苹果茎痘病毒病原学研究初报

对从苹果上获得的苹果茎痘病毒的分离物ASPV—MX进行了研究 ,人工接种 4科 13种草本指示植物 ,发现ASPV—MV易由汁液摩擦接种 ,能侵染一种藜 (Chenopodiummurale)、西方烟 (Nicotianaoccidentalis - 37B)、西方烟亚种 (Nicotianaoccidentalissubsp‘obligua’)、鸡冠 (Celosiacristata)、千日红 (Gomphrenaglobosa) ,尤其在西方烟及西方烟亚种上症状明显 ,这 2个西方烟可以作为ASPV的鉴别寄主和繁殖寄主 ,在这 2种烟草的接种叶上均产生坏死枯斑 ,在西方烟的系统叶上主要产生明脉现象 ,而在西方烟亚种上的系统叶上产生线纹坏死。通过试验测得ASPV的致死温度为 6 2℃ ,稀释限点为 1× 10 -2 ,体外存活期为室温约 2 4h。     

山葡萄低温诱导酵母双杂三框cDNA文库构建和VaCIPK18互作蛋白筛选鉴定

类钙调磷酸酶B亚基蛋白CBL（calcineurin B-like protein）与其互作蛋白激酶CIPK（CBL-interacting protein kinase）组成的CBL-CIPK系统，在真核生物钙信号转导及各种胁迫应答途径中发挥重要作用。采用SMART与LD-PCR技术构建了山葡萄‘双丰’（Vitis amurensis Rupr. ‘Shuangfeng’）叶片组织低温胁迫下的均一化酵母双杂交三框cDNA文库，库容量分别为1.7 × 106、1.3 × 106与1.9 × 106 cfu • mL-1，外源基因插入片段长度约为500 ~ 2 000 bp，重组率为100%，符合后续双杂交筛选要求。以本课题组前期鉴定受低温诱导表达、具有核质亚细胞定位的山葡萄VaCIPK18全长（VaCIPK18）、激酶结构域缺失（VaCIPK18△S_TKc）以及NAF结构域缺失（VaCIPK18△NAF）为诱饵，进行酵母双杂交筛选，获得了17个候选互作靶蛋白；从中选取并克隆了7个参与非生物胁迫的候选互作蛋白进行酵母回转验证，仅发现1个ABA信号通路上游信号调节因子VaPYL9与VaCIPK18有互作关系。通过酵母双杂交和双分子荧光互补验证，确定了VaPYL9可与VaCIPK18和VaCIPK18△NAF在酵母中物理互作，而在植物拟南芥原生质体中VaPYL9与VaCIPK18△S_TKc和VaCIPK18△NAF互作，但与全长VaCIPK18不互作。     

利用酵母双杂交系统筛选金针菇DASH型隐花色素互作蛋白

提取金针菇（Flammulina filiformis）单核体菌株Dan 3菌丝的总RNA，分离纯化mRNA，合成双链cDNA，依次构建酵母双杂交初级和次级cDNA文库。通过酶切连接法构建诱饵载体pGBKT 7-CRY，其无自激活活性和毒性，与构建的次级cDNA文库共转化酵母感受态细胞，筛选与金针菇DASH型隐花色素（FfCRY-DASH）互作的蛋白，对筛选到的6个蛋白进行回补验证，最终发现一个与金针菇DASH型隐花色素互作的蛋白。     

