猪萨佩罗病毒TaqMan实时荧光定量PCR检测方法的建立

【目的】建立快速、特异、灵敏的猪萨佩罗病毒（porcine sapelovirus,PSV）TaqMan实时荧光定量（RT-qPCR）检测方法,为临床快速检测PSV提供新方法。【方法】参照GenBank中PSV的全基因序列,针对PSV 5′端保守区设计1对特异性引物,PCR扩增目的片段,将目的片段克隆至pMD 18T载体,构建阳性重组质粒,并以阳性质粒标准品为模板,建立标准曲线。在此基础上,设计特异性引物与探针,进行反应体系和反应条件优化,建立PSV TaqMan RT-qPCR检测方法,并对方法的敏感性、特异性和重复性进行验证。应用建立的方法对2018-2019年在河南不同地区猪场收集的83份样品（粪便样品39份,肠道样品44份）进行检测。【结果】建立了PSV TaqMan RT-qPCR检测方法,该方法的灵敏度为3.88×10¹拷贝/μL;与猪流行性腹泻病毒、猪传染性胃肠炎病毒、猪δ冠状病毒和猪繁殖与呼吸综合征病毒均无交叉反应,特异性良好;批内与批间变异系数均小于1.0%,重复性较好。临床样品检测结果表明,TaqMan RT-qPCR检测PSV呈阳性的样品有31份（22份粪便样品,9份肠道样品）检出率为37.3%（31/83）,显著高于普通PCR检测结果（检出率12.0%（10/83））。【结论】建立了TaqMan RT-qPCR检测方法,该方法灵敏度高,特异性好。     

传染性脾肾坏死病毒、鳜鱼蛙病毒和鳜弹状病毒三重PCR检测方法的建立

【目的】建立可同时检测传染性脾肾坏死病毒（infectious spleen and kidney necrosis virus,ISKNV）、鳜鱼蛙病毒（Siniperca chuatsi ranairidovirus,SCRIV）和鳜弹状病毒（Siniperca chuatsi rhabdovirus,SCRV）的三重PCR检测方法,为鳜鱼等养殖品种流行病学调查提供方法支撑。【方法】根据ISKNV MCP基因、SCRIV MCP基因和SCRV N基因设计3对特异性引物,对PCR扩增反应中的退火温度和引物用量进行优化,建立可同时检测 ISKNV、SCRIV和SCRV的三重PCR方法。为验证该方法的敏感性和特异性(备测病毒为IPNV、GCRV、KHV、SGIV、NNV、TiLV和SVCV),对22份疑似感染ISKNV、SCRIV和SCRV的样品分别进行单一和三重PCR检测。【结果】成功建立了三重PCR检测方法,利用该方法可同时检测ISKNV、SCRIV和SCRV,特异性较好,对IPNV、GCRV、KHV、SGIV、NNV、TiLV、SVCV等无扩增;该方法敏感性好,对3种病毒核酸的检测下限均为0.01 ng/μL;利用该方法和3种病毒单一PCR方法同时对22份临床样品进行检测,结果显示2种方法吻合率为100%,其中ISKNV阳性率为27%、SCRIV 阳性率为41%、SCRV阳性率为9%、ISKNV和SCRIV混合感染阳性率均为9%,无ISKNV、SCRIV和SCRV混合感染。【结论】建立的三重PCR检测方法具有特异性强、灵敏度高等特点,可对这3种病毒进行快速鉴别诊断。     

陕西某羊场莎能奶山羊球虫分离鉴定及感染情况

对陕西省某羊场莎能奶山羊的球虫感染情况进行调查研究，应用球虫卵囊富集技术，结合形态学方法对采自该场2～12月龄的49份（≤2月龄22份；3～5月龄13份；6～12月龄14份）奶山羊新鲜粪便样品进行球虫卵囊分离，显微镜检测和OPG（Oocysts per gram）统计。结果显示，莎能奶山羊球虫总感染率为98.0%（48/49），OPG统计发现，3～5月龄羔羊球虫平均OPG最高，为2 442个/g。最高OPG存在于2月龄羔羊样品中，为15 083个/g，且该羊只出现严重腹泻症状。对富集分离到的球虫卵囊进行孢子化和种类鉴定，共鉴定出7种山羊艾美耳球虫。进一步对随机提取的277个孢子化球虫卵囊进行优势虫种统计分析，其中雅氏艾美耳球虫（Eimeiria ninakohlyakimovae）、阿氏艾美耳球虫（E.arloingi）和柯氏艾美耳球虫（E.christenseni）占比最高，依次为17.3%（48/277）、15.9%（44/277）和15.2%（42/277），是该羊场莎能奶山羊球虫的优势虫种。综上所述，初步明确该羊场莎能奶山羊不仅普遍存在球虫感染，而且存在多种球虫混合感染和致病力较强的优势虫种。     

