青花菜开花促进因子AGL19与整合子AGL24和SOC1的互作研究

为阐明青花菜(Brassica oleracea var.italica)开花促进因子AGL19与开花整合子AGL24和SOC1蛋白的互作机制,从青花菜中克隆了AGL19、SOC1及AGL24基因。它们分别编码221、221和214个氨基酸,均为MIKC型蛋白,并且与甘蓝、油菜、大白菜等亲缘关系较近,AGL19与SOC1同属TM3/SOC1亚家族成员。酵母双杂交表明:AGL19与AGL24蛋白能互作,激活酵母报告基因AUR1-C、HIS3、ADE2和MEL1,在QDO/X-α-Gal/Ab A平板培养基上长出蓝斑;但与SOC1蛋白不能相互作用,说明AGL19的直接靶蛋白是AGL24而非SOC1。此外,青花菜SOC1也能与AGL24蛋白互作,说明AGL19可以通过AGL24间接与SOC1相互作用。     

芥菜AGL18家族成员与开花整合子SOC1的互作分析

为阐明芥菜开花抑制因子AGL18与开花整合子SOC1间的互作调控机制,在芥菜‘QJ’的开花期克隆了AGL18-1,幼苗期克隆了AGL18-2和AGL18-3,它们分别编码257、257和258个氨基酸,为AGL18家族的3个成员。序列比对表明,芥菜AGL18家族成员与十字花科芜菁和油菜同源性均高达90%。酵母双杂交和BiFC试验表明:芥菜AGL18-1、AGL18-2和AGL18-3蛋白与SOC1不会发生蛋白相互作用。酵母单杂交和Dual-Glo~ Luciferase试验表明:AGL18-1、AGL18-2和AGL18-3中仅有花期AGL18-1蛋白与SOC1启动子间存在互作。为进一步筛选AGL18-1/SOC1的互作区域,分别截取了AGL18-1蛋白的M域和IKC域,发现仅M域与SOC1启动子存在相互作用,说明M域是介导花期AGL18-1蛋白与SOC1启动子互作的关键区域。这为深入研究AGL18与SOC1互作的分子机制及其对开花时间的调控奠定了基础。     

芥菜开花相关基因AGL24的表达及与SOC1、SVP和FLC蛋白的互作

为阐明芥菜（Brassica juncea Coss.）开花激活因子AGL24的表达特性及其在开花途径中与调节因子SOC1、SVP和FLC蛋白的互作机制,从‘青叶芥’中克隆了680 bp的AGL24基因,它编码221个氨基酸。序列分析表明：芥菜AGL24含有M、I、K和C域,分别有59、11、102和47个氨基酸,与油菜AGL24亲缘关系较近。荧光定量PCR分析发现：在低温春化途径和长日照光周期途径中,AGL24在叶片和茎尖中均有表达,营养生长期表达量较低,而生殖生长期表达量迅速增加;AGL24在光周期途径中的表达峰值要早于低温春化途径。酵母双杂交试验表明：全长AGL24与开花信号整合子SOC1蛋白能够互作,激活酵母报告基因AUR1-C、HIS3、ADE2和MEL1,在QDO/X-α-Gal/AbA平板培养基上长出蓝斑。另外,分别去掉M域后的截短体AGL24与SOC1也能相互作用。β–半乳糖苷酶活性检测发现：截短体杂交组合AGL24 × SOC1的互作强度显著高于全长杂交组合AGL24 × SOC1。然而全长AGL24或截短体AGL24 均不能与光周期途径核心抑制子SVP互作,也不与低温春化途径核心抑制因子FLC相互作用,说明AGL24并不是SVP或FLC的直接靶蛋白。     

