用于检测马铃薯X病毒株系（PVX-HB）的单克隆抗体

自Moretra等(1980)在南美发现PVK.HB株系以来,虽然其他地区尚未见报道,但PVX.HB打破抗性基因的特性(Jones,1985)已经引起病毒学家和育种学家的高度重视。鉴于该株系和PVX的其他株系在马铃薯上引起相似的症状,而用多克隆抗体的各种免疫学诊断方法,如ELlSA及免疫电镜等均难以将HB株系和PVX的其他株系区分开,人们寄希望于单克隆抗体能识别单一抗原决定簇的特性来解决这一难题,为建立分泌抗PVXHB株系特异性单克隆抗体杂交瘤细胞系,我们按常规免疫学方法经多次细胞融合均未能如愿(肖小文等1989)。经用PVX的其他株系对初生小鼠进     

马铃薯X病毒云南分离物单克隆抗体的制备及其检测应用

用马铃薯X病毒(Potato virus X,PVX)免疫的BALB/C鼠脾细胞与SP2/0鼠骨髓瘤细胞融合,经筛选克隆,获得2株能稳定传代并分泌抗PVX单克隆抗体(MAb)的杂交瘤细胞2B12和4E7,并分别制备它们的单抗腹水.2株单克隆抗体腹水间接ELISA效价在10-6以上,2B12和4E7的抗体类型及亚类均为IgG1,轻链均为κ链.利用这些单克隆抗体建立了抗原包被的间接ELISA(ACP-ELISA)检测PVX的方法.病叶经1:600倍稀释、提纯PVX病毒浓度为2 ng/mL(每孔的病毒绝对量为0.2 ng)时,该方法仍能检测到病毒.利用ACP-ELISA方法测定了田间样品,发现PVX在马铃薯上发病很普遍.     

分泌抗传染性法氏囊病病毒单克隆抗体杂交瘤细胞株的建立

利用超滤膜超滤浓缩法纯化的鸡传染性法氏囊病病毒 (Infectious Bursal Disease Virus)疫苗株 D78免疫 BALB/ c小鼠。取其脾细胞与 SP2 / 0骨髓瘤细胞进行融合 ,经筛选克隆 ,成功地建立了 13株分泌抗 IBDV D78的杂交瘤细胞株 ,这些杂交瘤细胞株的稳定性好、特异性强 ,腹水和无血清培养上清 (浓缩 30倍 )中 Mc Abs的效价分别达 16 6和 10 3以上     

抗犬瘟热病毒单克隆抗体杂交瘤细胞株的建立

[目的]筛选出稳定分泌抗犬瘟热病毒单克隆抗体的杂交瘤细胞株。[方法]用纯化的犬瘟热病毒(CDV)抗原免疫BALB/c小鼠,取脾细胞与SP2/0骨髓瘤细胞融合,经间接ELISA和有限稀释法克隆杂交瘤细胞。研究了杂交瘤细胞的稳定性和染色体数,测定了单克隆抗体的效价并鉴定其特异性和亚型。[结果]经反复筛选和亚克隆后,共获得3株能稳定分泌抗CDV单克隆抗体的杂交瘤细胞株。3株单抗对CDV均有较高的特异性,与犬传染性肝炎病毒、犬细小病毒均不反应。3株杂交瘤细胞的腹水效价为1∶(8 000~128 000),细胞培养上清效价为1∶(256~512),染色体数为80~100。3株单克隆抗体重链均属于IgG1,轻链均属于κ链。[结论]该研究为研制CDV快速检测试剂盒奠定了基础。     

