纹枯病菌诱导水稻表达的WRKY基因克隆及分析（摘要）

[目的]克隆纹枯病菌诱导的水稻上调表达基因。[方法]对应用抑制差减杂交技术（SSH）获得的纹枯病菌诱导水稻表达的EST序列K16进行电子克隆,根据电子克隆产物设计引物进行RT-PCR、克隆测序,利用生物信息学技术对克隆产物进行功能预测。[结果]克隆出一个长度为1079bp的序列,结构功能分析显示该基因编码236个氨基酸的蛋白,存在多个功能位点,含有2个典型的WRKY结构域和1个C2H2锌指型结构,该基因与水稻WRKY8、WRKY24和WRKY30基因有较高的同源性。[结论]经电子克隆获得的纹枯病菌诱导表达的基因为典型的WRKY家族基因,该基因可能在水稻抗纹枯病中起重要作用。     

水稻WRKY80转录调节蛋白基因的分离与表达模式

【目的】分离水稻WRKY80,分析其编码蛋白的序列结构特征,了解其在各器官中以及病原接种、激素处理下的表达模式,为阐明其生物学功能奠定基础。【方法】基于水稻基因组数据库注释的Loc_Os03g63810基因的编码序列设计特异引物,用RT-PCR法从茉莉酸甲酯（MeJA）处理的水稻叶片中克隆WRKY80 cDNA 序列,运用生物信息学手段对推定的蛋白和启动子序列进行分析,用Northern杂交或实时荧光定量PCR方法研究基因的表达模式。【结果】 获得了WRKY80 cDNA序列,长1 392 bp,包含1个长1 164 bp 的完整开放读码框,编码387个氨基酸。WRKY80具有1个典型的WRKY 保守结构域,锌指类型为C2H2,归类于WRKY 第Ⅱ组;C-端为酸性结构区,且含连续的6个谷氨酰胺和8个丝氨酸,提示具有转录激活活性;预测其定位于细胞核。WRKY80与玉米和高粱等单子叶植物WRKY 的氨基酸序列同一性较高。WRKY80在各器官中组成性表达,在叶、根和穗中表达丰度较高,花中次之,在茎和颖果中丰度较低,且表达具有发育阶段相关性,在成熟叶、根中的表达分别高于幼叶和幼根;受稻瘟病菌、纹枯病菌、MeJA和乙烯利诱导表达,而水杨酸对其表达无影响。其表达模式与启动子顺式元件预测分析的结果基本一致。【结论】WRKY80具有转录因子的结构特征,推测其可能通过茉莉酸/乙烯介导的信号途径参与水稻的防御反应,也可能参与发育调控。     

SA、MeJA、ACC和苹果轮纹病病原菌诱导湖北海棠MhWRKYl基因的表达

【目的】从湖北海棠叶片中克隆MhWRKY1转录因子的全长cDNA序列,分析该基因在各种组织中(叶、茎、根)的表达特性,并分析SA、MeJA、ACC在叶、茎、根中诱导MhWRKY1基因的表达模式以及苹果轮纹病病原菌诱导条件下湖北海棠叶片中该基因的表达特性。【方法】利用电子克隆技术和RT-PCR验证相结合的方法,从SA诱导的湖北海棠全长cDNA文库中,克隆MhWRKY1转录因子的全长序列;利用生物信息学的方法对其进行结构和功能的初步分析;利用实时荧光定量RT-PCR技术分析该基因在不同组织中的表达以及在SA、MeJA、ACC和苹果轮纹病病原菌诱导下的表达特性。【结果】克隆了MhWRKY1基因的全长cDNA序列为1 338 bp,GenBank数据库登录号为FJ598139。生物信息学分析表明,该基因最大开放阅读框为993 bp,编码330个氨基酸。推导的氨基酸序列与杨树WRKY26、杨树WRKY20、大豆WRKY,马铃薯WRKY2、烟草WRKY、拟南芥WRKY7、水稻WRKY53的同源性分别为68%、68%、66%、60%,59%,49%和43%。该转录因子含有1个WRKY结构域,其N端含有1个WRKYGQK结构...     

