篦子三尖杉产高三尖杉酯碱内生真菌的分离与鉴定

为从药用植物篦子三尖杉中分离筛选产高三尖杉酯碱的内生真菌,采用枝叶外植体表面消毒后接种在PDA平板基上培养的方法分离筛选内生真菌,并对分离菌株进行了HPLC分析和ITS分子鉴定。结果表明:筛选出的10个菌株菌落形态和显微结构有明显差异,其中,gyzy-7、gyzy-8、gyzy-9和gyzy-11具产孢结构;gyzy-6、gyzy-8和gyzy-9可产生高三尖杉酯碱;gyzy-6为裂褶菌属,gyzy-8为叶点霉属,gyzy-9为平革菌属真菌。从篦子三尖杉中初步分离出产高三尖杉酯碱的内生真菌。     

篦子三尖杉内生真菌gyzy-9的鉴定及其抑菌活性研究

为研究濒危药用植物篦子三尖杉(Cephalotaxus oliveri Mast)内生真菌gyzy-9的发酵产物及其抑菌活性,对其发酵产物进行了HPLC分析,并对其抑菌活性进行了纸片法检测,同时还对菌株gyzy-9的ITS序列进行了聚类分析。HPLC分析结果表明,菌株gyzy-9能够产生高三尖杉酯碱(Homoharringtonine),其发酵液对表皮葡萄球菌(Staphylococcus epidermidis)、提取物对枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)的抑菌效果较强,抑菌圈直径均大于15 mm。对gyzy-9菌株ITS序列的系统发育聚类分析结果表明,gyzy-9为平革菌属(Phanerochaete sp.)真菌。对此菌株的研究为进一步研发生产三尖杉药用活性成分提供了条件。     

内生真菌gyzy-20生产高三尖杉酯碱的成分分析及条件优化

[目的]为充分发掘篦子三尖杉（Cephalotaxus oliveriMast）内生真菌的应用价值。[方法]采用HPLC对内生真菌菌株gyzy-20的发酵提取组分进行鉴定,并采用正交试验进一步优化生产工艺。[结果]菌株gyzy-20的代谢产物中有高三尖杉酯碱生成,提取时间对高三尖杉酯碱含量的影响较大。优化的生产工艺为：碳源为葡萄糖,发酵10 d后超声5 min,添加2倍体积二氯甲烷萃取3 h,优化后的发酵和提取方法可提高高三尖杉酯碱的含量1.5倍以上,达到0.26μg/ml。[结论]该研究可为利用微生物发酵生产HHT提供可能。     

篦子三尖杉内生真菌的分离鉴定和抑菌活性分析

珍稀濒危药用植物篦子三尖杉(Cephalotaxus oliveri Mast)是临床白血病药物三尖杉酯碱和高三尖杉酯碱的重要来源,因此,篦子三尖杉的内生真菌具有潜在的药用价值.通过从篦子三尖杉中分离纯化,筛选出16株外观差异较大的菌株,其中4株无产孢结构.经显微结构和ITS分子鉴定,发现其中11株属于链格孢属.抑菌试...     

篦子三尖杉产高三尖杉酯碱内生真菌的分离和筛选

为了从珍稀濒危药用植物篦子三尖杉中分离、筛选产高三尖杉酯碱(homoharringtonine,HHT)的内生真菌,通过分离培养,获得20株培养性状不同的菌株,皆未发现产孢结构。PDA液体发酵后提取和浓缩各菌株的总生物碱成分,HPLC分析发现,菌株12号和20号在HHT保留时间(2.532 min)上有显著吸收峰,保留时间分别为2.493和2.563 min。初步表明,该菌株具有HHT生产能力,可为深入研究微生物源药用活性成分HHT提供可能。     

2年生三尖杉生长和2种酯碱种源变异及初步选择

为了探讨三尖杉Cephalotaxus fortunei幼龄收获阶段生长、干物质积累和药用成分等种源变异和地理模式,并为福建明溪选育出多个药用优良种源,在福建明溪、浙江淳安和安吉等3个地点开展种源区域试验。研究结果表明,2年生三尖杉树高、地径、分枝数、各器官干物质积累量以及枝、叶药用成分均存在显著的种源变异。三尖杉生长和干物质积累量的种源分化可较多地归因于长叶和短叶类型间的差异。较之于短叶类型三尖杉种源,长叶类型三尖杉种源的生长和干物质积累量大,其种源间分化也较大。除种源效应外,栽植地条件对三尖杉生长影响显著。测定结果表明,不同类型间叶片三尖杉酯碱和高三尖杉酯碱质量分数差异较小,而枝条2种酯碱质量分数差异却较大,且长叶类型枝条的2种酯碱质量分数均值高于短叶类型。相关分析发现,种源干物质积累量和枝叶2种酯碱质量分数较多地受其产地经度的控制,而与产地纬度的相关性较小。根据福建明溪点的测试结果,以枝叶三尖杉酯碱和高三尖杉酯碱产量为选育指标选择出福建武夷山、柘荣等优良药用种源。表8参14     