PVY/PVX协生作用对病毒浓度及寄主细胞超微结构的影响

 以烟草品种三生烟 (N .tabacumcv .Samsun)为测试寄主 ,采用酶联免疫检测实验 (TAS ELISA)和电镜观察的方法 ,在温室条件下研究了马铃薯Y病毒 (PVY)和马铃薯X病毒 (PVX)复合侵染所引起的寄主症状和病毒浓度变化的特点、不同条件下复合侵染时病毒浓度的变化规律以及复合侵染对寄主细胞超微结构的影响。结果表明 ,PVY/PVX在烟草植株内发生了协生作用 ,PVY是协生病毒 ,PVX是被协生病毒。与单独侵染相比 ,PVY和PVX的复合侵染使烟草植株症状明显加重。PVY在复合侵染植株中的浓度与在单独侵染植株中相比 ,没有明显的变化 ,而PVX在复合侵染植株中的浓度明显高于在单独侵染植株中的浓度。这种现象不受PVY株系、处理季节和接种次序的影响。但是 ,不同PVY株系、不同处理季节或不同接种次序对PVY/PVX协生作用中PVX浓度的影响程度存在着一定的差异。电镜观察表明 ,与不接种病毒或单独侵染的植株相比 ,受复合侵染的烟草叶片细胞超微结构发生了明显的病理学变化。细胞肿胀 ,叶绿体、线粒体等细胞器受到严重损伤 ,细胞质内有风轮状、薄片状的内含体 ,由于在细胞质中常常有大量纤维状的PVX病毒粒子聚集体存在 ,这意味着PVX浓度的增加可能是在复合侵染的细胞中病毒大量繁殖的结果。     

兔出血症病毒VP60蛋白单克隆抗体的制备及鉴定

以纯化的重组兔出血症病毒核衣壳蛋白(VP60)为抗原,免疫BALB/c小鼠,采用杂交瘤细胞技术制备抗衣壳蛋白的单克隆抗体,获得了2株能稳定分泌抗VP60蛋白单克隆抗体的杂交瘤细胞株(AE11和AH4).分别利用Western blot、间接ELISA和间接免疫荧光(IFA)等方法对单抗的免疫活性和特异性进行检测,结果证明,此两株单抗均能识别重组的VP60和天然病毒的衣壳蛋白,而IFA结果显示只有AE11能和RHDV反应,可观察到强烈的特异性绿色荧光,表明成功制备了抗RHDV的VP60特异性单抗.     

抗兔病毒性出血症病毒单克隆抗体的制备

通过抗兔病毒性出血症病毒(RHDV)杂交瘤细胞株的筛选,其中一株连续克隆3次,在培养瓶中传代1个月,用酶联免疫吸附试验(ELISA)测定,分泌单克隆抗体(McAb)性能稳定。杂交瘤细胞株的小鼠腹水滴度为1:1600～1:3200。利用McAb腹水作一抗,经免疫荧光检测RHDV感染的细胞片,可发现细胞核内有特异性荧光颗粒,滴度为1:200。杂交瘤细胞株染色体的分析,染色体数在98±10,符合杂交瘤细胞株的特征。经琼脂扩散法对McAb亚类的分析测定结果与抗鼠IgG和IgG_3出现沉淀线。     

抗猪流行性腹泻病毒单克隆抗体的制备与鉴定

为了制备抗猪流行性腹泻病毒(PEDV)的单克隆抗体(MAb),本试验将Vero细胞中增殖的PEDV超速离心纯化,作为免疫原免疫BALB/c雌性小鼠,采用常规的淋巴细胞杂交瘤技术和PEDV重组S蛋白为基础的间接ELISA方法,制备并筛选能稳定分泌PEDV特异性抗体的杂交瘤细胞;分别采用间接ELISA、Western blot和间接免疫荧光(IFA)试验,对单克隆抗体的亚型、特异性等生物学特性进行鉴定。结果表明,本试验成功获得了1株稳定分泌PEDV特异性抗体的杂交瘤细胞株5C3。MAb亚类鉴定为IgM,轻链为k型。杂交瘤细胞连续传至20代,细胞培养上清液和小鼠腹水抗体效价分别稳定在1∶600和1∶10 000。特异性试验结果显示,MAb不与猪传染性胃肠炎病毒(TGEV)、猪伪狂犬病毒(PrV)、猪圆环病毒(PCV2)发生交叉反应。western-blot结果显示,MAb能特异性识别PEDV的重组S蛋白。IFA试验结果表明,MAb能与PEDV感染的vero细胞产生特异性荧光。说明本试验获得的MAb能特异性识别重组及天然的PEDV S蛋白,具有良好的抗原性和特异性。     