芥菜开花整合子SOC1与AGL24蛋白K结构域的互作位点鉴定

芥菜开花整合子SOC1与AGL24相互作用能够调节开花时间。为了深入研究SOC1与AGL24蛋白互作的分子机理,利用ISIS系统在线预测了SOC1/AGL24互作位点,并分别在MIKC型蛋白SOC1和AGL24的K域构建了5个SOC1突变体和3个AGL24突变体。酵母双杂交和β–半乳糖苷酶活性检测表明：突变体AGL24R137L和AGL24E169L能够与SOC1蛋白互作,但作用强度与SOC1/AGL24差异不显著;然而AGL24蛋白第107位的谷氨酰胺突变为亮氨酸后（AGL24Q107L）,则与SOC1的作用消失。说明SOC1/AGL24的作用强度能够被AGL24蛋白K域第107位调节,但可能不受第137和169位调控。进一步研究发现：SOC1V77K、SOC1P81K、SOC1K108V、SOC1R109L和SOC1C137K突变体均能与AGL24相互作用;但SOC1V77K、SOC1P81K、SOC1K108V和SOC1R109L突变体与AGL24的作用强度均显著低于SOC1/AGL24,而SOC1C137K突变体与AGL24的作用显著高于SOC1/AGL24。说明SOC1/AGL24的作用强度能够被SOC1蛋白K域第77、81、108、109位负调控或者第137位正调控。这为利用氨基酸位点调节SOC1/AGL24的深入研究及其开花时间分子调控奠定了基础。     

开花整合子SOC1 花期调控的分子机制

植物经过长期的发育进化,形成了一套复杂而精细的基因调控网络,以确保植株能在最佳
时间开花。开花时间是由一系列特定的基因在特定的时空环境下表达及相互作用所决定的。植物开花调
控的分子机理是最近研究的热点之一。本文综述了开花整合子SUPPRESSOR OF OVEREXPRESSION OF
CONSTANS1（SOC1）的功能,以及与其他相关调控信号之间的作用关系：SOC1 作为一个MADS 转录因子,
它能够整合来自四条开花调控途径（光周期途径,自主途径,春化途径,赤霉素途径）的开花信号,促进
开花。它的上游基因CO、FT、SPL 以及赤霉素信号可以上调SOC1 的表达,但SVP、FLC 却下调SOC1
的表达;SOC1 和AGL24 之间能形成正反馈回路,同时SOC1 和AGL24 蛋白还可以相互作用激活下游基
因LFY 的表达,调节下游花器官特征基因,实现花期调控。     

森林草莓FvbHLH130转录因子调控植株提前开花

分析草莓碱性螺旋—环—螺旋（basichelix-loop-helix,bHLH）转录因子家族,鉴定到森林草莓（Fragaria vesca）花特异表达的转录因子基因FvbHLH130。FvbHLH130编码区序列长度为960 bp,编码319个氨基酸,保守结构域预测结果显示第247～297 aa是bHLH结合域,其属于bHLH家族成员。FvbHLH130启动子含有生长素等激素响应、逆境胁迫和低温响应元件,推测基因表达可能受到生物和非生物胁迫诱导。FvbHLH130蛋白氨基酸序列与月季（Rosa chinensis）的相似性高达93.70%,与其他蔷薇科bHLH蛋白聚在一个分支上,与拟南芥AtFBH4是同源蛋白。农杆菌介导的FvbHLH130拟南芥转基因株系提前7 d开花,且促进开花相关基因AtAP1、AtFT、AtFUL和AtCO的表达。酵母双杂交实验结果表明FvbHLH130与FvARF4和FvARF6互作,可能作为蛋白复合体共同参与开花调控。     

芥菜开花整合子SOC1启动子的克隆及其与FLC、SVP蛋白互作的研究

为了深入研究芥菜开花整合子SOC1基因的表达调控机制,利用染色体步移法从芥菜‘QJ’中克隆了SOC1编码区上游782 bp的启动子,并构建SOC1基因启动子的酵母表达载体pAbAi-SOC1,与蛋白表达载体pGADT7-FLC、pGADT7-SVP共转化酵母Y1HGold菌株。酵母单杂交表明：芥菜FLC和SVP蛋白均能与SOC1的启动子相互作用。进一步分析发现：SOC1启动子含3个CArG-box表达调控基序。分别亚克隆这3个基因片段（SOC1-1、SOC1-2和SOC1-3）,并再次构建酵母重组质粒pAbAi-SOC1-1、pAbAi-SOC1-2和pAbAi-SOC1-3,与pGADT7-FLC、pGADT7-SVP分别融合到Y1HGold菌株。融合菌株均能在相应SD/-Leu/AbA培养基上生长,说明SOC1-1、SOC1-2和SOC1-3都能被芥菜FLC、SVP蛋白识别并结合。再次构建SOC1-1、SOC1-2、SOC1-3的CArG-box删除突变体及A-T互换突变体,则均不能与FLC、SVP蛋白互作。由此说明：SOC1-1、SOC1-2和SOC1-3的3个CArG-box基序确实能特异性识别FLC、SVP,发生DNA-蛋白相互作用。这为利用启动子调控SOC1基因的转录表达等深入研究奠定了理论基础。     