水稻纹枯病菌RsCat基因的克隆及其表达分析

为阐明水稻纹枯病菌(Rhizoctonia solani AG-1IA)过氧化氢酶基因(RsCat)的功能,采用常规PCR和RT-PCR技术克隆得到RsCat基因。生物信息学分析表明,RsCat基因DNA和cDNA的全长序列分别为1814bp和1 395bp,开放阅读框(ORF)编码464个氨基酸。保守结构域分析显示,RsCat蛋白具有过氧化氢酶超家族结构域和过氧化氢酶相关免疫反应结构域。系统进化分析显示:水稻纹枯病菌不同融合群的RsCat基因具有较高的序列同源性。荧光定量PCR(qRT-PCR)分析表明:RsCat基因的表达受儿茶酚的诱导,随着儿茶酚质量浓度增大,表达量上调,而随着儿茶酚质量浓度增大,CAT活性降低。说明RsCat基因的转录表达和CAT酶活不存在对应性。推测RsCat基因可能存在转录后或表达产物翻译后修饰。     

水稻ARAB-1类似基因的电子克隆及生物信息学分析

[目的]对水稻OsARAB-1基因进行电子克隆,并对其进行生物信息学分析.[方法]以NP 174188.1为查询探针,通过电子克隆获得OsARAB-1基因全长cDNA,用生物信息学软件对其核苷酸序列和蛋白质序列进行生物信息学分析.[结果]获得了OsARAB-1基因全长cDNA,基因编码区序列(CDS)全长1 086 bp.电子定位于第五染色体基因组序列NC 008398.2核苷酸序列6 769 813 ～6 773 213 bp区域.OsARAB-1蛋白属于亲水性的胞外蛋白,比较稳定,偏碱性.二级结构以α螺旋和无规则卷曲为主.具有2个功能结构域:SGNH水解酶型酯酶、GDSL脂肪酶.有21个磷酸化位点、7个糖基化位点.推定的活性位点的氨基酸残基为Ser34、Gly107、Asn167、Asp333、His336.与玉米酯酶亚型B4FM12亲缘关系最近.OsARAB-1基因的表达对水稻的发育和形态发生起重要作用,与水稻抗稻瘟病有关.[结论]该研究为用试验方法克隆该基因和功能鉴定奠定了基础.     

水稻蛋白OsOlel在大肠杆菌中的诱导表达

[目的]在大肠杆菌中诱导表达水稻蛋白OsOle1。[方法]RT-PCR克隆水稻基因OsOle1,构建原核表达载体pGEX-2T-OsOle1-GST,在大肠杆菌BL21中诱导表达该蛋白,并采用GST凝胶亲和层析进行纯化。[结果]水稻蛋白OsOle1具有典型的Olee1蛋白家族的保守域,N端1～24位氨基酸为预测的信号肽序列。成功地将水稻蛋白OsOle1在大肠杆菌中进行了诱导表达,并用GST亲和层析进行了纯化。[结论]该研究为以后进一步研究水稻蛋白OsOle1的生理功能奠定了基础。     

茉莉酸和真菌病原诱导的水稻WRKY30转录因子基因的分离及表达特征

 【目的】分离水稻WRKY30,为阐明WRKY转录因子在水稻抗病反应中的调节作用提供依据,为抗病性的合理利用和品种遗传改良提供基因材料。【方法】采用RT-PCR获得包含最大开放阅读框（ORF）的WRKY30 cDNA序列,运用生物信息学手段进行序列分析,通过Southern杂交确定基因在基因组中的拷贝数,利用Northern分析或RT-PCR方法,研究基因的器官特异性表达和病原、激素以及非生物胁迫诱导表达的特征。【结果】 WRKY30 包含一个长2 022 bp的完整ORF,编码674个氨基酸,具有1个核定位信号和2个典型的WRKY保守结构域,锌指纹组成为C2H2,归类于WRKY第一组,与大麦、高粱和短柄草等单子叶植物WRKY的氨基酸序列同一性较高。WRKY30在基因组中以单拷贝存在,在茎、叶和颖果中表达丰度最高,根和穗中次之,花中最低。WRKY30受稻瘟菌和纹枯菌快速诱导。抗病相关信号分子水杨酸（SA）和茉莉酸甲酯（MeJA）也能诱导该基因表达迅速上调,而乙烯（ET）对其表达无明显影响,脱落酸抑制其表达。除伤引起WRKY30表达上调外,其它非生物胁迫如冷、高盐和干旱对其表达无明显影响。【结论】WRKY30可能参与水稻对稻瘟菌和纹枯菌防御反应的调控,这种调节作用依赖于SA和JA介导的信号途径,而与ET信号途径无关。     