PEDVN蛋白单克隆抗体的制备及间接免疫荧光检测方法的建立

【目的】制备猪流行性腹泻病毒(PEDV) N蛋白单克隆抗体,并建立检测PEDV的间接免疫荧光试验方法。【方法】以重组表达的PEDV N蛋白为免疫原,免疫8周龄雌性BALB/c小鼠,分离高抗体效价小鼠的脾细胞,与SP2/0细胞融合。筛选分泌抗PEDV N蛋白单克隆抗体的杂交瘤细胞株。在已经感染PEDV的Vero细胞中,以抗PEDV N蛋白的单克隆抗体为一抗,FITC-羊抗鼠IgG为二抗,建立PEDV的间接免疫荧光检测方法。【结果】制备的杂交瘤细胞株可以稳定分泌抗PEDV N蛋白抗体,细胞上清液的ELISA抗体效价在1∶3 200以上,而诱导的小鼠腹水抗体效价在1∶1 000 000以上。将单克隆抗体应用在间接免疫荧光试验时,最适条件为-20℃80%(φ)丙酮溶液中固定30 min;一抗用PBS缓冲液按体积比1∶1 000稀释,4℃条件下过夜孵育;二抗用PBS缓冲液按体积比1∶100稀释,37℃条件下孵育1 h。以建立的间接免疫荧光试验方法检测细胞中的猪传染性胃肠炎病毒(TGEV)、猪瘟病毒(CSFV)、猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)、猪伪狂犬病毒(PPRV)、猪肠道α冠状病毒(PEAV)、猪轮状病毒(PoRV)和PEDV,只有PEDV显示阳性,其他病毒均为阴性。【结论】制备了抗PEDV N蛋白单克隆抗体,以该抗体为一抗建立检测PEDV的间接免疫荧光试验方法具有良好的特异性,为PEDV的实验室检测及PEDV在培养细胞中的定位和动态分布提供了有效的手段。     

抗鸭副粘病毒单克隆抗体的制备及其特性鉴定

【目的】制备抗鸭副粘病毒(DPMV)的单克隆抗体,为鸭副粘病毒病免疫学诊断方法的建立奠定基础。【方法】采用差速和蔗糖不连续密度梯度离心法提纯DPMV,免疫BALB/c小鼠,取脾细胞与骨髓瘤细胞株SP2/0融合,采用间接ELISA、间接免疫荧光试验(IFA)和血凝抑制(HI)试验等方法筛选阳性杂交瘤细胞株,并测定其生物学特性。【结果】筛选到7株能稳定分泌抗DPMV单克隆抗体的杂交瘤细胞株,分别命名为J28、F4、B3、E39、E41、A12和A30。这7株单克隆抗体都具有ELISA和1FA特性,其中J28和F4还具有HI和中和特性。免疫球蛋白亚类测定结果显示,J28和F4均为IgG1,其他5株均为IgM。相加ELISA试验结果显示,单抗B3,J28与F4,A30与E39/E41/A12分别识别3个不同的抗原位点。特异性测定结果显示,7株单克隆抗体与雏番鸭细小病毒(MPV)、鹅细小病毒(GPV)、鸭肝炎病毒(DHV)、番鸭呼肠孤病毒(MDRV)及正常细胞均无交叉反应。【结论】筛选出了7株具有ELISA、1FA等特性且分泌抗DPMV单克隆抗体的杂交瘤细胞株,并明确了各株单克隆抗体的特性,为鸭副粘病毒病的免疫治疗和临床诊断奠定了基础。     

抗牛轮状病毒单克隆抗体杂交瘤细胞株的建立

以从黑龙江省腹泻犊牛粪便中分离的牛轮状病毒(bovine rotavirus)为抗原,免疫6～8周龄BALB/_c小鼠,取血清抗体阳性小鼠的脾细胞与SP_(2/0)骨髓瘤细胞融合。用ELISA间接法检测抗体,通过有限稀释法,克隆出一株分泌抗牛轮状病毒单克隆抗体的杂交瘤细胞株。经鉴定,此杂交瘤细胞株分泌的单克隆抗体为IgM,轻链为K链。通过连续传代证明,此杂交瘤细胞株具有稳定分泌单克隆抗体的性质。杂交瘤细胞诱生BALB/_c小鼠腹水的单克隆抗体滴度可达1:10000以上。     