月季RhNAC31互作蛋白的筛选及分析

为了进一步研究RhNAC31在胁迫响应中的作用机制，以RhNAC31蛋白为诱饵，利用酵母双杂交系统在切花月季‘萨曼莎’失水胁迫cDNA文库中进行了互作蛋白的筛选和分析。根据RhNAC31的转录激活区域（C端，157 ~ 286 aa）的序列特征，将其划分为C1（157 ~ 250 aa，RhNAC31-C1）和C2（251 ~ 286 aa，RhNAC31-C2）两段，分别构建到pGBKT7上检测其自激活活性及对酵母Y2H Gold细胞的毒性。结果显示，pGBKT7-RhNAC31-C1和pGBKT7-RhNAC31-C2对酵母Y2H Gold细胞均没有毒性，能激发金担子素A（Aureobasidin A，AbA）报告基因的表达，具有自激活活性，在含有400 ng ? mL-1 AbA的SD缺陷型培养基上其活性受到抑制，以含该浓度AbA的培养基作为筛选文库培养基。在此筛选条件下，在酵母双杂交文库中筛选到21个阳性克隆，对其测序并用Blast比对获得了16个与RhNAC31互作的候选蛋白。利用Uniprot网站对互作蛋白进行基因本体学分析，结果显示RhNAC31能够与RZFP34、MIEL1、RUB泛素连接酶E3、SGT1蛋白、DnaJ蛋白等多种蛋白相互作用，可能参与糖脂生物合成、蛋白质泛素化、植物防御、叶绿素生物合成、模式识别受体信号通路、蛋白质折叠、乙烯生物合成、胁迫响应等生物学过程。     

苹果花粉中与花柱S-RNase互作的γ–硫堇筛选及鉴定

 以‘国光’苹果（S1S2）花粉为材料,成功构建了酵母pGADT7-cDNA文库,转化效率约为1.2 × 106 · μg-1,插入片段大小在300 ~ 2 000 bp之间。通过酵母双杂交方法,用苹果S2-RNase的C2HVC3区筛选文库获得一个长505 bp的cDNA片段,经分析发现该cDNA序列上有一个261 bp的开放阅读框（ORF）,该ORF编码一个具N端信号肽的多肽,该成熟多肽由64个氨基酸组成,富含带正电荷的赖氨酸和精氨酸,其C端有8个半胱氨酸和一个γ–硫堇功能域,结构预测显示其具有一个α螺旋,3个β折叠,4个二硫键,由此,推断其为苹果γ–硫堇,命名为MdD1。RT-PCR分析发现：MdD1基因在‘国光’苹果叶片、萼片、花瓣、子房、花药和花柱等组织中都有表达,但花药中表达量最高。酵母双杂交结果表明MdD1除了与苹果S2-RNase的C2HVC3区互作外,还与S1-RNase的C2HVC3区,S1、S2-RNase的成熟多肽区存在互作。初步认为：苹果γ–硫堇可能通过与S-RNase非特异性互作,作为花粉非S因子参与自交不亲和反应。     

苹果花粉中与花柱S-RNase互作的γ-硫堇筛选及鉴定

以‘国光’苹果（S1S2）花粉为材料,成功构建了酵母pGADT7-cDNA文库,转化效率约为1.2×106.μg-1,插入片段大小在300~2000bp之间。通过酵母双杂交方法,用苹果S2-RNase的C2HVC3区筛选文库获得一个长505bp的cDNA片段,经分析发现该cDNA序列上有一个261bp的开放阅读框（ORF）,该ORF编码一个具N端信号肽的多肽,该成熟多肽由64个氨基酸组成,富含带正电荷的赖氨酸和精氨酸,其C端有8个半胱氨酸和一个γ-硫堇功能域,结构预测显示其具有一个α螺旋,3个β折叠,4个二硫键,由此,推断其为苹果γ-硫堇,命名为MdD1。RT-PCR分析发现：MdD1基因在‘国光’苹果叶片、萼片、花瓣、子房、花药和花柱等组织中都有表达,但花药中表达量最高。酵母双杂交结果表明MdD1除了与苹果S2-RNase的C2HVC3区互作外,还与S1-RNase的C2HVC3区,S1、S2-RNase的成熟多肽区存在互作。初步认为：苹果γ-硫堇可能通过与S-RNase非特异性互作,作为花粉非S因子参与自交不亲和反应。     