PPV SYBR GreenⅠ实时荧光定量PCR检测方法的建立及应用

【目的】建立一种能够快速、灵敏地检测猪细小病毒（PPV）的SYBR GreenⅠ实时荧光定量PCR方法。【方法】根据GenBank中的PPV VP2基因序列,设计并合成1对引物。通过常规PCR,扩增猪细小病毒VP2基因,并将其纯化的PCR产物克隆入pGEM-T Easy 载体中,构建重组质粒。对扩增程序中的荧光染料浓度、引物浓度和Mg²⁺浓度条件进行优化,建立最佳的荧光定量 PCR 反应体系和标准曲线。以阳性重组质粒为模板,建立SYBR GreenⅠ荧光定量PCR方法,对其灵敏性、特异性和重复性进行检验。应用建立的SYBR GreenⅠ荧光定量PCR方法,对临床60份疑似PPV病料进行检测,同时与血凝试验(HA)和常规PCR方法的检测效果进行比较。【结果】 在25 μL扩增体系中,Mg²⁺终浓度为4.5 mol/L、SYBR Green染料浓度为20 μmol/L、引物浓度为25 μmol/L时,本底反应最小、循环阈值最低、扩增效率最高。所建立的SYBR GreenⅠ实时荧光定量PCR方法能够特异、定量地检测猪细小病毒,灵敏度达20 TCID₅₀/mL;在临床样品检测中,其检出率比常规PCR方法高13.3%。【结论】 成功建立了PPV SYBR GreenⅠ实时荧光定量PCR检测方法,为临床猪细小病毒的早期诊断及定量分析病毒的感染程度奠定了基础。     

林麝应激生理状态与消化道球虫感染程度关系

为探索慢性应激与圈养林麝球虫感染之间的相关性，采用饱和盐水漂浮法对四川九药林麝繁育中心采集的粪便样本中的寄生虫卵进行检测，用麦克马斯特计数法对虫卵进行计数，应用酶联免疫吸附法测定粪便皮质醇代谢水平，并基于广义线性模型分析年龄、参配对粪便皮质醇代谢水平的影响，以及年龄、参配及粪便皮质醇代谢水平与球虫感染强度之间的关系。结果表明：年龄和参配的交互作用对粪便皮质醇代谢水平影响显著，3岁龄参配个体粪便皮质醇代谢水平显著低于6岁龄参配个体，其余3组间差异不显著。宿主年龄和参配对球虫感染强度无影响，但粪便皮质醇代谢水平对球虫感染强度影响极显著（GLMs, P < 0.01）。粪便皮质醇代谢水平和球虫感染强度呈极显著负相关（R = - 0.502, P < 0.01），3个浓度组之间球虫感染强度差异极显著（P < 0.01）。慢性应激会增加林麝寄生虫易感性，应激强度与寄生虫感染强度呈显著正相关关系。建议麝场不要选取3岁龄个体作为种麝，并减少人为刺激或扩大每个林麝个体的活动空间来降低林麝的应激反应，加强林麝的健康管护。     