三尖杉内生真菌的遗传多样性研究

本研究以三尖杉的根、茎、叶中分离的91株内生真菌为材料,根据其菌落颜色、质地、生长速率和分生孢子外观等形态学特征,确定了其中74株产孢内生真菌为5个属.采用特异性PCR对91株菌株的ITS片段进行扩增,获得单一的分子长为600bp的条带,以4种限制性内切酶对扩增的ITS片段进行RFLP分析,并对部分ITS碱基序列进行测定,表明三尖杉内生真菌的属和种丰富,其中的优势属为刺盘孢属、曲霉属及小丛壳属,表现为热带真菌类型;小丛壳属是首次从三尖杉科植物中分离.本研究结果提示三尖杉内生真菌有丰富的遗传多样性.     

高三尖杉酯碱注射液含量的毛细管电泳法测定

建立了高三尖杉酯碱注射液中高三尖杉酯碱含量测定的高效毛细管电泳法。磷酸二氢钠-硼砂为电泳介质,乙醇为有机添加剂,在20kV高压,pH6.98的条件下检测了高三尖杉酯碱注射液中高三尖杉酯碱含量。在最佳的试验条件下,高三尖杉酯碱标准品峰面积（y）与质量浓度（p）之间呈现良好的线性关系,该法的线性范围为0.005-0.080mg.L^-1。着重探讨了缓冲溶液浓度、种类、酸碱度及其操作电压对检测的影响,结果表明毛细管电泳法测定高三尖杉酯碱注射液的含量,不仅操作简单、准确,而且重复性好。     

海南粗榧扦插繁殖技术

海南粗榧（C．mannii或Cephalotaxus hainanensis Li）是粗榧属（即三尖杉属）植物中分布最南的一个种，为常绿乔木。其根、茎、叶和果实都含有生物碱，尤以主干树皮部位含量最高，主要成分为三尖杉碱、三尖杉酯碱、高三尖杉酯碱、异三尖杉酯碱和脱氧三尖杉酯碱。这些成分具有较强的抗癌功效，其中三尖杉酯碱和高三尖杉酯碱己在临床广泛应用，因此，海南粗榧被称为“抗癌奇木”。此外，海南粗榧的木材材质均匀、纹理细密。目前海南粗榧已经列入中国植物红皮书中，被确立为国家二类保护植物。     

福建三尖杉活性成分研究 Ⅰ.三尖杉酯碱的提取与光谱鉴定

采用乙醇回流提取法得到三尖杉药用成分的粗提物,然后利用有机物梯度萃取、逆流分布法分离,结合氧化铝柱和薄层层析法对粗提物进行分离提纯,最后利用四大光谱:质谱(MS)、红外光谱(IR)、紫外光谱(UV)和核磁共振光谱(NMR)对提纯的化合物进行结构鉴定,确定三尖杉体内含有抗癌活性成分三尖杉酯碱。     

几株鸽新城疫病毒的核酸和蛋白质多态性分析

以La Sota毒株和分离到的4株分别来源于信鸽、肉鸽和鸡的新城疫毒株为研究对象，设计了3对引物用反转录－聚合酶链反应（RT－PCR）对它们的融合蛋白基因（F）进行分段扩增，并且采用SDS－PAGE进行结构蛋白分析。两者的综合结果显示毒株之间存在着差异关系，具有显著的多态性；来源于肉鸽的毒株与La Sota株最为接近，而来源于鸡的强毒株与La Sota株差异最显著；来源不同的2株信鸽之间有程度较轻的差异，肉鸽和信鸽的毒株之间差异较为明显，鸽新城疫和鸡新城疫之间的差异关系较为复杂。表明新城疫病毒存在高度变异性。     

紫陀螺菌菌株的分离及鉴定

采用5种培养基配方,对紫陀螺菌子实体不同生长期的不同部位及菌根、菌索进行组织分离,结果从子实体得到的菌丝生长缓慢,菌丝致密,从菌根和菌索得到的菌丝生长快,絮状不致密。以紫陀螺菌干子实体DNA为参照样品,对得到的相关分离纯培养物进行亲菌鉴定。供试的26条随机引物中,有8条对所有供试样品可扩增出清晰、稳定的DNA指纹图谱,且从子实体分离得到的菌丝体DNA指纹与干子实体的基本一致。聚类分析结果表明,从子实体不同生长期得到的2个菌株相似系数0.979,它们与干子实体间的相似系数为0.884,从菌根和菌索得到的分离物与干子实体间的相似系数为0.389。结果表明,从子实体分离得到的2个菌株与对照物相似度最高,可以认定是紫陀螺菌的纯培养物。     