白菜型油菜中WRKY基因的克隆与表达(英文)

[目的]为研究WRKY转录因子在ABA诱导下的表达调控。[方法]首先利用同源克隆法在白菜型油菜中克隆WRKY基因和Actin基因片段,用BLAST和DNAMAN软件对核酸及氨基酸序列进行分析;通过荧光定量PCR技术检测白菜型油菜WRKY基因在ABA处理条件下的相对表达趋势;然后利用相对定量PCR技术(real-timerelative quantificationPCR,以下简称RT-qPCR)检测WRKY基因在ABA(100μmol/L)诱导不同时段的差异表达。[结果]在白菜型油菜中克隆到一段长度为680bp的WRKY基因片段和一段长度为933bp的β-actin基因片段。RT-qPCR实验结果表明,BcWRKY能被ABA诱导表达,且在诱导1h后表达量最高。[结论]成功地克隆了白菜型油菜的WRKY转录因子基因和Actin基因片段,并证明了白菜型油菜WRKY基因的表达受ABA的影响。     

番茄WRKY2基因的克隆(英文)

[目的]研究WRKY转录因子在番茄中的功能。[方法]根据已克隆的番茄WRKY转录因子片段设计引物,以100μmol/LJA处理6h后的番茄总RNA为模板,采用RT-PCR方法。[结果]从JA诱导的番茄幼苗中获得了608bp的cDNA片段,序列分析表明,该序列含有WRKYGQK保守结构域,与Capsicum annuum WRKY-c序列相似性是79%,与Nicotiana tabacum NtWRKY-7序列相似性是74%。[结论]已经成功克隆了番茄WRKY2基因片段。     

不结球白菜响应ABA和低温基因WRKY18的克隆及表达分析

[目的]WRKY转录因子是植物特有的一类转录因子,广泛参与植物的生长发育、生物及非生物胁迫响应。克隆和鉴定不结球白菜共同响应ABA和低温的WRKY基因,对研究不结球白菜抗逆分子机制和改良其抗逆性具有重要意义。[方法]采用电子克隆的方法在NCBI数据库中进行不结球白菜WRKY18基因全长拼接,然后在不结球白菜‘苏州青’中,克隆到1个与低温及ABA响应相关的WRKY基因,通过生物信息学手段和实时定量RT-PCR(qRT-PCR)技术分析了该基因的序列结构特征及其在低温和ABA处理下的表达变化。[结果]该基因全长为1080bp,含有978bp的开放阅读框,编码326个氨基酸,与油菜及拟南芥的WRKY18直系同源,氨基酸序列相似性分别为87%和73%,命名为BcWRKY18。序列分析表明,该编码蛋白为核蛋白,不含跨膜区,无信号钛,具有WRKYGQK基序(motif)约60个氨基酸残基的WRKY保守结构域,为WRKY转录因子家族成员。系统聚类分析指出了BcWRKY18蛋白的保守性及其在开花植物中的进化关系;序列结构和同源建模分析指出了BcWRKY18蛋白的保守结构域、蛋白质的二级及三级结构分布模型;qRT-PCR检测了BcWRKY18基因在ABA和低温胁迫下的表达,表明低温和ABA都能诱导BcWRKY18基因表达,其表达模式都存在相似的过程,且BcWRKY18基因对ABA的响应比对低温的响应更快、更明显。[结论]从不结球白菜中克隆获得1个新的WRKY类转录因子基因BcWRKY18,基因表达分析发现BcWRKY18可能存在对ABA和低温的共响应及自身反馈调控。     