基于荧光显色的IBV LAMP检测方法研究

【目的】建立基于荧光显色的可视化禽传染性支气管炎病毒（IBV）环介导等温扩增（LAMP）检测体系,为IBV的快速临床检测提供有力的技术支持。【方法】根据NCBI中收录的IBV 5a+5b基因的8个区域设计了3对LAMP引物,通过对反应体系各组分和条件的优化,建立IBV LAMP检测方法,并对该方法的特异性和敏感性进行验证。分别用SYBR Green I和一定浓度比的钙黄绿素/锰离子混合物作为显色剂,对IBV LAMP检测结果进行可视化判定。应用该检测体系和PCR方法对临床送检的60份样品同时进行检测,比较2种方法的阳性检出率。【结果】成功建立了IBV LAMP检测方法,该方法能够在等温（63 ℃）条件下1 h内完成反应,具有良好的敏感性和特异性,最低可以检出1拷贝/μL的阳性重组质粒,比普通PCR方法敏感100倍,而对其他病毒检测结果均为阴性。应用SYBR Green I和钙黄绿素/锰离子显色时,阴阳性样品均有强烈的颜色对比,其中0.05 mmol/L钙黄绿素与0.6 mmol/L锰离子混合液可以用于LAMP扩增产物的判断,其结果与琼脂糖凝胶电泳结果一致。在对60份临床样本的检测中,LAMP和PCR方法检测出的阳性样本数量分别为49份和42份。【结论】建立了基于荧光显色的IBV LAMP检测方法,该方法具有在科研机构、基层实验室特别是检测现场推广和应用的潜力。     

陕西省水稻种质资源的香味基因检测

【目的】明确陕西省主要水稻种质资源中香味基因的存在状况,为香型水稻育种提供依据。【方法】利用针对香味基因fgr开发的四引物扩增受阻突变体系PCR技术,对陕西省164份水稻种质资源的香味基因fgr进行检测。【结果】在164份供试水稻材料中,127份为非香材料,2份为香型纯合体,35份为杂合体。【结论】本试验检测结果真实可靠,所用四引物扩增变阻突变体系PCR可以作为香型水稻检测认定的有效方法;陕西省水稻种质资源中香味基因占有一定比例。     

猪圆环病毒3型和4型TaqMan双重实时荧光定量 PCR检测方法的建立

为了建立一种快速检测猪圆环病毒3型（PCV3）和 4 型（PCV4）的TaqMan双重实时荧光定量PCR检测方法，根据 GenBank 已登录的 PCV3 和 PCV4 基因保守序列设计特异性引物和 TaqMan 探针，经优化各反应条件，构建标准曲线，分析其敏感性、特异性和重复性，并利用建立的荧光定量 PCR 方法对采自安徽省的临床样品进行检测，与普通 PCR 方法进行一致性评价。结果显示，PCV3的标准曲线为Y=-3.534 6 logX+41.11（R²=1.00），PCV4的标准曲线为Y=-3.382 5 logX+40.67（R²=1.00）。PCV3 和PCV4 的检测限分别为49.5 和27.1 copies·μL ^-1。对猪圆环病毒1型（PCV1）和 2 型（PCV2）、猪流行性腹泻病毒（PEDV）、猪瘟病毒（CSFV）、伪狂犬病毒（PRV）及猪繁殖与呼吸综合征病毒（PRRSV）无特异性扩增，组内和组间变异系数均＜1%。临床样品检测结果显示， PCV3阳性检出率为 40.8%，PCV4 阳性检出率为 20.4%，混合感染率为 19.0%。建立了灵敏、特异，可同时快速、准确鉴别PCV3和PCV4的TaqMan双重实时荧光定量PCR检测方法，为PCV3和PCV4的检测和监测提供技术支撑。     

致犊牛腹泻埃希氏菌eaeA基因克隆和序列分析

旨在确定新疆地区致犊牛腹泻病中埃希氏大肠杆菌的基因型。从采自阿克苏周边的3个奶牛场30份患腹泻的犊牛粪便中分离、纯化、鉴定出34株埃希氏大肠杆菌。根据GenBank公布的大肠杆菌的eaeA基因序列,用Oligo 6.0软件分别设计2对特异性引物,利用聚合酶链式反应，对所分离大肠杆菌eaeA基因进行PCR扩增。结果表明，有4株PCR 产物为918 bp的目的片段,阳性率为11.8%(4/34)。将阳性样品进行序列分析，结果与已发表的序列同源率为100%。所测序列呈递GenBank数据库，得到序列登陆号为JQ350701、JQ350702、JQ350703和JQ350704。     

