生长激素受体基因在美国短毛黑水貂组织中表达量变化研究

为了探讨水貂生长激素受体(GHR)基因在不同组织中的表达变化,以美国短毛黑水貂为研究对象,采用荧光定量PCR方法检测了GHR基因在不同生长发育阶段(45、90、120、150、180日龄)心脏、肝脏、脾脏、肺脏、肾脏、肠、皮肤等组织的表达水平,并进行了比较分析。结果表明:GHR基因在同一组织不同日龄表达具有较大差异,例如,在心脏、肝脏和脾脏组织,180日龄表达量极显著高于其他日龄(P0.01),而肠组织,其在45、120日龄均极显著高于其他日龄(P0.01);此外GHR表达量在同一日龄不同组织同样存在较大差异,例如,90日龄时皮肤组织极显著高于其他组织(P0.01),180日龄时脾脏极显著高于其他组织(P0.01)。说明水貂GHR基因的表达呈现出明显的时空特异性。     

多杀性巴氏杆菌TaqMan荧光定量PCR检测方法的建立与应用

为建立一种多杀性巴氏杆菌(Pm)快速敏感的检测方法,本实验根据Pm70株kmt1基因保守区设计特异性引物和TaqMan探针,建立了该菌的TaqMan荧光定量PCR检测方法,并优化了检测反应条件。本实验建立的荧光定量PCR方法可以特异性检测Pm,而对鸭疫里默氏杆菌、支气管败血波氏杆菌等菌株检测结果均为阴性,表明该方法具有良好的特异性。该方法对C48-1株标准品的检测灵敏度为1.75×10~1拷贝/μL,优于常规PCR检测方法(1.75×10~3拷贝/μL) 100倍;组内和组间重复性试验的变异系数均小于2%,具有良好的重复性。对20份疑似感染的临床病料样品(鸡肝脏、牛肺脏)进行增菌培养和分离鉴定,结果分离到8株多杀性巴氏杆菌;以建立的荧光定量PCR方法与常规PCR方法对增菌培养液进行检测,阳性率分别为40%(8/20)和25%(5/20),且荧光定量PCR方法与常规细菌分离鉴定的符合率为100%。对C48-1株感染致死的20份小鼠肝脏和脾脏组织研磨液进行检测,阳性率均为100%。本研究建立的方法能够快速、敏感的检测Pm,对于其临床和实验室的快速诊断具有重要意义。     

鸭疫里默氏杆菌实时荧光定量PCR快速检测方法的建立与应用研究

根据GenBank登录的鸭疫里默氏杆菌外膜蛋白(OmpA)基因保守区序列,设计引物和探针,建立了直接检测鸭疫里默氏杆菌的实时荧光定量PCR快速方法。10倍梯度稀释RA菌株制备DNA模板测定方法的灵敏度,结果可在8.0×103CFU/mL浓度下特异地检测出目的菌,最低能检测到RA的DNA模板为8.0拷贝/μL;对鸭源大肠杆菌、多杀性巴氏杆菌、沙门氏菌、变形杆菌、金黄色葡萄球菌进行检测,结果均为阴性,建立的实时荧光定时PCR方法特异性强。用RA菌株人工感染雏鸭,感染后定时采集咽喉拭子、泄殖腔拭子、心血、肝脏、肺脏、脑,分别用实时荧光定量PCR检测,对脏器进行病原菌分离。结果表明,1/10半数致死量接种组,感染后8 h从心血、肝脏、脑组织检测到RA核酸,16 h后全部试样呈阳性;24 h首先从肝脏分离到RA,心血、肝脏、肺脏、脑组织均分离出RA。心血和脏器RA实时荧光定量PCR阳性检出率为63.8%(51/80),RA分离率为28.8%(23/80)。10个半数致死量接种组,1 h即可从咽喉拭子、心血和肝检测到RA核酸,5 h全部样品为阳性;5 h从肺和脑分离到RA。RA人工感染鸭的心血、肝脏、肺脏、脑实时荧光定量PCR阳性检出率为86.3%(69/80),RA分离率为60%(48/80)。用加热裂解法提取样品RA DNA只需30 min,建立的实时荧光定量PCR检测RA只需2 h,适用于RA的快速诊断、流行病学调查、种鸭引进隔离检疫、活鸭及其产品国内市场和进出口检验检疫。     

