氮源组成与浓度，以及Ｋ＋、Ｃａ２＋、Ｍｇ２＋、ＰＯ４３－和ＳＯ４２－对茶愈伤组织生长和儿茶素累积含量的影响。结果表明，全硝态氮对于愈伤组织儿茶素形成最为有利；而ＮＯ３－／ＮＨ４＋比为７：３时愈伤组织生长最快；总氮浓度为１５ｍｍｏｌ／Ｌ时愈伤组织生长量最高；提高氮浓度则导致儿茶素含量急剧下降。添加Ｋ＋促进愈伤组织生长并使儿茶素含量降低；而１ｍｍｏｌ／Ｌ的Ｃａ２＋对儿茶素形成最为有利。在其余的离子中，ＰＯ４３－对愈伤组织生长影响较大，而ＳＯ４２－对儿茶素形成影响较大，Ｍｇ２＋浓度对两者均无显著影响。所得结果为采用两步法体系培养茶树细胞、系统研究儿茶素类物质的形成奠定了基础。     

甘蔗cDNA-SCoT差异显示分析PCR反应体系建立、优化及应用

cDNA-SCoT差异显示分析是应用于植物基因差异表达研究的一项新技术.本研究以甘蔗品种桂糖11号根尖为材料,提取总RNA并反转录第1链cDNA,对影响甘蔗cDNA-SCoT差异显示PCR反应的cDNA模板、SCoT引物、dNTPs、Taq DNA聚合酶和Mg2+等因子进行优化,建立甘蔗cDNA-SCoT反应体系,同时应用优化后反应体系分离25％PEG6000胁迫诱导甘蔗根尖差异表达基因片段.结果表明:各项因子均对PCR扩增效果存在影响,20μL反应体系中各因子的最佳含量如下:cDNA 80 ng、引物浓度1.0 μmol/L、Taq DNA聚合酶2.0 U、dNTPs浓度200 μmo1/L、Mg2+浓度1.8 mmol/L.研究结果还显示,SCoT引物扩增多态性丰富,平均每条引物扩增条带30条,多态性条带比率为46.9％,6条引物分离得到PEG诱导甘蔗根尖特异表达片段45条,表明本研究所建立的甘蔗cDNA-SCoT反应体系具有操作简便、结果稳定、重复性好、成本低、多态性丰富等优点,可为甘蔗基因差异表达研究提供新的技术支持.     

抗真菌蛋白Rs—AFPs基因克隆与序列分析

从开花后５０－９０ｄ的萝卜种子中提取总ＲＮＡ,逆转录合成ｃＤＮＡ第一链,通过ＰＣＲ反应,得到Ｒｓ－ＡＦＰ１和Ｒｓ－ＡＦＰ２基因扩增产物。采用Ｔ－载体克隆技术,将二分别插入ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ／ＥｃｏＲＶ－Ｔ克隆载体,得到重组质粒ｐＧＲ－１和ｐＧＲ－２用其转化宿主菌Ｅ．ｃｏｌｉ ＤＨ５α,从阳性菌落制备测序用质粒ＤＮＡ样品,在ＡＢ１３７０Ａ ＤＮＡ测序仪上测序。     

甘薯TD-SSR-PCR反应体系的优化

为探索甘薯最佳TD-SSR-PCR体系,利用L16(43)正交设计研究2×PCR Mix、引物、模板DNA等主要影响因素的适宜浓度,并在此基础上对扩增程序和聚丙烯酰胺凝胶电泳上样量进行优化。结果表明,优化后的TD-SSR-PCR反应体系包括:10μL 2×PCR Mix、100 ng模板DNA、0.4μmol/L引物,1μL甘油,总体积20μL;优化后的扩增程序为:94℃预变性4 min,94℃变性45 s、Tm+5℃~Tm-5℃(每循环退火温度下降0.5℃,Tm选用一对引物中的较小Tm值)退火30 s(退火时间因扩增片段大小而异)、72℃延伸1 min共20个循环,94℃变性45 s、Tm-5℃退火30 s、72℃延伸1 min共15个循环,最后72℃延伸7 min,4℃保存;聚丙烯酰胺电泳上样量以1.5~2μL为宜。在此条件下,利用引物Z37对10份甘薯材料进行PCR扩增,得到的条带清晰、多态性高,表明此条件适用于甘薯的TD-SSR-PCR反应体系。     