WRKY35转录因子的cDNA克隆与植物表达载体的构建

文章以丁香假单孢菌处理的哥伦比亚型拟南芥为植物材料,利用RT-PCR技术获得了拟南芥WRKY35转录因子的cDNA编码序列。序列分析表明,WRKY35核苷酸序列长1363bp,CDS全长1314bp,编码438个氨基酸,含有一个典型的WRKY结构域,具有WRKY转录因子的典型特征。将该基因的cDNA编码序列连接到植物表达载体pBI121中,成功构建了拟南芥的WRKY35基因的植物表达载体,为进一步通过转基因技术研究该基因的功能奠定了基础。     

水稻SLR1基因的克隆及其植物表达载体的构建

[目的]为研究水稻中的SLR1蛋白的功能及寻找与其相互作用的GA信号转导蛋白奠定基础。[方法]以水稻品种日本晴基因组DNA为模板,根据水稻SLR1基因cDNA序列设计1对特异引物进行PCR扩增,回收PCR产物连接到pGEMT载体中,经筛选得到水稻SLR1基因的克隆pGEMTSLR。最后采用酚仿抽提和乙醇沉淀的方法构建水稻SLR1基因的正义和反义表达载体。[结果]通过PCR扩增获得了约为1.9kb的特异片段。回收PCR产物,将克隆片段和pGEMT载体连接后转化到大肠杆菌DH5α感受态细胞,重组克隆经酶切鉴定后提取重组质粒pGEMTSLR1。该研究成功构建了SLR1基因的正义表达载体pCAMSLR(约0.7kb)和反义表达载体pCAMASLR(约1.2kb)。[结论]采用冻溶法可将表达载体pCAMSLR和pCAMASLR导入农杆菌并进行水稻的遗传转化。利用SLR1基因的正义和反义表达载体,可观察转基因植株中该基因的表达上调和下调对植物的影响。     

SA、MeJA、ACC和苹果轮纹病病原菌诱导湖北海棠MhWRKY1基因的表达

 【目的】从湖北海棠叶片中克隆MhWRKY1转录因子的全长cDNA序列,分析该基因在各种组织中(叶、茎、根)的表达特性,并分析SA、MeJA、ACC在叶、茎、根中诱导MhWRKY1基因的表达模式以及苹果轮纹病病原菌诱导条件下湖北海棠叶片中该基因的表达特性。【方法】利用电子克隆技术和RT-PCR验证相结合的方法,从SA诱导的湖北海棠全长cDNA文库中,克隆MhWRKY1转录因子的全长序列;利用生物信息学的方法对其进行结构和功能的初步分析;利用实时荧光定量RT-PCR技术分析该基因在不同组织中的表达以及在SA、MeJA、ACC和苹果轮纹病病原菌诱导下的表达特性。【结果】克隆了MhWRKY1基因的全长cDNA序列为1 338 bp,GenBank数据库登录号为FJ598139。生物信息学分析表明,该基因最大开放阅读框为993 bp,编码330个氨基酸。推导的氨基酸序列与杨树WRKY26、杨树WRKY20、大豆WRKY,马铃薯WRKY2、烟草WRKY、拟南芥WRKY7、水稻WRKY53的同源性分别为68%、68%、66%、60%,59%,49%和43%。该转录因子含有1个WRKY结构域,其N端含有1个WRKYGQK结构域,C端含有1个C2H2锌脂结构,属于第Ⅱ类型的转录因子。表达分析结果表明,MhWRKY1在叶和茎中的表达量较大,分别是根的4.81和3.75倍。在湖北海棠叶、茎、根中,SA、MeJA、ACC都可以诱导该基因的表达。另外,在所研究的72 h内,苹果轮纹病病原菌可以诱导该基因表达,且表达量在12 h达到最大,是未处理之前的9倍左右。【结论】MhWRKY1转录因子可能参与SA、MeJA和ET介导的植物抗病防卫反应的基本信号通路,并且参与对苹果轮纹病病原菌引起的防卫反应,在湖北海棠的的抗病过程中可能起着非常重要的作用。     

