小麦显性多子房基因RAPD反应体系的研究

为了建立显性多子房小麦RAPD反应的最佳体系,保证反应结果的稳定性和可靠性,降低反应成本,在相同PCR扩增程序(94℃预变性5min,94℃变性1min,36℃退火1min,72℃延伸2min,45个循环,72℃延伸10min,4℃保存)下,对多子房小麦基因组DNA的RAPD扩增体系各参数进行比较筛选,创建其最佳反应体系为:25μl反应体系中,模板DNA50ng,10×PCR缓冲液2.5μl,dNTPs0.2mmol/L,Taq酶1u,Mg2+浓度为2.0mmol/L,ddH2O12.17μl,随机引物10ng。     

人参基因组RAPD条件的优化

目的确定药用人参最佳随机扩增多态DNA(RAPD)分析方法。方法以药用人参新鲜叶为材料,研究对影响RAPD反应的各因素进行优化。结果药用人参RAPD反应体系及程序为:在25μL反应体系中,含40ng模板DNA,0.3μmol/L随机引物,0.2mmol/LdNTPs,2.5μL10×PCRBuffer,2.0UTaq酶;扩增程序为:第一步94℃预变性2min,第二步94℃变性1min,第三步36℃退火45s,第四步72℃延伸90s,返回至第二步重复40个循环,第六步72℃延伸10min,最后4℃保存以备电泳。结论建立了人参RAPD的优化反应体系及程序。     

台湾麻豆文旦RAPD反应条件的优化

在参考一般RAPD反应程序的基础上,经过反复试验,确定适合台湾麻豆文旦基因组DNA的RAPD扩增程序为(总体积10 ul):模板DNA5 ng,随机引物33 ng,dNTP 1.5 ul,10×PCR buffer 1 ul,MgCl22.0 mmol/L, Taq酶1U.95℃预热2 min,94℃变性30 s,38.7℃退火45 s,72℃延伸45 s,30个cycle后72℃延伸8 min     

甜菜ISSR-PCR反应体系的优化

以甜菜基因组DNA为模板,研究了ISSR的主要影响因素,建立一套适宜于甜菜的ISSR优化反应体系及程序,并对该优化体系进行了验证.实验结果表明:①优化的ISSR扩增的反应体系为:20μL的反应体积中包括2.5mmol/L MgCl2,0.25mmol/L dNTPs,1.5U Taq DNA聚合酶,0.5μmol/L引物,10×PCR Buffer 2μL,100ng DNA模板.②优化的PCR扩增条件为:94℃预变性3min,然后94℃变性30s,45℃退火30s,72℃延伸1min,35个循环后,72℃延伸5min.③利用优化的反应体系仅用1条引物就能将10份甜菜材料区分开.     

茶树RAPD反应系统和扩增程序优化

以龙井43为材料，使用国产PCR仪，对茶树RAPD分析中影响PCR扩增结果的因素进行了研究，确定了茶树RAPD的最适反应系统和扩增程序，即在25μl反应体系中，含25～50ng模板DNA、2mmol／LMgCl2、各0．2mmo／LdNTPs、0．2μmol／L引物和0．5～1．0UTanDNA聚合酶；扩增程序为：94℃预变性180s，94℃变性60s，38℃退火90s，72℃延伸120s，共进行40～45个循环，最后72℃延伸300～600s，这样可以取得较好的扩增结果。     

下河蜜柚RAPD反应体系的建立

利用改良的CTAB方法从柚叶片中提取高质量的DNA。在参考一般RAPD反应程序的基础上,经过反复试验,确定适合柚PCR扩增程序为:模板DNA15ng,随机引物3.3ng/ul,10*PCR buffer 1ul,dNTP 0.5ul,TaqDNA聚合酶0.25ul(1U),总体积10ul。95℃预热2min,94℃变性30s,35.1℃退火45s,72℃延伸45s,30个循环后72℃延伸8min。     

巨竹ISSR反应体系的建立与优化

以巨竹叶片提取的基因组DNA为材料,用引物UBC810（序列为GAGAGAGAGAGAGAGAT）研究了PCR反应体系的主要成分、退火温度及循环次数对该种植物ISSR扩增结果的影响。结果表明,20μL的反应体系含40ng模板DNA、0．6μmol·L^-1引物,1．0UTaqDNA聚合酶,2．5mmol·L^-1 Mg^2＋,0．25mmol·L^-1dNTPs,1×Buffer。PCR扩增程序为：94℃预变性5min;94℃变性45s,54．5℃复性30S,70℃延伸90S,循环40次;72℃延伸10min,置4c℃保存。     