拟南芥和芥菜开花抑制因子AGL18花期调控机制研究进展

十字花科作物开花主要受低温春化途径、光周期途径、自主途径和赤霉素途径的信号因子调节,但这些开花信号因子均汇集到开花整合子路径,最终调控开花时间。MADS家族在该发育途径中起着至关重要的作用,最近发现AGL18是一个与开花整合子关系密切的MADS家族成员。综述了拟南芥和芥菜等十字花科作物AGL18在开花途径中的作用及其开花调控分子机制,并展望AGL18开花转变调控的研究方向,为十字花科蔬菜的成花转变及产品器官发育等分子调控提供借鉴。     

黄瓜MADS-box基因家族生物信息学分析及CsMADS-box AGL62的克隆

分别以全雌系D1104-2-4、强雌系D1158♀-2、雌雄异花同株D0528-2为母本,与1个雌雄异花同株父本D0708-2杂交获得杂种一代,调查开花初期、根瓜期、盛果期3个时期雌性相关农艺性状,筛选出差异显著的组合进行转录组测序分析进而分析黄瓜杂交组合间MADS-box家族的差异基因。结果表明:以全雌系D1104-2-4为母本的杂种一代C15-114在雌花数、雌花节率上均具有超亲优势,3个杂交组合F1均具有早熟的中亲优势。转录组分析结果发现,以全雌系D1104-2-4为母本的杂种一代基因表达情况显著的偏向母本,挑选的37个黄瓜MADS-box家族基因只有6个与母本有表达差异,17个与父本有表达差异。生物信息学分析并命名了1个差异最显著的基因Cs MADS-box AGL62,该基因全长745 bp,编码187个氨基酸,编码的蛋白属于线粒体中不稳定的亲水性跨膜蛋白,NCBI比对结果表明该蛋白是1个转录因子,系统进化分析发现其与甜瓜中AGL62同源性最高,在黄瓜中该蛋白和其他黄瓜AGL62亚型属于同一分支并且属于I型。     

白菜翻译起始因子eIF(iso)4E.a/c与芜菁花叶病毒TuMV-C4/UK1蛋白互作分析

为阐明白菜翻译起始因子异构体eIF(iso)4E的表达特性,以及该异构体与芜菁花叶病毒(TuMV)的互作关系,在白菜‘极早春’中克隆了eIF(iso)4E.a基因,在‘BP8407’中克隆了eIF(iso)4E.c基因。这两个基因长度一致,均编码200个氨基酸。酵母双杂交和双分子荧光互补试验表明:eIF(iso)4E.a仅与TuMV-C4株系互作,而不与TuMV-UK1株系互作;eIF(iso)4E.c仅与TuMV-UK1株系互作,而不与TuMV-C4株系互作。对白菜eIF(iso)4E蛋白氨基酸序列及空间结构分析发现:eIF(iso)4E蛋白包含帽结合蛋白结构,eIF(iso)4E.a和eIF(iso)4E.c蛋白间存在20个差异氨基酸,其中17个差异氨基酸位于帽结合蛋白结构上;TuMV-C4 VPg与TuMV-UK1 VPg蛋白有4个氨基酸差异位点。通过对TuMV不同株系的VPg蛋白(病毒基因组连接蛋白)氨基酸序列频率分析发现,在4个氨基酸差异位点处,氨基酸的使用频率具有选择性。     

羽衣甘蓝甘油-3-磷酸酰基转移酶基因的克隆及序列分析

以羽衣甘蓝品种白孔雀为试验材料,通过同源克隆和RACE 方法从低温诱导的羽衣甘蓝幼苗中分离得到了羽衣甘蓝甘油-3-磷酸酰基转移酶（glycerol-3-phosphate acyltransferase,GPAT）基因的全基因序列,采用生物学软件对该序列 进行生物信 息学分析。结果表明：该基因全长1 558 bp,推测其编码451 个氨 基酸,并命名为BaGPAT。序列分析发现,羽衣甘蓝BaGPAT 基因推导的氨基酸与已知其他植物GPAT 基因序列有54%～85% 的相似性。聚类分析结果显示：羽衣甘蓝GPAT（BaGPAT）基因与拟南芥和宽叶独行菜GPAT 基因亲缘关系较近。     