影响梨叶片高频不定梢再生因素的研究

研究了基因型、基本培养基、植物生长物质、叶片接种方法及光、暗培养条件等因素对梨叶片不定梢再生的影响。基因型对叶片不定梢再生影响最大,安久和丰水的再生率最高,可达100%,其次为鸭梨,为80%,黄金梨的再生率最低,仅为27.3%。不同基因型其获得最高不定梢再生率所需附加的植物生长物质不同。TDZ比BA更有利于鸭梨叶片的高频不定梢再生,而BA更有利于西洋梨和砂梨叶片的不定梢再生。暗培养3周后再转光下培养比直接光培养有利于不定梢的再生,叶片接种方法对再生率无明显影响。     

回头岸礁区4 种造礁珊瑚中可培养细菌的多样性

采用稀释涂布平板法,分离三亚鹿回头岸礁区4种造礁珊瑚及其周围海水中的细菌,并基于16S r RNA基因序列进行了系统发育分析,从而探讨造礁珊瑚中可培养细菌的物种多样性。从澄黄滨珊瑚(Porites lutea)、鹿角珊瑚(Acropora sp.)、盔形珊瑚(Galaxea sp.)、扁脑珊瑚(Platygyra sp.)样品中分别分离获得细菌60、61、54、20株,从珊瑚周边海水中分离获得细菌31株。16S r RNA基因序列分析表明,珊瑚来源的细菌分布于放线菌门(Actinobacteria)、α-变形菌纲(Alphaproteobacteria)、γ-变形菌纲(Gammaproteobacteria)、厚壁菌门(Firmicutes)和拟杆菌门(Bacteroidetes)。在属级水平上对4种珊瑚及海水来源细菌群落组成分析,发现在4种珊瑚中均有分布的属有3个,为Brachybacterium、Microbacterium和Ruegeria,珊瑚来源细菌类群有一定差异。同时发现4种珊瑚来源细菌与海水来源细菌类群差异较大。在分离的菌株中,有7株菌与已有效描述的细菌物种典型菌株的全长16S r RNA基因相似性低于97%,代表着潜在新属或新种。试验结果表明,三亚鹿回头岸礁区珊瑚中存在较为丰富的细菌多样性,并潜藏较多的新物种资源。     

不同栽培方式卷丹鳞茎挥发油化学成分的GC-MS分析

采用水蒸气蒸馏法对不同栽培方式的卷丹鳞茎挥发油进行提取,并用气相色谱—质谱联用技术(GC-MS)对挥发油成分进行了分析。结果表明,从遮荫栽培的卷丹鳞茎中分离出40种化合物,并鉴定出了35种;从露地栽培的卷丹鳞茎中分离出30种化合物,鉴定出了28种;从大棚栽培的卷丹鳞茎中分离出36种化合物,鉴定出了34种。用气相色谱面积归一化法测定了各成分的相对百分含量,其中在遮荫栽培的卷丹鳞茎中检测到6种脂肪酸,占挥发油总量的71.44%;在露地栽培的卷丹鳞茎中检测到5种脂肪酸,占总量的16.94%;在大棚栽培的卷丹鳞茎中检测到6种脂肪酸,占总量的52.87%。从挥发油种类及含量因素考虑,卷丹最适宜的栽培方式为遮荫栽培。     

2002～2005年吉林省稻瘟病菌生理小种消长动态

2002～2005年在吉林省内各稻作区采集332份稻瘟病标样,分离出306个有效单孢菌株,用7个中国稻瘟病菌鉴别品种鉴定为7群29个小种,优势种群为ZD群和ZE群,其次是ZG群和ZF群;优势小种为ZG1、ZE1和ZF1。鉴定结果表明:吉林省稻瘟病菌生理小种以粳型小种为主,粳型优势种群之间的差距不显著,优势小种在不同年份、不同地区出现频率不同,强毒小种主要分布在吉林、通化地区,这也是该地区历年病害发生较重的主要原因。     

