一种基于重组截短Gc_(aa407～614)蛋白的赤羽病病毒抗体间接ELISA方法的建立

为建立一种检测赤羽病病毒(Akabane virus,AKAV)抗体的ELISA方法,对Gc蛋白从407位至614位氨基酸的编码序列,经密码子优化后进行基因合成,然后克隆至重组表达载体PET-32a(+),转化大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞,用1 mmol/L IPTG在37℃进行诱导表达。用Ni~(+2)-NTA树脂亲和层析方法纯化重组蛋白(trGc_(aa407~614)),以Western blotting检测其抗原性;用纯化trGc_(aa407~614)建立间接ELISA方法(trGc_(aa407~614)-ELISA),并评价该方法的特异性、敏感性和重复性。结果显示:重组蛋白trGc_(aa407~614)以包涵体形式在大肠杆菌中高效表达,经Ni~(+2)-NTA树脂亲和层析纯化后的浓度2.4 mg/mL,纯度为94%,对山羊抗AKAV阳性血清呈现较好的抗原反应性;所建立的trGc_(aa407~614)-ELISA方法的最佳抗原包被浓度为4.0μg/mL,血清稀释度为1:80,血清阴阳性的OD450临界值为0.318;该方法对AKAV阳性血清呈特异性反应,组内试验和组间试验的变异系数均小于10%。用该方法对273份进口牛血清进行AKAV抗体检测,发现10份血清为阳性。总之,本研究建立的trGc_(aa407~614)-ELISA方法为血清样品中赤羽病病毒抗体的检测提供了有效手段。     

裂谷热病毒Gc蛋白主要抗原区的表达、纯化及鉴定

根据裂谷热病毒(Rift valley fever virus,RVFV)M基因(Gen Bank登录号:DQ380206)序列,用PCR方法扩增其主要抗原区,将目的基因克隆至原核表达质粒p ColdⅠ中,将重组质粒转化到BL21感受态细胞中,诱导表达重组蛋白,将表达蛋白利用His-tag Ni柱进行亲和层析纯化。纯化后的蛋白分别应用SDS-PAGE、Western blot方法鉴定,结果显示,本研究不仅成功表达出Gc蛋白的主要抗原区,而且具有良好抗原性,为后续裂谷热抗原ELISA试剂盒的研制奠定了物质基础。     

巴泰病毒N5aa-90aa重组肽段的原核表达纯化及多克隆抗体的制备

巴泰病毒(BATV)是一种虫媒病毒,属于布尼亚病毒科成员,其核衣壳N蛋白具有高度保守性,可诱导机体产生较好的抗体反应,常用做诊断抗原。本研究通过对N蛋白强抗原性肽段N_5aa-90aa进行密码子优化,将其插入到p ET-32a(+)载体,并转化到大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞中表达,通过不同IPTG浓度和诱导时间确定最佳蛋白表达条件。利用镍柱亲和层析方法对r His-N_5aa-90aa肽段进行纯化。通过Western blot对r His-N_5aa-90aa肽段进行验证,将r His-N_5aa-90aa肽段免疫新西兰白兔制备多克隆抗体,间接ELISA测定其抗体效价。结果显示：本研究成功构建了p ET-32a-N_5aa-90aa重组质粒,在IPTG终浓度为0.1 mmol/L、37℃诱导5 h可获得大量重组蛋白;SDS-PAGE电泳结果显示重组r His-N_5aa-90aa肽段分子质量约28.6 kDa,蛋白浓度为0.256 mg/mL;经Western...     