河北地区水貂源大肠杆菌的分离鉴定及致病性与耐药性研究

为分析河北地区水貂源大肠杆菌的致病性与耐药性,本研究对河北地区送检病死水貂采集组织样品,经分离鉴定、生化鉴定和16S rDNA基因序列分析,共分离得到24株水貂大肠杆菌。对分离菌株进行致病性试验、药敏试验、毒力基因和耐药基因检测。结果显示,24株大肠杆菌感染小鼠后小鼠死亡率为20%～100%;24株分离菌中有22株检测到毒力基因,fimC毒力基因检出率最高,为70.83%(17/24);分离的24株株大肠杆菌耐药性较强,对替米考星、土霉素、磺胺间甲氧嘧啶、磺胺二甲氧嘧啶、复方新诺明耐药的菌株占80%以上,对头孢曲松最敏感,敏感菌株占66.67%(16/24),且分离菌均具有多重耐药性,耐5种以上药物的菌株占比高达100%;24株大肠杆菌均检测到耐药基因,耐药基因检出率为4.17%～79.17%,其中氨基糖苷类耐药基因addA1(79.17%)、喹诺酮类耐药基因gyrA(75%)、gyrB(70.83%)检出率较高,β-内酰胺类耐药基因ctx-M(20.83%)和SHV(4.17%)检出率较低;未检测到tetA、tetC、sul1、mefA耐药基因。上述结果表明,分离菌对小鼠均具有一定的致病力,且毒力基因检出数越多的菌株对小鼠的致病力越强;β-内酰胺类、氨基糖苷类和喹诺酮类的耐药基因与耐药表型基本相符,分离菌的其余耐药基因与耐药表型不符,提示分离的大肠杆菌可能存在其他耐药机制。本研究为河北地区水貂大肠杆菌病的防治提供参考依据,为大肠杆菌的致病机制和耐药机制的研究奠定基础。     

猪链球菌2型的鉴定及其毒力因子检测

猪链球菌的感染不仅对养猪业造成巨大的损失,同时对公共卫生尤其是相关从业人员的生命造成威胁,严重感染引起死亡.根据参考文献,设计了1对猪链球菌2型特异性引物.对四川分离的7株链球菌、江苏分离的1株、北京分离的6株和菌种中心保存的5株C群马链球菌兽疫亚种、1株D群链球菌、4株R型链球菌、2株S群链球菌和E、F、G、K、L、M、N、O、P群链球菌各1株进行了检测.结果7株四川分离株均为2型;1株江苏分离株为2型;6株北京分离株有3株为2型;1株R群、2株s群链球菌为2型猪链球菌.对检测出的14株猪链球菌2型的毒力因子做进一步检测.MRP基因检出率为92.9%(13/14);EF基因检出率为100%(14/14);sly基因检出率为71.4%(10/14);Cps2A基因检出率为92.9%(13/14);gapdh基因检出率为64.3%(9/14);FBPS基因检出率为92.9%(13/14);orf2基因检出率为71.4%(10/14).毒力因子全为阳性的菌株有6株,MRP-EF+菌株有2株.本研究从259份健康猪扁桃体中分离到16株2型猪链球菌,健康猪带菌率为6.2%(16/259).16株猪链球菌2型中,MRP、EF、Cps2A全为阴性,只从1株2型猪链球菌中检测到了sly基因(1/16);gapdh基因检出率为56.25%(9/16);FBPS基因检出率为75.0%(12/16);Orf2基因检出率为37.5%(6/16).     

广西罗非鱼主养区致病性链球菌及其耐药性调查

为了解致病性无乳链球菌在广西罗非鱼主养区的分布及其耐药性情况,对广西各地区发病罗非鱼进行现场采样,以常规方法从患病罗非鱼的脑、心脏和肝脏等组织分离细菌,人工回归感染试验确定分离菌株的致病性,以API 20 Strep和16S rRNA分别对菌株进行生化鉴定和分子鉴定,K-B药敏纸片扩散法检测菌株的耐药性。调查结果,从广西8个市12个县/区采集的672个罗非鱼病样中,有30个病样共检出致病性强的革兰氏阳性球菌30株,参考株总检出率4.46%,百色市和来宾市的病样中未分离到革兰氏阳性球菌;经鉴定,分离到的30株球菌均为无乳链球菌(Streptococcus agalactiae),与无乳链球菌(S.agalactiae)参考株JF423947、JQ039375、KF111315和JQ99015616SrRNA核苷酸的同源性最高(98.5%~100%);28种药物的药敏试验结果显示,对所有菌株敏感的药物只有盐酸沙拉沙星1种,对所有菌株耐药的药物有磺胺-6-甲氧嘧啶(钠)、磺胺对甲氧嘧啶和复方磺胺嘧啶3种。     