猪圆环病毒衣壳蛋白单克隆抗体的制备

以大肠杆菌表达的猪圆环病毒2型(PCV2)重组衣壳蛋白(GST-CAP2)为抗原,以一定的免疫程序接种BALB/c小鼠后,取其脾细胞与骨髓瘤细胞SP2/0按常规杂交瘤技术进行融合.以GST-CAP2以及猪圆环病毒1型(PCV1)重组衣壳蛋白(GST-CAP1)为包被抗原,经间接ELISA筛选获得2株能稳定分泌针对PCV的单克隆抗体的杂交瘤细胞株(M1和G1).通过dot-ELISA、Western-blotting以及间接免疫荧光(IFA)技术证明G1株分泌的单抗同时识别PCV1和PCV2, 而M1株分泌的单抗则特异性针对PCV2.该单抗的制备将为进一步建立快速检测PCV的方法奠定基础.     

抗猪轮状病毒VP6单克隆抗体的制备与鉴定

用纯化的重组PRV VP6蛋白免疫BALB/c小鼠,运用淋巴细胞杂交瘤技术,通过间接ELISA筛选,获得了1株稳定分泌抗PRV VP6的单克隆抗体的杂交瘤细胞株,命名C5D10。经鉴定C5D10为IgG1亚类,杂交瘤细胞的平均染色体数为93,细胞培养液上清及腹水效价分别为18∶00和11∶×106,且C5D10单克隆抗体不与猪传染性胃肠炎病毒、猪流行性腹泻病毒、猪伪狂犬病病毒发生交叉反应,显示良好的特异性。     

分泌抗植物青枯细菌菌系特异性单克隆抗体杂交瘤细胞株的建立

分泌抗植物青枯病病原细菌(Pseudomonassolanacearum E.F.smith)菌系特异性单克隆抗体的杂交瘤细胞株已经建立,从1985年10月上旬在马尼拉召开的国际青枯细菌专题学术讨论会上获悉,这是国际上青枯细菌研究中首批建立的杂交瘤细胞系,也是国内植物细菌研究中首次建立的杂交瘤细胞系。 用从番茄、马铃薯、甘薯、花生、姜、油橄榄和桑等7种作物上分离的代表3个生理小种和5个生化型的青枯细菌的9个菌株为抗原,分别以其     

DNA免疫制备猪传染性胃肠炎病毒S蛋白单克隆抗体

利用含有猪传染性胃肠炎病毒S基因主要抗原位点的重组质粒PCI-Sa免疫BALB/c小鼠,通过细胞融合技术,间接ELISA方法进行筛选和有限稀释法3次克隆,获得1株稳定分泌抗TGEV重组S蛋白单克隆抗体的杂交瘤细胞株,命名为E6D9A12,其染色体平均计数为88±10对,间接ELISA检测制备腹水抗体效价为1:6×105,分泌抗体亚类为IgG2a型。杂交瘤细胞上清与猪流行性腹泻病毒(PEDV)、猪轮状病毒(PRV)、猪伪狂犬病病毒(PrV)均不发生交叉反应;与TGEV感染细胞经间接免疫荧光检测均呈黄绿色荧光;与TGEV经Dot-ELISA检测呈特异性反应。     