通辽市塞外红苹果中3种苹果潜隐病毒的检测及变异分析

【目的】明确通辽地区塞外红苹果（Malus pumila ‘Saiwaihong’）中苹果褪绿叶斑病毒（ACLSV）、苹果茎痘病毒（ASPV）和苹果茎沟病毒（ASGV）3种苹果潜隐病毒的普遍率和遗传多样性。【方法】从通辽市开鲁县8个乡镇随机采集了96份塞外红苹果枝条，采用RT-PCR法对样品进行3种苹果潜隐病毒检测。对检测为阳性的样品进行病毒基因克隆、测序，并进行序列一致性分析和系统发育分析。【结果】检测结果表明，被检测的塞外红苹果中3种苹果潜隐病毒均有不同程度的发生，并且存在2种或3种病毒的复合侵染。基于CP基因对病毒一致性和变异情况进行分析，结果表明，来源于塞外红苹果的29个ACLSV分离物的核苷酸序列一致性为78.1%～99.9%，与其他15个已知的ACLSV分离物的一致性为69.1%～93.6%；来源于塞外红苹果的12个ASPV分离物的核苷酸序列一致性为83.6%～99.7%，与其他15个已知的ASPV分离物的一致性为75.4%～91.5%；来源于塞外红苹果的21个ASGV分离物的核苷酸序列一致性为96.4%～100.0%，与其他已知的40个ASGV分离物的一致性为89.9%～...     

欧洲葡萄VvJAZ9基因互作蛋白的筛选与验证

【目的】探究葡萄JAZ家族基因特点及在低温胁迫下的表达情况，以期筛选出与低温胁迫相关的家族成员，并进一步筛选其互作蛋白，为后续葡萄抗寒机制研究提供理论依据。【方法】以拟南芥和葡萄基因组数据为基础，获得葡萄JAZ家族成员基因并进行同源克隆、染色体定位、理化性质以及蛋白家族聚类等分析，利用实时荧光定量PCR(quantitative real-time PCR,qRT-PCR)技术分析VvJAZ家族成员基因在低温胁迫下的表达情况，应用酵母双杂交技术进行互作蛋白筛选和验证，并通过双分子荧光互补试验验证候选互作蛋白与VvJAZ9蛋白的互作关系。【结果】葡萄中有11个JAZ家族基因，随机分布于7条染色体上，都具有JAZ家族蛋白中特有且高度保守的TIFY和Jas结构域，均属于碱性不稳定亲水蛋白；聚类分析表明，葡萄JAZ家族蛋白可分为3个亚族，其中VvJAZ9与拟南芥AtJAZ1和AtJAZ2的亲缘关系最近，VvJAZ1与VvJAZ11、VvJAZ5与VvJAZ6同源关系最近。qRT-PCR结果表明，VvJAZ9是葡萄JAZ家族成员基因中受低温诱导表达最为明显的1个基因。通过酵母双杂交试验筛选获得2...     

苹果茎痘病毒内蒙古分离物基因组序列和生物学特征研究

利用RT-PCR结合RACE技术获得了苹果茎痘病毒(Apple stem pitting virus,ASPV)内蒙古‘金红’苹果分离物(ASPV-NM)全长基因组序列(登录号:MK239268)。该分离物基因组除去Poly A尾共有9 286个核苷酸,与17个已经报道的ASPV分离物全长基因组序列核酸一致性为70.6%～79.2%;基于全长基因组、RNA依赖的RNA聚合酶(RNA-dependentRNApolymerase,RdRp)基因和外壳蛋白(Coatprotein,CP)基因分别将分离物ASPV-NM划分到组Ⅲ、组Ⅲ和组Ⅰ;在ASPV-NM基因组中检测到1个显著的重组事件;将ASPV-NM摩擦接种到西方烟37B上,可引起显著的褪绿黄化症状,利用透射电子显微镜可以观察到典型的病毒粒子。     