PPR与RP病毒N蛋白片段的克隆表达与纯化

目的选取PPRV和RPVN蛋白中抗原性较强、氨基酸差异性较大的片段进行重组表达。方法对PPRV和RPVN蛋白中51-175aa、376-525aa蛋白片段基因进行大肠杆菌偏爱密码子优化后人工合成,利用分子生物学技术,将目的基因分别克隆至原核表达载体pET-28a(+)构建重组表达质粒,将重组表达质粒转化至E.coliBL21(DE3),诱导表达并纯化PPRV与RPVN蛋白中51-175aa、376-525aa片段。结果得到了分子量分别约17.8kD、20.6kD的各两段融合蛋白。结论本研究成功表达了PPRV和RPVN蛋白中抗原性较强、氨基酸差异性较大的51-175aa和376-525aa蛋白片段,为制备能区别PPR和RP病毒的特异性单抗提供了抗原。     

猪细小病毒6型ORF2基因的截短表达及多克隆抗体制备

【目的】原核截短表达猪细小病毒6型(Porcine parvovirus type 6,PPV6)ORF2基因,并制备PPV6 VP1₍(348 aa-675 aa))蛋白多克隆抗体,为后续研究该蛋白的生物学功能提供材料。【方法】以PPV6分离毒株基因组为模板,PCR扩增获得ORF2截短基因片段,将其克隆至原核表达载体pET30a(+)中构建重组质粒pET30a-PPV6-ORF2。经酶切和测序鉴定后,将重组质粒转化大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞,IPTG诱导表达,Ni-NTA树脂亲和层析纯化,通过SDS-PAGE和Western blotting鉴定纯化后重组蛋白。将纯化后的重组蛋白与弗氏佐剂混匀乳化,免疫新西兰大耳白兔制备多克隆抗体,采用Western blotting、间接免疫荧光试验(IFA)和间接ELISA鉴定免疫兔血清特异性。【结果】成功构建了pET30a-PPV6-ORF2重组表达载体,原核截短表达了PPV6 VP1₍(348 aa-675 aa))蛋白;SDS-PAGE结果显示,重组PPV6 VP1₍     

SS2溶菌酶释放蛋白(MRP)B细胞表位预测、原核表达及免疫学特性

运用ANTHEPROT 5.0综合分析二级结构、亲水性、表面可及性与抗原性指数,预测MRP的B细胞优势袁位簇;PCR扩增出表达预测的抗原肽段的基因(mrp-1),构建重组原核表达载体pET32a-mrp-1,IPTG诱导表达,以渗透性休克法纯化重组蛋白;使用重组蛋白免疫血清和灭活猪链球菌2型SS2免疫血清Western blotting检测重组蛋白的免疫原性及其与SS2免疫血清的反应性;纯化的重组蛋白免疫雌性SPF昆明小鼠,SS2攻毒受试动物评估重组蛋白对小鼠的免疫保护力.Western blotting显示预测的950～1 210 aa肽段与PET32a重组表达的蛋白(MRP)具有良好的免疫原性和反应性;攻毒试验结果表明重组蛋白对小鼠的免疫保护率为菌体免疫所提供保护率的66.7％.研究为利用该细胞表位簇作为高效免疫制剂奠定了基础.     

水貂阿留申病毒不同密度表位肽的串联表达研究

为比较含有水貂阿留申病毒(ADV)VP2蛋白不同表位密度重组蛋白的抗原性,本研究将抗原表位肽的编码序列进行2、4、6、8重复串联,得到4个表位串联体P2、P4、P6、P8,将其克隆到表达载体pET-30a(+)上,构建4个重组质粒,在大肠杆菌系统中诱导表达;经Western Blot和对流免疫电泳(CIEP)鉴定其抗原性。采用间接ELISA方法对各重组蛋白进行抗原性分析比较。结果显示,成功表达的3个重组蛋白PP4、PP6、PP8均具有良好的抗原性;8段表位肽串联的重组蛋白PP8的抗原性最强。本研究制备的串联重组蛋白为建立ADV血清学诊断方法提供了科学依据。     