荷花ISSR—PCR反应体系的建立及优化

以荷花叶片提取的基因组DNA为材料,通过对影响ISSR—PCR扩增效果的一些因素,如dNTPs浓度、Mg2＋浓度、TαDNA聚合酶用量、引物用量、模板DNA用量以及退火温度等进行筛选和优化,确立了可用于荷花ISSR—PCR分析的最适宜的PCR反应体系：20μL PCR反应体积含O．4mmol·L-1 dNTPs、3．5mmol·L-1Mg2＋、1．5U TαqDNA聚合酶、0．4μmol·μL-1引物、3ng模板DNA。PCR扩增程序为：94℃预变性2min,94oC变性30s,54．5℃退火30s,72℃延伸1min,45个循环,最后72℃延伸7min,置4℃保存。应用该ISSR体系对6份荷花种质进行了扩增,证实了该体系的适用性和稳定性。     

咖啡ISSR与RAPD-PCR反应体系优化

以中粒种咖啡部分种质为试材,采用U25（55）均匀设计表,对影响ISSR和RAPD标记的模板DNA、Mg2+、dNTPs、TaqDNA聚合酶和引物浓度5个因素进行优化,分别建立适合于中粒种咖啡ISSR-PCR和RAPD-PCR标记的反应体系。结果表明：2种标记的反应体系相似,20 μL的反应体系中含DNA模板20 ng,Mg2+ 1.5 mmol/L,dNTPs 0.3 mmol/L,Taq酶1.25 U,引物0.6 μmol/L。利用所确立的体系对13份中粒种咖啡种质进行扩增,结果条带清晰明亮,多态性好     

马铃薯晚疫病种薯带菌的分子检测

从马铃薯块茎上分离纯化得到晚疫病菌、银腐病菌、癌肿病菌、红腐病菌、黑点病菌和镰刀菌等并提取它们的全基因组DNA,用引物08-3和08-4对这些真菌的DNA进行PCR扩增,以检验该引物扩增晚疫病菌DNA的特异性。取马铃薯种薯的芽眼、芽及其他不同部位并用NaOH法提取晚疫病菌DNA,再用引物08-3和08-4进行特异性扩增以检验种薯是否带晚疫病菌。结果表明:(1)引物08-3和08-4有很强的特异性,只能扩增出大小为257bp的马铃薯晚疫病菌DNA片段;(2)用该引物能扩增出种薯芽眼组织中大小为257bp的晚疫病菌DNA,说明通过PCR特异扩增,能直接检测出马铃薯种薯中潜伏的晚疫病菌。(3)本次检测的本地感病品种米拉有10%的种薯带晚疫病菌。该研究为种薯传播晚疫病菌的分子检测提供了依据和方法。     

马铃薯S病毒的RT-PCR检测

根据马铃薯S病毒(PVS)的外壳蛋白基因序列,设计合成了一对寡核苷酸引物。以感染PVS的马铃薯组织和健康的组织为材料,对提取植物总RNA的两种方法进行了比较,并对总RNA的提取方法进行改进,获得了纯度较高,完整性较好的总RNA。以此为模板,进行cDNA合成及PCR扩增,从感病组织扩增得到一段长度约642bp的特异PCR扩增产物,与理论设计的外壳蛋白基因大小一致,而健康组织无此扩增产物。从而建立了检测PVS快速灵敏简便的新方法,在基因水平上为PVS的检测提供了新手段。     