山西省某奶牛场球虫病流行病学调查与虫种鉴定

为了解山西省忻州某奶牛场艾美耳球虫感染率和虫种分布,为后期球虫病治疗及牛群饲养管理提供临床依据,采用饱和盐水漂浮法对采自奶牛场200头产后母牛和600只犊牛的800份新鲜粪便样品进行球虫卵囊分离收集,采用麦氏虫卵计数法和PCR方法对球虫卵囊进行检查和种类鉴定。结果表明,奶牛场艾美耳球虫的总感染率为32.75%,0～3月龄和5～12月龄犊牛的球虫感染率分别为36.33%和43.00%,产后母牛的球虫感染率为12.00%,5～12月龄犊牛的球虫感染情况较0～3月龄犊牛严重,产后母牛感染情况轻于犊牛;通过序列比对分析共鉴定出4种牛艾美耳球虫,分别是邱氏艾美耳球虫（77.48%）、牛艾美耳球虫（41.22%）、奥博艾美耳球虫（31.68%）和椭圆艾美耳球虫（14.50%）,以邱氏艾美耳球虫为优势虫种;所调查的奶牛中有多重感染的情况,鉴定的262份阳性粪便样本中有117份为感染2种以上球虫,混合感染率为44.66%,发现最多可混合感染4种球虫。5～12月龄犊牛的球虫混合感染情况较0～3月龄犊牛严重,而产后母牛多以1种球虫感染。     

等位基因特异扩增检测水稻抗稻瘟病基因Pi ta

为明确陕西省主要水稻种质资源中抗稻瘟病基因Pi ta的存在状况,为稻瘟病抗性育种提供依据。利用在抗稻瘟病基因Pi ta区域设计的四引物扩增受阻突变体系PCR方法,对陕西省2010-2012年水稻区域试验的327份材料进行Pi ta基因位点检测。结果表明,4份材料为抗性基因纯合体,40份材料为抗性基因杂合体,276份材料在Pi ta位点为感性基因纯合体,7份材料未检出条带。检测结果真实可靠,可以作为检测水稻Pi ta基因位点的有效方法。     

东方次睾吸虫PCR检测方法的建立及初步应用

为了快速准确地检测鸭、犬等动物东方次睾吸虫的感染情况,根据Gen Bank中发表的东方次睾吸虫ITS序列设计一对特异性引物,以粪便样品中虫卵DNA为模板,优化PCR反应条件,经过敏感性、特异性和重复性实验,建立检测动物粪便中东方次睾吸虫虫卵的方法。结果,阳性样品可扩增得到260 bp的特异性条带,华支睾吸虫、卷棘口吸虫、纤细背孔吸虫DNA样品检测均为阴性,检测到的最低虫卵数为0.031 25个/克粪便,表明研究建立的PCR检测方法具有较高的特异性和灵敏性。临床检测87份鸭粪样本,其中6份为阳性,阳性率为6.9%,结果显示大庆地区鸭子存在东方次睾吸虫感染,所建立的方法适合于鸭子及其他家禽东方次睾吸虫的检测。     

猪传染性胃肠炎病毒荧光定量RT-PCR检测方法的建立

【目的】建立一种能检测猪传染性胃肠炎病毒（TGEV）含量的荧光定量RT-PCR方法,为猪传染性胃肠炎（TGE）的诊断和防治提供技术支持。【方法】根据TGEV TH98株的N基因序列设计1对特异性引物,扩增出目的片段,连接克隆载体后构建质粒标准品;对荧光定量的循环条件进行优化,建立猪传染性胃肠炎病毒荧光定量RT-PCR检测方法,对其重复性、特异性进行检测,并与普通PCR检测方法进行比较,最后应用该方法对采自陕西杨凌周边的30份临床样品进行检测。【结果】成功构建了质粒标准品,建立了检测猪传染性胃肠炎病毒的荧光定量RT-PCR方法,该方法特异性高、重复性好、敏感性比普通PCR检测方法高2个数量级,对质粒标准品的线性检测范围为1.0×10⁷～1.0×10¹拷贝/μL。用建立的检测方法对从陕西杨凌周边猪场采集的30份样品进行检测,检出4份阳性,与普通PCR检测方法符合率为100%。【结论】建立的TGEV荧光定量RT-PCR方法敏感性高、特异性好、省时省力,可以对猪传染性胃肠炎病毒进行快速检测。     