检测新型鹅细小病毒的半套式PCR方法的建立及应用

2015年以来山东、江苏等地的樱桃谷肉鸭暴发了一种由新型鹅细小病毒(NGPV)引起的短喙-侏儒综合征(BADS)的疾病,造成了严重的经济损失。为探究该病毒在鸭体内分布规律,本研究根据Gen Bank已登录的NGPV的VP3基因设计了3条引物,建立了检测NGPV的半套式PCR方法。该方法对其它常见鸭病原微生物无特异扩增,特异性好;最低可检出100拷贝/μL的病毒核酸,灵敏度高。采用建立的半套式PCR方法对山东、江苏两地8个樱桃谷肉鸭鸭群120只病死鸭的心脏、肝脏、脾脏、肺脏、肾脏、胸腺、法氏囊、胰腺、脑和胆汁进行检测,结果显示患病鸭群的群体检出率为100%,个体检出率为80.8%(97/120);10种组织脏器中均检出NGPV,其中心脏检出率最高为93.8%,脑组织检出率最低为9.3%。本研究首次对NGPV在鸭体内10个脏器组织的分布进行统计分析,证明了NGPV对樱桃谷鸭具有广泛的组织嗜性。     

猪丹毒丝菌安徽分离株对小鼠的致病性研究

为了了解猪丹毒丝菌安徽分离株(BB130818)对小鼠的致病性,试验采用改良寇氏法测定猪丹毒丝菌安徽分离株对小鼠的半数致死量(LD50),应用1×LD50和100×LD50菌量分别攻毒感染小鼠,通过实时荧光定量PCR技术检测感染菌株在小鼠体内的分布情况,并采集以100×LD50剂量攻毒时小鼠的脾脏、肺脏、肝脏制作组织切片观察病理变化。结果表明:猪丹毒丝菌安徽分离株对小鼠的LD50为50.3 cfu/m L;以1×LD50剂量攻毒36 h后即可从小鼠心脏、脾脏和脑组织中检出该菌,48 h后可从小鼠肝脏、肺脏中检出该菌;以100×LD50剂量攻毒24 h后即可从小鼠心脏、脾脏、肺脏和脑组织中检出该菌,36 h后可从小鼠肝脏中检出该菌;小鼠全身败血性出血,脾脏、肺脏、肝脏均出现病变。说明猪丹毒丝菌安徽分离株具有较强的致病力,进入小鼠体内的主要增殖器官首先是心脏、脾脏和脑组织,然后到肺脏和肝脏。     

北美水貂源沙门氏菌的分离鉴定及耐药性检测

为调查秦皇岛地区北美水貂沙门氏菌的检出率及耐药情况,对65份水貂样品中的细菌进行分离纯化,采用细菌的鉴定培养、革兰氏染色、生化鉴定和16S rDNA鉴定分离菌,采用小鼠致病性试验研究分离菌株的致病性,采用KB纸片法检测分离菌的耐药性。结果显示,经鉴定共计分离出9株沙门氏菌,分离率13.85%(9/65);9株沙门氏菌均可致小鼠发病死亡,死亡率20%—100%;9株沙门氏菌分别对5—11种抗生素药物耐药,氟苯尼考、替米考星、磺胺间甲氧嘧啶、磺胺二甲氧嘧啶和复方新诺明的耐药率高达100%,土霉素敏感率最高,为88.89%(8/9)。上述研究结果表明,秦皇岛地区从水貂分离到的沙门氏菌均具有一定的致病力和多重耐药性,为该地区水貂沙门氏菌病的防治提供参考。     