甘薯TD-SSR-PCR反应体系的优化

为探索甘薯最佳TD-SSR-PCR体系,利用L16(43)正交设计研究2×PCR Mix、引物、模板DNA等主要影响因素的适宜浓度,并在此基础上对扩增程序和聚丙烯酰胺凝胶电泳上样量进行优化。结果表明,优化后的TD-SSR-PCR反应体系包括:10μL 2×PCR Mix、100 ng模板DNA、0.4μmol/L引物,1μL甘油,总体积20μL;优化后的扩增程序为:94℃预变性4 min,94℃变性45 s、Tm+5℃~Tm-5℃(每循环退火温度下降0.5℃,Tm选用一对引物中的较小Tm值)退火30 s(退火时间因扩增片段大小而异)、72℃延伸1 min共20个循环,94℃变性45 s、Tm-5℃退火30 s、72℃延伸1 min共15个循环,最后72℃延伸7 min,4℃保存;聚丙烯酰胺电泳上样量以1.5~2μL为宜。在此条件下,利用引物Z37对10份甘薯材料进行PCR扩增,得到的条带清晰、多态性高,表明此条件适用于甘薯的TD-SSR-PCR反应体系。     

假臭草DNA提取及RAPD反应体系的优化

以假臭草叶片为材料，对影响其随机扩增多态DNA(RAPD)反应的各因素进行优化，建立了假臭草RAPD的优化反应体系和程序，即在10 μL反应体系中，5 ng(/10 μL)模板DNA，1.0 μmol/L随机引物F15，150 μmol/L dNTPs，2.0 mmol/L Mg2+，1.0 U Taq DNA聚合酶；扩增程序为95℃预变性4 min，95℃变性40 s，36℃退火40 s，72℃延伸1 min，10个循环，后94℃变性30 s，35℃退火30 s，72℃延伸1 min，35个循环，72℃     

大豆SSR检测体系的优化研究

以大豆为试材,研究了大豆SSR检测体系中PCR扩增的各主要成分对检测结果的影响,确立了适宜的退火温度和反应体积,改进了PCR扩增程序和银染方法,进一步优化了适用于大豆的SSR检测体系.优化后的SSR反应体系为:10×Buffer 1.00μL、2.00 ng/μL模板DNA、0.15μmol/L SSR引物、150.00μmol/L dNTPs、0.50 U Taq酶、2.00mmol/L Mg2 ,加ddH20至终体积10.00μL.优化的PCR扩增程序为:94℃预变性3 min;94℃变性25s,47℃退火25s,72℃延伸30s,共35个循环;72℃延伸5min,4℃保存.优化后的检测体系更为经济有效.     

荷花ISSR—PCR反应体系的建立及优化

以荷花叶片提取的基因组DNA为材料,通过对影响ISSR—PCR扩增效果的一些因素,如dNTPs浓度、Mg2＋浓度、TαDNA聚合酶用量、引物用量、模板DNA用量以及退火温度等进行筛选和优化,确立了可用于荷花ISSR—PCR分析的最适宜的PCR反应体系：20μL PCR反应体积含O．4mmol·L-1 dNTPs、3．5mmol·L-1Mg2＋、1．5U TαqDNA聚合酶、0．4μmol·μL-1引物、3ng模板DNA。PCR扩增程序为：94℃预变性2min,94oC变性30s,54．5℃退火30s,72℃延伸1min,45个循环,最后72℃延伸7min,置4℃保存。应用该ISSR体系对6份荷花种质进行了扩增,证实了该体系的适用性和稳定性。     

茶树ISSR-PCR反应体系的建立

通过优化影响茶树 ISSR-PCR 的主要参数,确立了适用于茶树的 ISSR 反应体系和扩增条件。结果表明在 20 μl 反应体系中,模板 DNA、引物、Mg++、dNTP 和 Taq DNA 聚合酶五种主要成分的最适浓度分别为 10ng、150 nmol/L、1.5 mmol/L、150 μmol/L、0.5 U。在扩增过程中,引物的适宜退火温度比其 Tm 值平均高 4.5℃,扩增出足量产物至少需要 30 个热循环。利用该优化反应体系和扩增条件,对 13 份不同茶树种质资源进行ISSR-PCR 扩增,扩增产物的多态性为 77.6%。引物 TRI18 构建的 ISSR 指纹图谱,可以区分 13 份茶树资源中的 12 份,分辨率达 92.3%。     