巴泰病毒G1189aa-239aa肽段的原核表达、纯化及间接ELISA方法的建立

本研究旨在获得高纯度巴泰病毒（Batai virus,BATV） G1蛋白强抗原性肽段,并建立一种用于检测BATV羊血清抗体的间接ELISA方法。首先对G1蛋白51个氨基酸编码的189－239位氨基酸强抗原肽段进行密码子优化,基因合成后构建重组表达质粒pET-32a-G1_189aa-239aa,转化大肠杆菌BL21感受态细胞进行诱导表达。优化表达条件获得大量rHis-G1_189aa-239aa肽段,利用镍柱亲和层析方法进行纯化,并用BCA试剂盒进行蛋白浓度的测定。通过Western blotting对rHis-G1_189aa-239aa肽段进行抗原特异性分析,以rHis-G1_189aa-239aa肽段为抗原,羊BATV阳性血清作为抗体,通过方阵滴定优化反应条件,建立BATV间接ELISA检测方法。SDS-PAGE结果显示,rHis-G1_189aa-239aa肽段在大肠杆菌中主要以包涵体形式存在,分子质量为24.5 ku,在0.1 mmol/L的IPTG诱导5 h后rHis-G1_189aa-239aa肽段表达量达到峰值。通过镍柱亲和层析纯化后,测得蛋白浓度为0.296 mg/mL。Western blotting结果显示,rHis-G1_189aa-239aa肽段特异性较好。以rHis-G1_189aa-239aa肽段为抗原建立的间接ELISA方法,通过条件优化确定最佳抗原包被浓度为2.5 μg/mL,血清和二抗稀释度为1∶60和1∶10 000。样品D_{450 nm}值≥0.367为阳性,D_{450 nm}值≤0.319为阴性。该方法与山羊痘病毒和布鲁氏杆菌的阳性血清均无交叉反应,批内和批间的变异系数均<10%,阳性血清最高可稀释至1 600倍,该方法具有特异性强、灵敏性高和重复性好的特点。利用本方法对云南地区的120份羊血清样本进行检测,血清阳性率为21.67%。本研究获得了特异性强和纯度较高的rHis-G1_189aa-239aa肽段,建立了间接ELISA方法,可应用于羊BATV血清流行病学调查,为疫病防控及致病机制研究奠定基础。     

赤羽病病毒Gcaa465～704的杆状病毒表达和单克隆抗体制备

为制备针对赤羽病病毒(AKAV)糖蛋白Gc的单克隆抗体(mAb),本试验选取AKAV Gc蛋白第465～704位氨基酸的基因序列进行密码子优化并合成至pFastBac HTB载体;通过蓝白斑筛选和昆虫细胞杆状病毒表达系统制备重组AKAV Gc_aa465～704蛋白,纯化后免疫小鼠;通过细胞融合和亚克隆筛选阳性杂交瘤细胞,利用Western blot和间接免疫荧光试验(IFA)对mAb特性进行鉴定。结果显示,本试验成功筛选出1株可稳定分泌抗AKAV Gc_aa465～704蛋白mAb的杂交瘤细胞株4D1,Western blot结果显示,mAb 4D1可特异性识别AKAV Gc_aa465～704蛋白;IFA结果显示,mAb 4D1能够与AKAV感染的BHK21细胞发生反应。结果表明,本试验成功制备抗AKAV Gc_aa465～704蛋白mAb,为进一步研究AKAV Gc蛋白生物学功能和建立AKAV检测方法提供技术支持。     

表达CSFV E2线性表位的PCV2病毒样颗粒的制备及免疫原性研究

为制备携带猪瘟病毒(CSFV) E2蛋白的猪圆环病毒2型(PCV2)病毒样颗粒(VLP),并在小鼠体内评价其免疫原性,本研究采用PCR扩增PCV2 Cap基因,利用重叠延伸PCR将PCV2 Cap蛋白的诱饵表位(aa169～aa180)替换成编码两个连续的CSFV E2蛋白线性表位(aa829～aa837)的融合基因(PCV2-Cap^169～180-E2^829～837)经测序鉴定正确后克隆至载体pET-32a(+)中,构建重组质粒p-Cap-E2并采用PCR方法鉴定正确后转化大肠杆菌BL21 (DE3),经IPTG诱导表达重组蛋白(PCV2-Cap-E2),采用改良的镍亲和层析法纯化重组蛋白,并利用SDS-PAGE与western blot对重组蛋白的表达形式及反应原性鉴定;利用透射电镜观察纯化的重组蛋白能否形成VLP;利用本研究制备的VLP、PCV2及CSFV商品化疫苗分别免疫小鼠,采用ELISA方法检测免疫后不同时间小鼠体内的抗体水平及细胞因子含量。SDS-PAGE结果显示,在49 ku处出现目的条带,且重组蛋白主要以可溶性形式表达,纯化...     