砂梨上苹果茎痘病毒的调查分析及RT-PCR与TC-RT-PCR检测研究

试验通过西方烟(Nicotianaoccidentalis‘37B’)和杂种(Pyroniaveitchii)、A20接种鉴定及PAS-ELISA检测,对保存于国家砂梨种质资源圃的38份砂梨样品进行了苹果茎痘病毒(Applestempittingvirus,ASPV)带毒率的调查分折。结果表明,生物学鉴定与血清学检测结果一致,ASPV带毒率均为26.3%。应用以dsRNA为模板RT-PCR检测该病毒,在杂种和A20上显症的6个样品均获得316bp目标片段。应用TC-RT-PCR检测显症的西方烟,也获得了预期的目标片段。     

苹果茎痘病毒RT-PCR检测及分子变异分析

利用RT-PCR技术对采自6个苹果品种和7个梨品种的33个样本中的苹果茎痘病毒(Apple stem pitting virus, ASPV) 进行了检测, ASPV感染率为63% ( 19 /33) 。对6个ASPV中国分离物外壳蛋白(Coat protein, CP) 基因进行了扩增、克隆和测序, 测序结果显示CP基因全长为1 191 nt, 编码397个氨基酸。中国分离物与GenBank中其他分离物核苷酸序列同源性为70.2% ～91.7%。系统进化分析显示不同ASPV分离物分为3个大的类群, 呈现一定的寄主相关性, 并未呈现明显的地理相关性。第一和第三大类群的寄主皆为苹果, 第二大类群包含6个梨分离物和2个苹果分离物。不同ASPV分离物的抗原指数差异较大, 推断可能由于序列变异引起抗原表位变异, 从而引起血清型差异。     

节瓜CqWRKY31的互作蛋白筛选与鉴定

枯萎病是节瓜生产中的主要病害,节瓜抗性材料中CqWRKY31受致萎毒素镰刀菌酸(FA)胁迫诱导表达,为节瓜响应FA胁迫的正调控因子.为深入挖掘CqWRKY31的功能,本试验利用酵母双杂交技术筛选CqWRKY31的互作蛋白.试验结果显示,共得到45个与节瓜CqWRKY31有潜在互作关系的蛋白.通过进一步回转验证,发现42...     

青花菜AGL18及HDA9与开花信号整合子互作研究

为阐明青花菜（Brassica oleracea var. italica）开花抑制因子AGL18、HDA9与开花信号整合子AGL24以及SOC1之间的互作机制,分别克隆了青花菜AGL18和HDA9基因,它们与十字花科甘蓝、芜菁等同源性较高。AGL18编码258个氨基酸,其蛋白属于MIKC型。HDA9编码426个氨基酸,其蛋白属于HDAC亚家族。酵母双杂交及GST pull-down结果表明：AGL18与HDA9无蛋白互作,说明它们彼此间不能直接协同作用。AGL18与开花促进因子AGL19也无互作,暗示它们以相对独立的方式抑制或促进开花。HDA9与AGL24、SOC1均不能蛋白互作,然而AGL18能与AGL24蛋白互作却不能与SOC1互作,AGL24能与SOC1互作。由此表明AGL18可通过AGL24间接作用于SOC1。     

基于宏病毒组测序技术的苹果病毒病鉴定与分析

采用宏病毒组测序技术（Virome Sequencing Technology）对河南地区染病苹果树进行病毒检测与分析,从建库测序的苹果叶片中共检测出13种病毒,其中有5种苹果病毒：苹果茎沟病毒（apple stem grooving virus,ASGV）、苹果茎痘病毒（apple stem pitting virus,ASPV）、苹果褪绿叶斑病毒（apple chlorotic leafspotvirus,ACLSV）、苹果坏死花叶病毒（applenecroticmosaicvirus,Ap NMV）和苹果绿皱缩相关病毒（apple green crinkle associated virus,AGCa V）。对病毒检测结果中的5种苹果病毒进行RT-PCR验证,扩增后均获得目的条带,与宏病毒组测序检测结果一致,表明宏病毒组测序检测结果精准可靠。根据测序结果设计特异性引物对ASPV全长进行扩增,得到1条长度为9 246 nt的ASPV-HN分离物基因组,与NCBI数据库中已报道的19个ASPV分离物的基因组核苷酸序列一致性为75.48%～79.85%;宏病毒组测序拼接所得的两条长度均...     