猪源链球菌对大环内酯类主要耐药基因的检测

为了解猪源链球菌对红霉素相关耐药基因ermB、ermA和mefA的分布,对河北省及辽宁部分地区的64株猪源链球菌分离株,用PCR方法检测51株红霉素耐药株和13株红霉素敏感株中ermB、ermA和mefA基因。结果显示,耐药菌株中ermB基因的检出率为98.04%(50/51),ermA的检出率为25.49%(13/51),没有检出mefA基因。初步表明河北省及辽宁部分地区的猪源链球菌对红霉素的耐药机制以ermB基因介导为主。20株菌的ermB基因核苷酸序列与GenBank中同源序列相似性为99%～100%。与参照序列AJ972604.1相比,20株菌的ermB氨基酸序列的突变位点较少,主要有Thr 75→Ser、Ser 100→Asn、Arg 118→His、Leu 175→Ile,以100和118位突变为主,进一步说明ermB基因是相对稳定的。     

谷氨酰胺对育成期水貂饲粮营养物质消化率和脏器重量的影响

试验旨在研究饲粮中添加不同水平谷氨酰胺(Gln)对育成期水貂营养物质消化率和脏器重量的影响。选取育成期水貂共160只,随机分为5组,每组32个重复(公、母各半),单笼饲养。对照组饲喂基础日粮(不添加Gln),试验组分别在基础日粮中添加0.2%、0.4%、0.6%和0.8%Gln,预试期1周,正试期7周。结果表明:0.4%Gln组公貂的粗蛋白质、钙、磷消化率均高于对照组(P<0.05),母貂的粗蛋白质、粗脂肪、钙消化率均高于0.2%Gln组和对照组(P<0.05);0.4%Gln组水貂赖氨酸消化率高于对照组(P<0.01),苏氨酸、丝氨酸、甘氨酸、异亮氨酸、苯丙氨酸、脯氨酸、蛋氨酸、胱氨酸、总氨基酸的消化率高于对照组(P<0.05);0.4%和0.6%Gln组公貂脾脏和肝脏重量高于对照组(P<0.05),0.4%组Gln母貂心脏和肝脏重量高于对照组(P<0.05)。综合各项指标,在夏季高温条件下,育成期水貂饲粮中Gln的适宜添加水平为0.4%。     

运输应激对肉牛肝脏和脾脏中应激相关蛋白的影响

选取15头体况相似的健康肉牛作为研究对象,随机分为运输0h组、运输3h组和运输6h组,每组5头肉牛,采用公路运输方式运输(平均速度为80km/h)。采集各组牛肝脏和脾脏组织样本,用酶联免疫吸附试验(ELISA)和荧光定量PCR(qRT-PCR)2种试验方法检测各组肝脏和脾脏组织中应激蛋白-热休克蛋白70(HSP70)和急性期蛋白-C反应蛋白(CRP)含量的变化。qRT-PCR检测结果显示:与运输0h组相比,运输3h和6h肝脏组织中HSP70mRNA的表达量极显著升高(P0.01);而脾脏组织中HSP70mRNA只在运输应激6h后表达量显著增加(P0.05)。与0h组相比,运输应激后肝脏组织中CRP mRNA的表达量极显著升高(P0.01),脾脏组织中CRP mRNA的表达量显著升高(P0.05)。ELISA检测结果显示:与0h组相比,运输应激3h和6h肝脏中的HSP70质量浓度极显著升高(P0.01),脾脏中HSP70的质量浓度在运输6h后显著升高(P0.05);肝脏和脾脏CRP的表达在运输应激6h后极显著升高(P0.01)。结果表明:不同运输时间的运输应激可导致肝脏和脾脏中HSP70和CRP的浓度和mRNA转录水平升高,且肝脏中HSP70和CRP的表达量高于脾脏。HSP70和CRP可作为肉牛运输应激候选诊断标志物。     