嵌套式PCR超灵敏检测马铃薯环腐病菌

马铃薯种薯中存在环腐病菌潜伏侵染,这种潜伏侵染逐代累积、逐渐表现症状,这是马铃薯环腐病无法根除的根本原因。本研究应用国外成功报道的根据存在于pCS1质粒和环腐菌染色体中一个1.3 kb的插入因子IS1121、高度重复的DNA片段设计的环腐病菌亚种特异性引物序列合成出引物对CMSIF1-CMSIR1和引物对CMSIF2-CMSIR2。以环腐标准菌株、黑龙江省环腐菌株以及马铃薯上其它主要的细菌病原菌(青枯病、软腐病、黑胫病)为试验材料进行直接PCR和嵌套式PCR扩增,结果只有环腐标准菌株和黑龙江省环腐菌株出现特异性片段(直接PCR扩增出1046 bp的片段,嵌套式PCR扩增出864 bp的片段)。将环腐菌纯菌种菌悬液稀释成浓度梯度并与马铃薯组织液混合进行直接PCR和嵌套式PCR检测灵敏度比较,结果表明嵌套式PCR检测灵敏度比直接PCR检测灵敏度提高了100￣1000倍。以明显感病症状的块茎、无明显感病症状的块茎和健康块茎为试验材料进行直接PCR和嵌套式PCR,结果除明显感病症状块茎外,所有无明显感病症状的块茎也均被检测出带有环腐病菌。     

An applied fingerprinting system for cultivated potato using simple sequence repeats

The ability to quickly and accurately identify potato (Solanum tuberosum L.) clones is important to potato-breeding programs, seed and commercial potato growers, and marketing and utilization of potato cultivars. Since 1990, the Michigan State University Potato Breeding and Genetics Program has used an isozyme-based fingerprinting system to identify potato cultivars. Isozyme analysis is an economical and effective means of discriminating potato clones; however, isozyme analysis requires fresh, healthy tuber or leaf tissue. DNA-based fingerprinting using simple sequence repeats (SSRs or microsatellites) has been shown to discriminate between potato clones. The objective of this study was to identify the most useful SSR primer pairs that accurately and efficiently distinguish clones for an applied fingerprinting system of cultivated potato. SSR primer pairs with high polymorphism were selected from previous tetraploid potato studies. DNA isolated from 17 potato clones representing round-white, russet, and red market classes were visualized on both polyacrylamide (PAGE) and agarose gel systems. Polymorphism was observed in all 18 primer combinations on PAGE and 14 using agarose gel electrophoresis. All 17 cultivars were discriminated on PAGE with various combinations of two primer pairs: STIIKA using STACCAS3, STIN-HWI, or STM0031; and STACCAS3 using STGBSS1, POTM1-2, STM1104, or STM0031. The combination of STM0019, STM0031, STGBSS1, and POTM1-2 was able to differentiate all 17 clones using agarose gel electrophoresis. PAGE was determined to be the preferred system for variety identification, but agarose gel electrophoresis can be used to differentiate lines when specific varietal comparisons are needed. In addition, five different DNA source tissue types were evaluated (fresh foliar, freeze-dried foliar, fresh tuber, freeze-dried tuber epidermis, and freeze-dried tuber tissue). Amplification products were similar for all five tissue sources used for DNA isolation. This ability to isolate DNA from freeze-dried tissue will allow cultivar identification when fresh tissue is not available. The SSR primer pairs presented here can be used as a practical fingerprinting system for cultivated potato identification.     

茶尺蠖核型多角体病毒荧光定量PCR检测方法的建立

根据茶尺蠖核型多角体病毒（Ectropis oblique nucleopolyhedrovirus, EoNPV）基因序列设计一对引物,并从感染该病毒的虫体中提取EoNPV基因组DNA,进行PCR扩增,将该基因片段与载体pMD18-T连接,转化入大肠杆菌TG1中,经单克隆菌落筛选及测序鉴定后得到重组质粒,以该质粒为荧光定量PCR标准品模板稀释后建立标准曲线。构建的标准曲线线性关系良好,相关系数为0.989,检测范围为10³~10⁸拷贝/µL,特异性和重复性较好。该方法可以准确地判断出病毒拷贝数,为茶尺蠖核型多角体病毒在虫体内增殖动态的研究和病毒制剂的质量检测提供了方法依据。