携带BCoV抗原表位的乙型肝炎病毒核心抗原病毒样颗粒的制备及免疫效果评价

为了制备可用于牛冠状病毒(BCoV)亚单位疫苗的含BCoV S蛋白抗原表位的病毒样颗粒(VLP)，本研究将BCoV S1和S2蛋白中含B细胞表位的aa351～aa403 (159 bp)和aa771～aa784 (42 bp)对应的密码子按大肠杆菌偏好性原则优化后插入乙型肝炎病毒核心抗原(HBcAg)主要免疫显性区域(MIR)，合成该重组基因后克隆至pET-32a(+)，经酶切鉴定显示正确构建了重组质粒pET-32a(+)-HBcAg-BCoV S1+S2。将该重组质粒分别转化E.coli BL21(DE3)和伴侣感受态细胞BL21(DE3)(含pG-KJE8分子伴侣质粒)，经诱导表达后采用镍柱亲和层析法纯化两种不同表达形式的重组蛋白，SDS-PAGE检测重组蛋白的表达及纯化效果，结果显示两种表达系统均正确表达了重组蛋白，分别命名为VLP-A、VLP-B，前者为包涵体表达，后者为可溶性表达。纯化后浓度分别为0.9 mg/mL、1.4 mg/m L。利用透射电镜观察纯化后的两种重组蛋白是否形成VLP，结果显示二者均形成VLP，且可溶性表达的重组蛋白形成的VLP产量略高。将两种VLP乳化后...     

猪链球菌2型分解代谢控制蛋白A的克隆和原核表达

原核表达猪链球菌2型分解代谢控制蛋白A(catabolite control protein A,ccpA)并进行纯化,通过免疫印迹反应初步鉴定重组蛋白的抗原性和特异性。采用PCR方法,扩增ccpA基因序列,克隆至原核表达载体pET-28a中,转入大肠杆菌BL21中进行诱导、表达和亲和层析纯化;经Western blotting初步评价ccpA的抗原性。重组原核表达质粒pET-28a-ccpA经双酶切及测序证明构建正确;表达的重组蛋白相对分子质量约38000,能被相关抗体所识别。因此,能成功在大肠杆菌中表达猪链球菌2型ccpA,为猪链球菌2型相关调节蛋白的免疫学研究奠定基础。     

番鸭细小病毒非结构蛋白B细胞线性抗原表位的鉴定

为了分析番鸭细小病毒(muscovy duck parvovirus,MDPV)YL08株NS1蛋白(氨基酸序列全长627 aa)抗原表位,本研究设计了一套覆盖整个NS1蛋白的短肽,短肽长为30个氨基酸左右,有10个氨基酸重叠。为了表达这些短肽,共设计合成了31对互补的寡核苷酸片段。每对寡核苷酸片段5'端磷酸化。上述寡核苷酸片段退火后,插入至原核表达载体p ET-32a(+)中,经IPTG诱导获得了相应重组蛋白的表达。利用切胶纯化的方法对表达蛋白进行了纯化。应用MDPV YL08株人工感染番鸭血清对表达的31个重组蛋白的抗原性进行了检测,Western blot结果表明,表达的7个融合蛋白NS(481-510)、NS(501-530)、NS(521-550)、NS(541-570)、NS(561-590)、NS(581-610)和NS(601-627)能被MDPV感染血清所识别,而其他融合蛋白不能被MDPV感染血清所识别。同时,上述7个表达的融合蛋白不与灭活MDPV免疫番鸭血清反应。综合上述试验结果,MDPV YL08株NS1蛋白的B细胞线性抗原表位区位于NS1蛋白的羧基末端481 aa~627 aa。Dot-ELISA试验表明,重组蛋白NS(501-530)的抗原性相对更强。本研究为建立基于抗原表位的MDPV自然感染和人工免疫番鸭的鉴别诊断方法提供了理论依据。     