苜蓿方捆袋贮饲料品质评价

【目的】方捆袋贮是紫花苜蓿青贮模式之一,具有运输使用方便灵活等优点,然而,草捆青贮袋容易破损,导致青贮饲料内部或表面呈斑块状发霉。通过对青贮袋破损与未破损方捆苜蓿青贮饲料品质的综合评价,为紫花苜蓿青贮模式的选择及其在养殖业中的利用提供理论依据。【方法】取青贮袋破损的草捆中未发霉的青贮饲料以及青贮袋未破损的苜蓿青贮饲料,分别从草捆上、中、下三层取样,比较微生物菌落数、化学成分及pH、有机酸和氨态氮含量,使用V-Score和Kariser两种评价方法,综合评价两者的青贮发酵品质。【结果】苜蓿方捆袋贮饲料的干物质含量为43.86%-45.47%,粗蛋白含量为21%以上,中性洗涤纤维含量为35.87%-37.42%,酸性洗涤纤维含量为30.68%-31.79%,灰分含量为8.37%-8.50%,可溶性碳水化合物含量为0.46%-0.53%。青贮袋破损的未发霉苜蓿青贮饲料除了干物质含量显著低于青贮袋未破损的苜蓿青贮饲料之外,两者的各营养成分无显著差异。苜蓿方捆袋贮饲料pH值为4.63-4.72,乳酸、乙酸、丙酸和丁酸占干物质的百分比分别为6.12%-7.04%、2.41%-3.21%、0.18%-0.20%、0.67%-0.89%,氨态氮占总氮的百分比为5.33%-5.79%。青贮袋破损的未发霉苜蓿青贮饲料除了pH值和乙酸含量高于青贮袋未破损的苜蓿青贮饲料之外,两者的乳酸、丙酸、丁酸和氨态氮含量均无显著差异。未发霉的苜蓿青贮饲料中霉菌酵母菌的数量均在104cfu/FM以下。两者V-Score评分等级均属尚可,Kariser评分等级均为3级。【结论】苜蓿方捆袋贮饲料具有良好的发酵品质,方捆袋贮是较理想的苜蓿青贮模式。去除发霉部分,青贮袋破损的青贮饲料其营养成分与青贮袋未破损的苜蓿青贮饲料相同。     

应用PCR和测序技术诊断吉安和抚州两地区的柑橘黄龙病

柑橘黄龙病是国内植物检疫对象,明确其地理分布对控制黄龙病扩散具有重要意义.于2008年10～11月赴吉安和抚州可疑黄龙病桔园采集30份病样,其中吉安地区19份,抚州地区11份,采用PCR方法对这30份样品进行柑橘黄龙病菌检测,结果从吉安地区4个病样(遂川县1个、万安县2个、泰和县1个)和阳性对照中扩增到预期的长约700 bp的DNA片段,其他样品和阴性对照中则没有预期的DNA片段产生.选择遂川双桥1号、万安窑头1号和泰和文田4号3个分离物的PCR产物进行纯化、测序,从中各获得一段长为654 nt的序列.经同源性比较发现,这3条DNA序列不仅完全相同,而且它们与已报道的柑橘黄龙病菌亚洲种国内外所有分离物的对应序列的同源性也均为100%,但它们与已报道的柑橘黄龙病菌非洲种核苷酸序列同源性只有79.6%,结果表明上述3个柑橘黄龙病菌分离物均属于亚洲种.柑橘黄龙病菌亚洲种在吉安地区遂川、万安和泰和县存在的发现,希望能引起有关部门足够的重视.     

新疆大果阿魏叶片及其油胶树脂化学成分研究

[目的]对大果阿魏的叶片挥发油化学成分进行了分析,寻找新疆阿魏和阜康阿魏的药用替代品。[方法]采用气相色谱-质谱联用法测定挥发油化学成分。[结果]从大果阿魏叶挥发油中分离出84个成分,鉴定出其中的78种化合物;树脂胶挥发油分离出77个成分,鉴定出63种化合物。[结论]运用气相色谱-质谱法分析阿魏挥发油,方法简便、准确,该研究结果对寻找新疆阿魏和阜康阿魏的代用品及为扩大阿魏药源具有重要意义.     

异丙甲草胺在烟叶和土壤中的残留动态研究

为了解异丙甲草胺在烟叶和土壤中的降解规律,通过湖南和山东两地的大田试验,采用高效液相色谱法研究了异丙甲草胺在烟叶和土壤中的消解动态和最终残留量.结果表明:异丙甲草胺在烟叶中降解较慢,在湖南和山东烟叶中的半衰期分别为9.47 d、8.49 d,土壤中的半衰期分别为10.30 d、11.12 d.施药量为100 g/667m2时,烟叶成熟后异丙甲草胺在湖南烟叶和土壤中的残留量为0.004～0.052 mg/kg;在山东烟叶和土壤中的残留量为0.007～0.067 mg/kg.施药量为150 g/667m2时,烟叶成熟后异丙甲草胺在湖南烟叶和土壤中的残留量为0.009～0.061 mg/kg;在山东烟叶和土壤中的残留量为0.011～0.071 mg/kg,均低于规定的MRL值,说明异丙甲草胺是易降解农药,在烟草上使用是安全的.