西瓜cDNA 表达文库构建及镰刀菌致病因子FonSIX6 互作蛋白的筛选和鉴定

 尖孢镰刀菌在与寄主的相互作用中分泌几个特定的富含半胱氨酸的小分子量蛋白（15.8 ~ 29.9 kD）进入木质部中启动致病力,被称为SIX（Secreted in xylem）蛋白。其中,SIX6蛋白是一个致病因子。西瓜专化型尖孢镰刀菌Fon（Fusarium oxysporum f. sp. niveurn）是引起西瓜枯萎病的病原真菌。为了解与FonSIX6存在相互作用的西瓜蛋白及其信号传导途径,克隆了FonSIX6基因,将FonSIX6的编码区与酵母GAL4的DNA结合功能区融合,构建成酵母诱饵蛋白表达载体pGBKT7-SIX6,进而转化到酵母菌株Y2H Gold中,经检测证实不具有毒性和自激活功能,可以用于酵母双杂交研究。同时,以国际上公认的抗枯萎病材料PI296341-FR构建酵母表达文库。采用酵母双杂交的方法,筛选到14个相互作用靶蛋白。分析筛选到的蛋白主要参与寄主的能量代谢、光合作用和基因表达调控,推测FonSIX6作用的靶位点主要是破坏寄主能量系统并影响光合作用,而寄主对其响应的方式是调控抗病基因的表达。     

苹果茎痘病毒TaqMan探针实时荧光定量RT-PCR检测方法的建立

为建立一种检测苹果茎痘病毒（Apple stem pitting virus,ASPV）的TaqMan探针实时荧光定量RT-PCR方法,根据ASPV外壳蛋白基因（coat protein,cp）保守序列设计了特异性引物和TaqMan探针,以体外转录的RNA为标准品构建标准曲线,并对该方法的特异性、灵敏性、重复性进行检验。建立的标准曲线决定系数达0.996,扩增效率为99%;该方法特异性好,与苹果茎沟病毒（ASGV）、苹果褪绿叶斑病毒（ACLSV）、苹果锈果类病毒（ASSVd）均无交叉反应;其最低检测限为1.31 × 102 copies ? μL-1,灵敏度比常规RT-PCR高100倍;批内和批间变异系数均小于1.85%。该方法具有特异性强、灵敏度高、重复性好等优点,适用于田间样品中ASPV的快速定量检测。     

青花菜开花促进因子AGL19与整合子AGL24和SOC1的互作研究

为阐明青花菜(Brassica oleracea var.italica)开花促进因子AGL19与开花整合子AGL24和SOC1蛋白的互作机制,从青花菜中克隆了AGL19、SOC1及AGL24基因。它们分别编码221、221和214个氨基酸,均为MIKC型蛋白,并且与甘蓝、油菜、大白菜等亲缘关系较近,AGL19与SOC1同属TM3/SOC1亚家族成员。酵母双杂交表明:AGL19与AGL24蛋白能互作,激活酵母报告基因AUR1-C、HIS3、ADE2和MEL1,在QDO/X-α-Gal/Ab A平板培养基上长出蓝斑;但与SOC1蛋白不能相互作用,说明AGL19的直接靶蛋白是AGL24而非SOC1。此外,青花菜SOC1也能与AGL24蛋白互作,说明AGL19可以通过AGL24间接与SOC1相互作用。     