3种检测布鲁氏菌荧光定量PCR方法的比较

为了筛选适用于家畜布鲁氏菌病检测的荧光定量PCR方法,合成目前报道最多的布鲁氏菌IS711插入序列、per基因和bcsp31基因的引物和探针,并分别对这3种荧光定量PCR方法的敏感性、特异性、重复性以及63份临床样品检测效果进行比较。结果显示：3种荧光定量PCR方法均具有较好的敏感性且均不与其他常见细菌发生交叉反应;3种方法的批内变异系数和批间变异系数均小于5%。在检测临床样品时,3种方法的敏感性均高于套式PCR方法,其中IS711荧光定量PCR方法与套式PCR方法符合率为95.24%,其他2种方法与套式PCR方法的符合率为98.41%。比较而言,IS711荧光定量PCR敏感性最高,更适合于布鲁氏菌核酸含量低的样品的检测。     

安徽3株柔嫩艾美耳球虫cox1基因部分序列的比对分析

为研究柔嫩艾美耳球虫不同地理株的线粒体细胞色素c氧化酶第1亚基(cox1)基因与球虫种群之间的遗传关系,以安徽3个地区的3株柔嫩艾美耳球虫为研究对象,通过卵囊的分离与纯化获得纯种虫株,然后应用PCR技术对柔嫩艾美球虫3个地理株的cox1序列进行扩增,并与GenBank上登录的鸡柔嫩艾美耳球虫、巨型艾美耳球虫、布氏艾美耳球虫和堆形艾美耳球虫虫株的相应序列进行比对分析。结果显示,每个虫株都成功扩增出800 bp左右的cox1部分有效序列(pcox1),与柔嫩艾美耳球虫pcox1序列种内无差异,pcox1相应序列种间的差异程度为9.9%～14.9%。表明柔嫩艾美耳球虫的cox1序列可作为艾美耳球虫种间遗传变异研究的标记,为进一步研究艾美耳球虫的群体遗传学特性和耐药性奠定了基础。     

4种致牛腹泻病毒多重荧光定量PCR检测方法的建立及应用

【目的】建立牛病毒性腹泻病毒（BVDV）、牛冠状病毒（BCoV）、牛轮状病毒（BRV）、牛恶性卡他热病毒（MCFV）4种致牛腹泻病毒多重荧光定量PCR检测方法,为BVDV、BCoV、BRV和MCFV的鉴别诊断提供技术支持。【方法】根据BVDV的5′UTR基因、BCoV的N基因、BRV的VP6基因和MCFV的ORF9基因的保守区域设计引物,克隆目的基因构建标准阳性重组质粒,建立可同时检测4种致牛腹泻病毒的多重荧光定量PCR检测方法,并对该方法的特异性、敏感性和重复性进行评价。用建立的多重荧光定量PCR检测方法对76份临床样品进行检测,并与常规PCR检测方法的结果进行比较。【结果】建立了BVDV、BCoV、BRV和MCFV多重荧光定量PCR检测方法,该方法建立的标准曲线线性关系良好,仅可特异性扩增出4种目标基因片段;对BVDV、MCFV、BRV和BCoV的最低检出限分别为9.4×10¹,1.4×10³,9.1×10¹和1.2×10²拷贝/μL,与普通PCR相比,灵敏性高出10～1 000倍;批内、批间差异均小于5%。76份临床样品检测结果显示,多重荧光定量PCR检测结果与普通PCR检测结果的符合率分别为98.7%（BCoV）、97.4%（BRV）、100.0%（BVDV）和100.0%（MCFV）。【结论】建立了BVDV、BCoV、BRV和MCFV多重荧光定量PCR检测方法,该方法特异性强、灵敏度高、重复性好,可用于牛腹泻病毒病原的实验室检测。     