1型鸭甲肝病毒VP3蛋白的抗血清中和活性分析及B细胞表位鉴定

旨在探究1型鸭甲肝病毒(DHAV-1)VP3蛋白抗血清的中和活性并鉴定VP3的线性B细胞表位。利用pGEX-4T-1表达载体,在BL21(DE3)宿主菌中原核表达DHAV-1 VP3基因,以切胶纯化出的蛋白质为抗原免疫兔制备多克隆抗体,通过鸡胚中和试验对多抗的中和效价进行检测;采用KarplusSchulz、Emini、Jameson-Wolf和Parker方法分别对柔韧性、表面可及性、抗原性及亲水性进行分析,得到了4条候选线性B细胞表位,以制备的兔抗VP3多克隆抗体为一抗,通过间接ELISA方法对人工合成的B细胞表位进行鉴定,并进一步用临床鸭血清样品对鉴定的B细胞表位的抗体检测能力进行评估。结果显示,VP3在BL21(DE3)中以包涵体形式表达,大小约54ku,Western blot分析表明重组蛋白质具有较好的反应原性。制备的兔抗VP3多克隆抗体的琼扩效价达到1∶16,并能中和DHAV-1,中和效价为1∶39;利用间接ELISA鉴定出GKRKPCRRPIHKPKNPPQEP(1—20aa)、FNTGRYQMSWYPIADGEQSL(131—150aa)和VNSSAPSNID(200—209aa)为VP3的B细胞表位,抗体检测能力试验结果显示表位肽可检测临床DHAV-1鸭血清。本研究表明DHAV-1VP3的抗血清具备一定的中和活性,1—20aa、131—150aa和200—209aa为VP3的B细胞表位且具有临床应用前景。     

禽流感H5亚型病毒血凝素基因的表达和抗原性分析

参考已发表的Guangdong/96/1(H5N1)基因序列设计引物,用鸡胚扩增中国农业科学院哈尔滨兽医研究所国家禽流感参考实验室保存的病毒,收集尿囊液,提取病毒RNA,经RT-PCR扩增HA基因,将PCR产物平端克隆到pMD18-T中,经酶切、PCR及测序鉴定后,定向亚克隆到pET-30a表达载体中。重组子经酶切和测序鉴定为正确后,用IPTG诱导表达,SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳和薄层扫描分析重组蛋白的表达情况。重组蛋白r5HA经Ni-NTA His.Bind Resins纯化,并复性,用Western Blotting分析重组蛋白的抗原性。结果表明:表达产物大小约为65 ku,主要存在于包涵体中,表达量约占总蛋白的30%;同时,表达的重组蛋白具有较好的抗原性和特异性,可以用作检测H5亚型禽流感病毒抗血清的捕获抗原。     

猪细小病毒结构蛋白VP2主要抗原表位区基因的克隆及原核表达

本文参照GenBank发表的猪细小病毒结构蛋白VP2基因序列,设计一对引物,通过PCR方法扩增出一段包含VP2主要抗原表位编码区的片段,产物克隆到pGEM-T载体上,酶切后插入原核表达载体pET-32(a)的T7启动子下游,构建的重组质粒pET-VP2经IPTG诱导,在大肠杆菌BL21(DE3)中获得了高效表达。SDS-PAGE结果显示,表达产物分子量为39.1KDa,主要以包涵体形式存在。BandScan分析,表达量约占菌体蛋白的65.2%。表达产物用His亲和层析柱纯化。Western blotting结果显示,该种蛋白能与阳性血清发生特异性反应。结果说明,该重组蛋白具有抗原性,可以作为鉴别诊断用抗原。     