结球甘蓝花粉蛋白延伸因子基因的克隆及其序列分析

 以结球甘蓝（Brassica oleracea L. var. capitata L.）E1花粉为试材,对萌发前后的花粉总蛋白进行双向电泳及差异蛋白质谱分析,发现延伸因子BoEF-Tu蛋白在花粉萌发后较萌发前表达上调。利用同源克隆得到甘蓝BoEF-Tu基因的全长cDNA序列,其长度为1 728 bp,具有一个完整开放阅读框（ORF）,位于112 ~ 1 473 bp处,编码453个氨基酸残基,预测分子量为49.17 kD,等电点为6.52。生物信息学分析表明：BoEF-Tu蛋白含有9个α–螺旋结构,18个β–折叠结构,不含信号肽和跨膜区,在106 ~ 121位氨基酸残基处有1个GTP结合区域（DKAPEEKKRGITIATA）。氨基酸同源性分析表明,BoEF-Tu与拟南芥EF-TuM同源性较高,达到93%;系统进化分析表明,BoEF-Tu与拟南芥EF-Tu的亲缘关系最近。     

甘蓝开花抑制因子FLC 家族氨基酸序列差异及其对FLC/SVP 聚合化的影响

 为深入研究甘蓝Flowering Locus C（FLC）家族与SHORT VEGETATIVE PHASE（SVP）蛋 白互作的分子机理及其对开花的调控作用，从甘蓝‘ZQ-67’材料中克隆了5 个FLC 家族基因（记为 BoFLCy1 ~ BoFLCy5）。它们均编码MIKC 型蛋白，按进化关系其编码蛋白可分为两类：BoFLCy3 和BoFLCy5 为第Ⅰ类，仅在C 域有1 个位点变异；BoFLCy1、BoFLCy2 和BoFLCy4 为第Ⅱ类，仅在K、C 域分别有1、 2 个位点变异。酵母双杂交显示：甘蓝BoFLC 家族蛋白均可与BoSVP 蛋白互作；但BoFLCy4 蛋白最为敏 感，其N 端插入3 个氨基酸TET 会破坏该作用。β–半乳糖苷酶活性分析表明：BoFLCy1 ~ BoFLCy5 与 BoSVP 互作强度差异显著，强弱关系为：BoFLCy1 > BoFLCy2 > BoFLCy3 > BoFLCy5 > BoFLCy4，该家族蛋 白KC 域内的变异位点若为疏水氨基酸则有利于FLC/SVP 聚合。进一步分析突变BoFLCy4 蛋白IK 域内 的保守位点发现：蛋白作用强度可能不受I 域的这些保守性亲（疏）水氨基酸（第63、77 位）影响，而 会受到K 域保守氨基酸（第120、121、135、157 位）的亲（疏）水性调节。     

利用芥蓝×青花菜DH群体构建AFLP连锁图谱

 利用青花菜(Brassica oleracea var. italica) 与芥蓝(Brassica oleracea var. alboglabra) 杂交后代双单倍体(DH) 群体为材料, 通过AFLP技术构建了一个甘蓝类作物较高密度的遗传连锁图谱。该图谱包括9个主要连锁群及2个小连锁群, 总图距801.5 cM, 含337个AFLP标记, 标记间平均距离为3.6 cM,为甘蓝类作物基因定位、比较基因组学及重要经济性状QTL分析提供了一个框架图谱。     

芥蓝×甘蓝的F2群体抽薹期性状QTLs的RAPD标记

 利用芥蓝C1 12×甘蓝秋缸Ⅵ杂交组合的F2作图群体的RAPD标记连锁图进行了19个农艺学性状的QTL定位研究，在9个连锁群上共定位了28个QTL位点。其中控制抽薹期、开花期、株高(4月27日调查)的QTL各3个；控制伸展度、株高(4月20日调查)、叶柄长QTL各2个；控制茎高、叶数、叶宽(4月27日调查)的QTL各1个；控制叶宽(5月11日调查)的QTL有5个。