猪Delta冠状病毒的流行病学调查及M基因序列分析

为了解猪Delta冠状病毒(Porcine deltacoronavirus,PDCoV)在发生腹泻疫情猪群中的感染情况,根据PDCoV M基因的保守序列设计了一对检测引物,建立了猪Delta冠状病毒的的检测方法,其最低核酸检测限量为3.92×10~3 copies/μL,特异性和灵敏度均较好。利用该方法对2015—2017年上海周边猪场的518份猪腹泻粪便样品进行检测,检测出25份PDCoV阳性样品,阳性感染率达4.8%。在所检出的阳性样本中,PDCoV与猪嵴病毒(Porcine kobuvirus,PKV)和猪星状病毒(Porcine astrovirus,PAstV)的混合感染率较高,分别为40%和48%;PDCoV与猪流行性腹泻病毒(Porcine epidemic diarrhea virus,PEDV)混合感染率为8.0%,未检测到PDCoV与猪传染性胃肠炎病毒(Transmissible gastroenteritis virus,TEGV)混合感染的样本。随机选取10份PDCoV阳性样本,对扩增的M基因片段同源性进行分析,结果发现,10份样品中核苷酸同源性达95.0%—99.6%,与GenBank登录的PDCoV毒株的同源性为96.1%—100%,说明目前流行的PDCoV毒株的遗传差异不大,该研究可为了解PDCoV流行情况提供参考依据。     

芸薹属植物细胞质特异分子标记的开发

开发芸薹属植物细胞质特异分子标记,为芸薹属植物种质资源鉴定、保护及育种利用奠定基础。33份芸薹属植物中,20份甘蓝型油菜,2份芥菜型油菜,2份埃塞俄比亚芥,3份甘蓝,2份白菜,2份黑芥,以及芸芥和板蓝根各1份作为对照,利用细胞质特异分子标记进行PCR扩增分析。笔者前期研发的一步多重PCR技术不仅能将pol、ogu、IP-ogu、nap、cam等5种细胞质类型鉴别开来,而且在埃塞俄比亚芥、黑芥、甘蓝、芸芥和板蓝根中扩增出特异的条带。引物Indel-F/R在具有nap细胞质的甘蓝型油菜材料中特异扩增出1个长度为344 bp的条带,该扩增产物比pol和cam细胞质材料中扩增产物多1个长度为93 bp的InDel,可作为区分nap细胞质的特异分子标记。引物mtSSR2-F/R和rsp3F/R-1在埃塞俄比亚芥和黑芥中扩增产物与其他参试芸薹属植物不同,可用作区分埃塞俄比亚芥和黑芥细胞质类型的分子标记。     

道真县兔场兔球虫感染情况调查

为掌握道真仡佬族苗族自治县兔场兔球虫感染情况，采用饱和盐水漂浮法和麦克马斯特虫卵计数法，对县域内2个兔场采集的77份不同年龄段兔新鲜粪便中兔球虫感染情况进行调查，利用PCR技术对兔球虫阳性粪便进行感染种类鉴定分析。结果表明：2个兔场兔球虫总感染率达71.4%，各年龄段兔均有不同程度的感染，以1～3月龄幼兔感染率最高，达96.9%，且多呈中度或重度感染。2个兔场感染的兔球虫主要是穿孔艾美耳球虫、维氏艾美耳球虫和大型艾美耳球虫，且均为混合感染。     

2种桑树病原真菌多重PCR检测方法的建立

目的 褐斑病与轮纹病是桑树Morus alba 的2种常见真菌性病害,危害严重,给生产上带来极大损失。本研究旨在快速准确地诊断2种病害的主要病原菌新褐斑壳丰孢Neophloeospora maculans与膝节霉Gonatophragmium triuniae。方法 基于多重PCR原理,针对2种病原菌的核糖体内转录间隔区(Internal transcribed spacer, ITS)序列设计多重PCR的特异性引物,优化多重PCR反应的条件,并通过对45份不同地区桑树褐斑病与轮纹病样本进行检测以验证所建立的多重PCR的可行性。结果 建立的多重PCR检测体系具有良好的可操作性,特异性良好,2种病原菌的DNA检测灵敏度分别达0.1 和1.0 pg/μL,通过对不同地区的田间收集的多份桑树病样进行检测,可以明显区分出不同地区2种病害病原菌的种类。结论 所建立的多重PCR技术可用于桑树褐斑病与轮纹病病原菌的快速检测,可为桑树真菌性病害的防控建立基础。