犬瘟热病毒截短P蛋白的表达及纯化

为获得犬瘟热病毒(CDV)野毒株截短磷蛋白(aa232～507),以Asia 1型CDV-PS为基础,经PCR扩增得到P(aa232～507)基因,插入原核表达载体pEASY~R-Blunt E1中,构建重组原核表达载体pEASY~R-Blunt E1-CDV-P;将重组质粒转化到BL21感受态细胞中进行原核表达并对诱导条件进行优化;超声破碎最佳条件下的诱导产物经离心后对重组蛋白进行可溶性分析,随后用镍柱对重组截短P蛋白进行纯化并用SDS-PAGE和Western blot进行鉴定。结果显示:重组P蛋白大小约37 kDa,在IPTG终浓度0.1 mmol/L,诱导时间为8 h时,表达量最高;重组P蛋白以包涵体形式存在,经SDS-PAGE和Western blot鉴定,成功纯化出重组截短P蛋白;重组P蛋白具有良好的免疫反应性。本研究成功制备出CDV-PS截短P蛋白,为进一步P蛋白抗原表位的研究和CDV抗体诊断方法的研发奠定基础。     

赤羽病病毒N蛋白单克隆抗体的制备

为制备赤羽病病毒(AKAV)N蛋白的单克隆抗体(MAb),本实验利用原核表达系统表达、纯化的重组N蛋白免疫BALB/c小鼠,三免后取小鼠脾淋巴细胞与SP2/0细胞融合,并以纯化的重组N蛋白为包被抗原,通过间接ELISA筛选出1株稳定分泌抗AKAV N蛋白的MAb杂交瘤细胞株IIG5,检测结果显示IIG5为IgG1/κ链。间接免疫荧光结果显示,IIG5与AKAV感染细胞呈阳性反应,与茨城病病毒、中山病病毒以及蓝舌病病毒1型均呈阴性反应,特异性较好。Western blot结果显示,IIG5能够识别重组的以及AKAV感染细胞中的N蛋白。本研究结果为AKAV检测方法的建立及相关研究奠定基础。     

布鲁菌外膜蛋白Omp31原核表达及抗原性分析

克隆羊布鲁菌的外膜蛋白Omp31基因,在大肠埃希菌中表达、纯化,并对Omp31蛋白的抗原性进行分析。以羊布鲁菌的染色体DNA为模板,扩增Omp31基因,双酶切后克隆至pET32a上,在大肠埃希菌ER2566(DE3)中诱导表达,组氨酸结合树脂柱纯化,Western blot鉴定Omp31蛋白的抗原性。将Omp31克隆至载体pET32a,提取的重组质粒经PCR鉴定、双酶切鉴定和测序分析确定目的基因成功插入到了克隆载体中。将重组质粒转化于大肠埃希菌ER2566(DE3)中表达获得HIS融合蛋白,SDS-PAGE分析证明,表达产物为43 ku的融合蛋白。Western blot结果表明,表达的蛋白具有与布鲁菌外膜蛋白相同的抗原性。     

鸭肠炎病毒NP蛋白的原核表达及间接ELISA方法的建立

设计一对特异性引物扩增出鸭肠炎病毒(DEV)核衣壳蛋白(NP)基因,并将其定向插入到原核表达载体pET32a上,构建了NP基因的原核表达载体pET-NP;将重组载体pET-NP转化表达宿主菌BL21后,经SDS-PAGE分离后行Western blot显示,获得的表达产物具有良好的免疫原性;应用His.Bind亲和层析柱纯化重组NP蛋白,并以此作为包被抗原,初步建立了检测鸭肠炎病毒抗体的iNP-ELISA;经方阵滴定确定,重组蛋白抗原的最佳包被浓度为5.0μg/L,血清最佳稀释度为1∶80,阳性判定标准为:待检血清OD405值≥1.2,且待检血清OD405和阴性血清OD405的比值≥2.0;应用iNP-ELISA对450份鸭血清样本进行检测,结果iNP-ELISA与全病毒包被的iDEV-ELISA符合率达90.9%。