水貂圆环病毒实时荧光定量PCR检测方法的建立与应用

为快速检测水貂圆环病毒(MiCV),本试验根据MiCV Cap基因序列设计合成特异性引物,建立了水貂圆环病毒SYBR Green II实时荧光定量PCR检测方法。结果显示,该方法在模板浓度为1.0×10⁶ ～1.0×10¹ copies/μL范围内呈良好线性关系,相关系数为0.9983。本试验建立的检测方法对水貂阿留申病毒、猪圆环病毒2型、水貂肠炎病毒、犬瘟热病毒和猪伪狂犬病毒进行检测均无特异性扩增,批内和批间CV均小于2%,对重组阳性质粒的检测下限为1.0×10¹ copies/μL,比普通PCR的敏感度高100倍,对阳性样品DNA的检测下限为2.38×10^-2 pg/μL,比普通PCR的敏感度高1000倍。应用该方法对吉林省部分毛皮动物养殖场的水貂、狐狸、貉和环境样品进行检测,结果其阳性率分别为57.23%、48.42%、39.71%和68.48%。上述结果表明,本研究建立的实时荧光定量PCR检测方法具有良好的灵敏性、特异性和重复性,为MiCV的诊断及流行病学调查提供技术支持。     

水貂β溶血性链球菌MSZ株的微生物学鉴定

从发病死亡水貂脾脏分离的β溶血性链球菌MSZ菌株,经系统检查,初步鉴定为Lancefield氏C群兽疫链球菌。     

河北省奶牛乳房炎主要致病菌多重PCR检测方法的建立

为同时检测奶牛源金黄色葡萄球菌、无乳链球菌和绿脓杆菌,本试验根据GenBank中3种病原菌的nuc、ef-tu和eta基因保守序列分别合成了3对特异性引物,通过对反应条件、反应体系优化,建立了多重PCR检测方法。特异性试验结果表明,该方法与大肠杆菌、克雷伯杆菌、表皮葡萄球菌、巴氏杆菌无交叉反应,敏感性试验结果表明,多重PCR检测方法对金黄色葡萄球菌、无乳链球菌和绿脓杆菌的检出限为10~(-3) mg/L。应用该方法对150份临床样品进行检测,结果金黄色葡萄球菌与无乳链球菌混合感染检出率为28.7%(43/150),金黄色葡萄球菌与绿脓杆菌混合感染检出率为14%(21/150),无乳链球菌与绿脓杆菌混合感染检出率为11.3%(17/150),3种菌混合感染检出率为6%(9/150)。应用多重PCR检测结果与分离培养诊断方法结果进行比较,均能检测出样品中的病原菌,2种检测方法的总符合率分别为金黄色葡萄球菌92.6%,无乳链球菌91.3%,绿脓杆菌94.6%。该检测方法对奶牛乳房炎的防控、临床监测及疾病诊治具有重要意义。     

鸭源多杀性巴氏杆菌对磺胺类药物的耐药性检测及耐药基因分析

为明确鸭源多杀性巴氏杆菌对磺胺类药物的耐药性及耐药基因的分布特征,试验采用琼脂二倍稀释法对分离自福建、广东和江西等地的89株鸭源多杀性巴氏杆菌进行甲氧苄啶/磺胺甲噁唑的耐受性检测,用PCR法检测各耐药菌株的磺胺类耐药基因(sul1、sul2和sul3),并利用多位点序列分型(MLST)分析耐药菌株间的亲缘关系。结果显示,33株鸭源多杀性巴氏杆菌对甲氧苄啶/磺胺甲噁唑耐受,耐药率为37.1%(33/89);在耐药菌株中,sul1、sul2和sul3基因检出率分别为100%(33/33)、97.0%(32/33)和21.2%(7/33),其中sul1和sul2基因同时检出率为97.0%(32/33),sul1、sul2和sul3基因同时检出率为21.2%(7/33);所有耐药菌株均属于ST129型。以上结果表明,鸭源多杀性巴氏杆菌对磺胺类药物具有一定的耐药性,其中的耐药菌株都属于同一序列型ST129,均携带有sul1耐药基因,且绝大多数耐药菌株同时携带sul1与sul2两种耐药基因,提示在福建、广东和江西等地需慎用磺胺类药物来防治该细菌的感染。     