石斛属部分植物SRAP-PCR反应体系的建立与优化

建立石斛属（Dendrobium）植物SRAP-PCR反应体系,为石斛的品种鉴定与分类提供理论和技术基础。采用单因素及正交试验对反应体系中的各因子进行优化,确定最优退火温度,并筛选有效引物。结果表明：适用于石斛属植物SRAP最佳的反应体系为：Mg²⁺ 2.5 mmol/L,dNTPs 0.25 mmol/L,Taq DNA聚合酶1.25 U,引物0.4 μmol/L,模板DNA 30 ng,10×PCR buffer 2.5 μL,其余用灭菌后的ddH₂O补足至25 μL。最优扩增程序为：94 ℃预变性5 min;94 ℃变性1 min,36 ℃复性1 min,72 ℃延伸1 min,5次循环;94 ℃变性1 min,根据不同引物的不同退火温度复性1 min,72 ℃延伸1 min,30次循环;最终72 ℃延伸7 min,保存于4 ℃恒温箱中。应用所建立的优化反应体系成功地筛选出15条多态性较高的引物。     

茶树简化EcoTILLING技术的建立

EcoTILLING(Ecotype Targeting Induced Local Lesions IN Genomes)可快速检测自然群体中的SNP(Single Nucleotide Polymorphism)等DNA变异。第一次建立了简化的茶树EcoTILLING技术体系:首先筛选扩增目的基因的特异PCR引物;然后通过CELⅠ酶切PCR产物优化实验,确定酶切时间20 min、10×buffer组成为250 mmol/L Tris-HCl(pH7.4)、150 mmol/L KCl、15 mmol/L MgSO4、4μg/mL BSA和0.04%Triton x-100,反应温度为47.5℃,酶量为1.8μL CJE(Celery Juice Extract)/10μL反应体系时,酶切的谱带信号较强、特异性高;初步确定合适的非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳检测条件为凝胶浓度5%、上样量4～5μL、有效分离长度要达到15 cm。利用上述简化的EcoTILLING对6份茶树种质870 bp的PPO基因片段实现了分型,经测序验证酶切产生的谱带与6份种质内部或不同种质间的SNP位置吻合。     

绿茶面包中儿茶素总量检测方法研究

儿茶素是茶叶的主要功能成分,本试验探讨了乙醇浸提、硫酸-香荚兰素比色法检测绿茶面包中儿茶素含量的可行性.选择95％乙醇溶液作为提取溶剂,采用3因素3水平正交试验设计方案,考察料液比、浸提温度、浸提时间对绿茶面包中儿茶素总量提取效果的影响,并对硫酸-香荚兰素比色法检测绿茶面包中儿茶素含量进行了方法学考察.结果表明,绿茶面包中儿茶素总量检测的最佳浸提条件为:料液比1:20(g·mL-1),70℃水浴浸提45 min;硫酸-香荚兰素比色方法为:取0.5 mL浸提液,加入2.5 mL1％的香荚兰素/乙醇溶液和2.5 mL30％的硫酸/乙醇溶液,在20℃下反应10～30 min,取反应液在500 nm处测定吸光度.本方法中儿茶素浓度在0.025～0.3 mg·mL-1范围内,吸光度与浓度线性关系良好(R2=0.9996),同一样品重复测定6次的RSD为1.31％,儿茶素高、中、低浓度加标回收率范围在98.75％～103.25％,本方法满足绿茶面包中儿茶素总量的检测分析,儿茶素含量可作为标定绿茶面包中茶叶添加量的评价指标.     

A Simple Method for Preparation of Rice Genomic DNA

The extraction of DNA is often the most time consuming and laborious step in high-throughput molecular genetic analysis and marker assisted selection(MAS)programs.A simple method for preparation of rice genomic DNA was developed.A small amount(1-50 mg)of leaf tissue of rice seedling,500μL of extraction buffer,and one steel bead were put into a 2-mL microcentrifuge tube.After vigorously mashing for 2 min,5μL of supernatant was directly applied to PCR amplification.Otherwise,the supernatant was precipitated with two times volume of ethanol to obtain high quality genomic DNA.This method is simple,rapid,low cost,and reliable for PCR analysis.One person can manipulate as many as 96 samples for PCR in 10 min.It is especially suitable for genotyping of large number of samples.