月季切花乙烯受体RhETR3互作蛋白RhTSPO1的筛选和鉴定

利用已构建的月季分裂泛素酵母双杂文库,以月季乙烯受体蛋白RhETR3为诱饵,筛选能够与RhETR3结合的互作蛋白。经酵母回转验证共得到26个阳性克隆。在候选蛋白中发现一个TspO/MBR蛋白家族的成员,命名为RhTSPO1。通过RACE分离了RhTSPO1基因全长,共777 bp,开放阅读框（ORF）为579 bp,编码192个氨基酸。在酵母中,利用酵母生长和β–半乳糖苷酶活性（β-gal）验证了RhETR3和RhTSPO1之间确实存在互作。将RhETR3-GFP和RhTSPO1-mCherry融合蛋白共转入烟草,激光共聚焦显微镜观察发现RhTSPO1和RhETR3蛋白共同定位于内质网上。月季花朵自然开放过程中,RhTSPO1在花瓣中的表达呈现先增强后减弱的趋势,与开放和衰老过程紧密联系,表明RhTSPO1可能参与了花朵开放过程。本试验结果表明乙烯受体蛋白水平的互作调节可能也参与月季花朵开放和衰老的调节。     

山葡萄转录因子VaMYB4a互作蛋白的筛选与鉴定

以抗寒种质山葡萄(Vitis amurensis Rupr.)‘左山–1’叶片组织为试材，通过Gateway技术构建酵母均一化cDNA文库，库容量为1.36×10⁷ cfu·mL^-1，外源基因插入片段均大于1 kb，重组率为100%，符合后续试验要求。以VaMYB4a^113-252C端调控区段为诱饵，经酵母双杂交筛选获得17个候选互作蛋白，选取2个与非生物胁迫应答密切相关的候选互作蛋白分别在酵母、拟南芥原生质体中进行互作验证，发现锌指类转录因子VaCOL4、VaCOL5均与VaMYB4a全长及VaMYB4a^113-252存在互作关系。经系统进化与蛋白保守结构域分析，推测葡萄COL基因家族中VaCOL2与VaMYB4a具有潜在互作关系，进而通过BiFC验证表明，VaCOL2与VaMYB4发生蛋白互作；顺式作用元件预测表明VvCOL2、VvCOL4与VvCOL5启动子区包含多个激素及逆境应答相关元件，其中VvCOL2包括多个低温响应元件(LTRE)；低温胁迫下，VaMYB4a、VaCOL4与VaCOL5...     

柑橘中黄龙病菌效应子SDE70的表达特征及寄主互作蛋白解析

柑橘黄龙病菌主要致病种亚洲种（‘Candidatus Liberibacter asiaticus’，Las）具有完整的Sec依赖型分泌系统，可分泌致病因子（效应子）作用于寄主靶标蛋白或基因，调控寄主的抗（感）病反应。为了研究黄龙病菌Sec依赖型效应子在柑橘中的致病机理及其寄主靶标基因，本研究中从感病‘锦橙’中克隆了Las病原菌Sec依赖型效应子基因SDE70（CLIBASIA_02470）。生物信息分析显示，SDE70蛋白全长132个氨基酸，N端20个氨基酸为典型信号肽。大肠杆菌碱性磷酸酶活性分析显示，该信号肽具有胞外分泌功能。亚细胞定位显示，SDE70::GFP融合蛋白在洋葱细胞质和细胞核中积累。定量PCR分析发现，耐黄龙病酸柚显症叶脉中SDE70表达量显著低于未显症叶脉，相反，易感黄龙病‘锦橙’显症叶脉中表达显著高于未显症叶脉；‘锦橙’根中SDE70表达量显著高于叶脉，而幼叶叶脉中显著低于老叶。SDE70在不同品种不同症状发育时期以及不同组织中表达差异显著。利用酵母双杂交试验筛选获得26个与SDE70互作的柑橘蛋白。GO富集分析表明，42.3%的蛋白质与细胞内生物合成过程有关；65.4%的靶标蛋白位于细胞质或质膜上；34.6%的靶标蛋白具有核糖核苷酸结合的分子功能。进一步酵母点对点杂交试验验证3个与SDE70效应子强相互作用的靶标蛋白（CsTRAPP、CsARF、CsRub1），其主要参与植物囊泡转运、类泛素化等过程，暗示SDE70效应子极有可能调控柑橘信号转导和胞质运输途径影响寄主抗（感）病反应。