寒地水稻纹枯病菌形态特征及ITS鉴定

[目的]分离鉴定寒地水稻纹枯病病原菌,为寒地水稻纹枯病抗性育种提供技术支持和理论依据。[方法]采集水稻纹枯病病株并分离培养病菌,采用柯赫氏检验法和ITS鉴定的方法,对分离菌株进行形态观察和分子生物学鉴定。[结果]将分离获得病菌以牙签嵌入法接种水稻植株,植株呈现水渍状典型纹枯病病斑。利用ITS1和ITS4引物扩增病菌DNA,测序结果拼接后与NCBI上已知序列比对,结果表明该菌与登录号为No.KT_362083.1的Rhizoctonia solani(立枯丝核菌)有97%的同源性。[结论]形态学特征鉴定与分子生物学鉴定结果一致,该菌为立枯丝核菌,为寒地水稻纹枯病致病菌。     

富贵竹过氧化物酶全长基因的克隆与表达分析

[目的]克隆富贵竹全长POD基因,检测富贵竹感染斯氏泛菌(Pantoea stewartii)后该基因的表达。[方法]用PCR克隆富贵竹(Dracaena sanderiana)POD部分基因,用hiTAIL-PCR扩增该基因左右两侧序列。通过RT-PCR和qPCR确定POD基因在病原物侵染时的表达。[结果]获得一个长度为3 419 bp的序列,登录号为MZ450796。经基因结构预测,该序列包含1个转录起始位点、加尾信号和4个外显子。进化树分析表明,该基因编码的氨基酸序列与芦笋POD的氨基酸序列一致性最高。接种P.stewartii后,POD基因的表达上调,3 d达最大值。[结论]克隆了富贵竹全长POD基因,确定了POD基因在富贵竹叶片中表达和结构预测的正确性;POD基因被P.stewartii诱导上调表达。     

水稻OsTFL2基因启动子的克隆及功能验证

[目的]克隆水稻TFL2(OsTFL2)启动子序列,并分析其结构和功能,为深入研究OsTFL2基因对水稻开花和花发育的调控机理提供理论参考.[方法]采用同源克隆方法克隆OsTFL2基因启动子序列,利用PLACE和PlantCARE分析其结构和功能,并将其连接至携带β-葡萄糖苷酸酶(GUS)基因的pCAMBIA1301载体以构建pCAMBIA1301-Pro-moter植物表达载体,通过农杆菌介导转化水稻品种农垦58愈伤组织,通过对转基因植株进行GUS组织化学染色以分析该基因启动子的表达特性和调控功能.[结果]克隆获得的OsTFL2基因起始密码子上游启动子序列1.8 kb,该序列除含有真核生物典型启动子元件TATA-box和CAAT-box外,还含有花粉特异识别的顺式作用元件Pollen1lelat52(AGAAA)、开花基因转录相关的多功能转录因子CACTFTPPCA1(PACT,Y=C/T)、CCAAT box1(CCAAT)、DOFCORE(AAAG)和GATA box(GATA)、分生组织特异性元件CCGTCC-box及多个光诱导元件或光诱导相关元件如G-box、Box I、CATT-motif、GATA-motif和GT1-motif等,推测OsTFL2基因通过上述作用元件参与调控水稻花发育及开花.通过PCR检测共筛选获得16株阳性转基因植株,对其进行GUS组织化学染色,结果发现水稻的外颖、花、花药、柱头和子房中均可检测到明显的GUS色斑,而在叶片、茎尖和根尖无明显的GUS色斑,说明OsTFL2启动子能驱动GUS基因在水稻外颖、花药和子房中表达.[结论]OsTFL2基因启动子具有启动活性和组织表达特异性,可在一定程度上影响OsTFL2基因表达,对水稻花生长发育和开花发挥重要调控作用.     