鸭源多杀性巴氏杆菌对磺胺类药物的耐药性检测及耐药基因分析

为明确鸭源多杀性巴氏杆菌对磺胺类药物的耐药性及耐药基因的分布特征,试验采用琼脂二倍稀释法对分离自福建、广东和江西等地的89株鸭源多杀性巴氏杆菌进行甲氧苄啶/磺胺甲噁唑的耐受性检测,用PCR法检测各耐药菌株的磺胺类耐药基因(sul1、sul2和sul3),并利用多位点序列分型(MLST)分析耐药菌株间的亲缘关系。结果显示,33株鸭源多杀性巴氏杆菌对甲氧苄啶/磺胺甲噁唑耐受,耐药率为37.1%(33/89);在耐药菌株中,sul1、sul2和sul3基因检出率分别为100%(33/33)、97.0%(32/33)和21.2%(7/33),其中sul1和sul2基因同时检出率为97.0%(32/33),sul1、sul2和sul3基因同时检出率为21.2%(7/33);所有耐药菌株均属于ST129型。以上结果表明,鸭源多杀性巴氏杆菌对磺胺类药物具有一定的耐药性,其中的耐药菌株都属于同一序列型ST129,均携带有sul1耐药基因,且绝大多数耐药菌株同时携带sul1与sul2两种耐药基因,提示在福建、广东和江西等地需慎用磺胺类药物来防治该细菌的感染。     

猪链球菌2型荧光PCR检测方法与常规检测方法的比较

为验证猪链球菌2型荧光PCR检测方法对临床样品检测的敏感性和适用性以及该方法所拥有的独特优点,分别用荧光PCR法、常规PCR法和细菌分离法对人工感染猪链球菌2型的小鼠肝脏和发病猪的心、肝、脾、肾等实质器官和血液、喉拭子进行抗原检测。结果显示,荧光PCR法检出率为70.8%,明显高于普通PCR法（检出率为20.8%）,也高于常规细菌分离法（检出率为45.8%）。由于临床样品常常会被其他细菌污染,细菌分离法很难准确分离到链球菌。但荧光PCR法不受其他细菌污染的影响,对实验室培养的猪链球菌2型菌液,该方法检测滴度可达10-6/0.1mL（42～52 CFU/0.1 mL）,而普通PCR方法检测滴度仅为10-4。     

Myf5、Myf6基因在黔北麻羊与努黔F1代不同组织表达差异性的研究

实验旨在探究Myf5、Myf6基因在黔北麻羊和努黔F_1代各组织间的相对表达水平。应用实时荧光定量PCR法检测Myf5、Myf6基因在黔北麻羊(3只)和努黔F_1代(3只)的心脏、肝脏、脾脏、肺脏、肾脏、背最长肌、股二头肌和臂三头肌等组织间的相对表达量。结果表明:各组织Myf5、Myf6基因在黔北麻羊和努黔F_1代间表达差异不显著;2种基因在黔北麻羊臂三头肌、股二头肌和背最长肌相对表达量均极显著高于肾脏、肝脏、心脏、脾脏、肺脏(P<0.01),其中Myf5基因在肾脏相对表达量显著高于脾脏和肺脏(P<0.05),Myf6基因在心脏和肝脏相对表达量均显著高于脾脏(P<0.05);2种基因在努黔F_1代臂三头肌、股二头肌和背最长肌相对表达量均极显著高于肝脏、肾脏、心脏、脾脏、肺脏(P<0.01),心脏和肝脏相对表达量均显著高于肺脏(P<0.05)。综上,Myf5、Myf6基因在黔北麻羊和努黔F_1代8种组织中均有表达且表达量不等,在肌肉组织中的表达量最高。     

腺病毒载体转染水貂耳缘成纤维细胞的研究

试验旨在探究利用携带标记基因增强型绿色荧光蛋白(enhanced green fluorescent protein,EGFP)的腺病毒载体转染入水貂耳缘成纤维细胞的可行性及感染效率。首先利用组织贴壁法分离培养水貂原代耳缘成纤维细胞并进行传代,然后包装病毒Ad-EGFP并使用TCID_(50)法进行滴度检测,设置两组不同浓度梯度的病毒液感染水貂耳缘成纤维细胞,感染复数(MOI)值分别为0/100/300/500/700/900和0/10/30/50/70/90,通过在显微镜下观察阳性细胞占总细胞数的比值估计转染效率(%)。结果表明,组织贴壁法培养水貂耳皮肤组织11 d可长满原代细胞,传代细胞在3～4 d融合度可达80%左右,包装Ad-EGFP病毒滴度为1.99×10~(11) PFU/mL,用其感染水貂成纤维细胞最佳MOI值为30,瞬时转染效率可达90%以上。综上,利用腺病毒载体转染水貂成纤维细胞具有可行性,是一种高效的转染方式,为后续水貂基因组编辑前期验证试验奠定基础。