抗番鸭呼肠孤病毒(MDRV)单克隆抗体的制备及应用

【目的】制备抗番鸭呼肠孤病毒（MDRV）的单克隆抗体,建立番鸭呼肠孤病毒病的间接免疫荧光（IFA）快速诊断方法。【方法】制备MDRV抗原,用之免疫Babl/c小鼠,取免疫小鼠脾细胞和SP2/0骨髓瘤细胞进行融合,采用IFA和ELISA筛选阳性杂交瘤细胞株,体内诱生腹水法制备单克隆抗体,检测其生物学特性,应用制备的单克隆抗体建立MDRV IFA快速诊断方法。【结果】筛选到237-11,45-12和3-H3 3株特异性好并能稳定分泌抗MDRV单克隆抗体的杂交瘤细胞株,其中45-12株单抗为IgM亚型,237-11和3-H3株单抗为IgG3亚型。45-12和3-H3 2株单抗具有ELISA特性,效价分别为10-4和10-5;237-11株单抗具有IFA特性,效价达10³。特异性测定结果显示,3株单抗仅与MDRV反应,而与正常细胞培养物（MDEF）、番鸭细小病毒（MPV）、鹅细小病毒(GPV)、禽呼肠孤病毒(ARV) 、鸭副黏病毒（PMV）和鸭肝炎病毒（DHV）均无交叉反应。应用抗MDRV单抗建立的IFA方法与病毒分离法（VI）的符合率为91%。【结论】筛选到2株具有ELISA特性、1株具有IFA特性且能分泌抗MDRV单克隆抗体的杂交瘤细胞株,建立了MDRV IFA快速诊断方法,为番鸭呼肠孤病毒病的快速诊断奠定了基础。     

猪细小病毒单克隆抗体杂交瘤细胞株的建立及初步应用

用经超滤浓缩、PEG 沉淀,氯化铯密度梯度离心纯化的猪细小病毒(PPV)免疫 BALB/C 小白鼠,取免疫鼠脾细胞与骨髓瘤细胞 SP_2/O在PEG 存在下融合,经 HAT 筛选、ELlSA 测定及3次克隆化后,获得3株(P-15—36—6,P-15—45—51,P—15—52—28)能持续稳定分泌抗 PPV 单克隆抗体的杂交瘤细胞株,3株杂交瘤细胞的染色体数均在95条以上,经分类测定,其免疫球蛋白均属 Ig G,且均为 IgG_1亚类。阻断试验证明单抗具有抗 PPV 的特异性。利用间接 ELISA 抑制试验进行了单抗在诊断上应用研究。     

抗猪传染性胃肠炎病毒单克隆抗体的研制及应用

将纯化的猜传染性胃肠炎病毒免疫 BALB/C 小白鼠后,取免疫脾细胞与骨髓瘤细胞在 PEG 存在下进行融合,HAT-1640培养液筛选,并用 ELISA 间接法检测阳性克隆。通过有限稀释法进行三次克隆化后,获得了二株稳定分泌抗 TGEV 的单克隆抗体杂交瘤细胞株。杂交瘤细胞染色体皆在95条以上;其分泌抗体均属 IgG_1亚类。通过阻断试验证明其作用的特异性。对该单抗在诊断上的初步应用作了探讨。     

反转录-环介导等温扩增技术(LAMP)快速检测马铃薯病毒

为寻求低成本快速准确灵敏度高的马铃薯病毒检测方法,根据马铃薯X病毒(Potato virus X,PVX)、马铃薯Y病毒(Potato virus Y,PVY)和马铃薯卷叶病毒(Potato leafroll virus,PLRV)的外壳蛋白基因序列设计4条特异引物,建立LAMP检测技术。结果表明:LAMP检测方法灵敏度下限是10个拷贝的病毒量,该方法检测PVX、PVY和PLRV特异性好,灵敏度高,1h可完成检测,且检测成本低。     

H5亚型禽流感病毒血凝素蛋白单克隆抗体的制备及鉴定

用纯化的H5亚型禽流感病毒(AIV)抗原免疫Balb/C小鼠,取免疫小鼠脾细胞与SP2/0骨髓瘤细胞融合,经筛选,获得9株稳定分泌单克隆抗体的杂交瘤细胞株,其中4株能高效分泌血凝素(HA)蛋白特异性的单克隆抗体.特异性试验表明,IE6单克隆抗体仅与试验的H5病毒株反应,而不与新城疫病毒(NDV)、H9亚型AIV和产蛋下降综合症病毒(EDSV)反应.这9株单克隆抗体分别为IgG1、IgG2a、IgG2b、IgM亚类,κ轻链.