柑橘胁迫响应基因WRKY47的克隆与表达分析

以柠檬[Citrus limon(L.)Burm.f.]、甜橙[Citrus sinensis(L.)Osbeck]、芦柑(Citrus reticulata Blanco)、金柑[Fortunella japonica(Thunb.)Swingle]为试验材料,基于甜橙基因组数据库中的甜橙基因碱基序列,利用RT-PCR方法克隆获得4个WRKY家族基因ClWRKY47、CsWRKY47、CrWRKY47和FjWRKY47的cDNA全长碱基序列.序列分析结果表明,这4个基因的cDNA全长都是1567 bp,开放阅读框为1506 bp,编码501个氨基酸.氨基酸序列和结构分析结果显示,这4个基因编码的蛋白质属于Group IIa+IIb类WRKY蛋白.进化树分析结果显示,所克隆的4个柑橘WRKY蛋白与克莱门柚WRKY47蛋白的亲缘关系最近.对CsWRKY47启动子顺式作用元件预测分析,发现CsWRKY47启动子包含脱落酸响应元件(ABRE)、茉莉酸甲酯响应元件(CGTCA-motiF)、抗氧化响应元件(ARE)、参与干旱诱导的MYB结合位点(MBS)等多个与胁迫相关的顺式作用元件.实时荧光定量表达分析结果表明,柠檬ClWRKY47和甜橙CsWRKY47能被高盐、干旱、低温胁迫诱导表达;芦柑CrWRKY47在干旱和低温胁迫下诱导表达,高盐胁迫下表达量下调;金柑FjWRKY47在高盐胁迫下诱导表达,干旱和低温胁迫下下调表达.为进一步开展柑橘胁迫相关基因WRKY47的功能鉴定奠定了基础.     

玉米Na~+/H~+逆向转运蛋白基因ZmSOS1的克隆与鉴定

[目的]克隆玉米Na^＋／H^＋逆向转运蛋白基因,为研究此类基因在玉米非生物胁迫抗性机制中的功能奠定基础。[方法]采用电子克隆、RT—PCR、生物信息学方法,从玉米基因组中克隆1个质膜型Na^＋／H^＋逆向转运蛋白基因,并鉴定该基因编码产物的跨膜结构预测以及在盐胁迫下的表达模式等信息。[结果]利用电子克隆方法,从玉米中克隆出1个质膜型Na^＋／H^＋逆向转运蛋白基因ZmSOS1;Zm-SOS1基因的开放阅读框长3411bp,编码1136个氨基酸;序列分析表明,ZmSOS1蛋白与拟南芥和水稻同源物AtSOSl、OsSOS1的氨基酸序列一致性分别为61％和82％;RT—PCR分析表明,ZmSOS1基因的表达可以被盐胁迫诱导增强,表明其可能在玉米耐盐性上发挥功能。[结论]ZmSDS1是一个公认的质膜型Na^＋／A^＋逆向转运蛋白基因,并可能参与玉米的非生物胁迫反应。     

水稻纹枯病菌菌核形成过程中特异基因的表达与分析

以水稻纹枯病GD-118菌株菌丝形成期的mRNA为驱赶子(driver),以菌核形成期的mRNA为检测子(tester),采用抑制消减杂交(SSH)结合虚拟Northern杂交筛选,构建了水稻纹枯病菌菌核形成过程中特异表达产生的差减cDNA文库;进一步用PCR筛选显示克隆中插入的片段主要分布在200～500bp之间;随机挑取克隆应用虚拟Northern技术以菌丝、菌核cDNA为探针来验证消减有效性,经测序和同源性检测剔除重复序列之后,获得了从菌丝到菌核形成相关的28条特异表达的基因片段;所筛选的特异表达序列主要涉及胁迫响应、转录调控、信号传导、合成代谢等.这为进一步分析水稻纹枯病菌菌核形成过程的相关基因提供了科学线索.     

3种微生物诱导的家蚕attacin基因异常表达形式的研究

[目的]研究家蚕抗菌肽attacin基因在不同诱导源诱导时的表达情况。[方法]应用3种外源微生物BmNPV、JM109以及农杆菌LBA4404对家蚕进行诱导,半定量PCR检测attacin基因在诱导后的家蚕血液和脂肪体的表达情况,对诱导表达产物进行克隆测序及进一步的分析。[结果]attacin基因在所有诱导后的脂肪体中均出现1条800 bp左右的特异表达条带,克隆测序（GenBank登录号：FJ373020）后发现其产生由正常表达形式的2个内含子未被剪接引起,且原序列第1内含子5′端的1个TGA终止密码子使得加长的特异表达序列翻译氨基酸时在此处终止,最终导致了attacin C末端结构的缺失。[结论]attacin基因有2种剪接形式,该研究对探明atta-cin基因在家蚕免疫中的作用具有参考价值。