甘蓝型油菜BnERF104超表达增强了转基因拟南芥对核盘菌的抗性

根据拟南芥乙烯响应因子AtERF104的序列设计保守引物,从甘蓝型油菜品种中双9号中克隆到AtERF104的同源基因BnERF104。序列分析表明BnERF104蛋白含有一个典型的ERF domain保守结构域,属于乙烯响应转录因子ERF家族的成员。甘蓝型油菜用核盘菌(Sclerotinia sclerotiorum)接种6h后,BnERF104基因被诱导显著上调表达。BnERF104基因在拟南芥中的超表达提高了病原相关蛋白(PR)防御素PDF1.2和几丁质酶ChiB基因的表达量,显著增强了对腐生营养型真菌核盘菌的抗性。     

甘蓝型油菜异分支酸合酶基因的克隆及信号通路相关基因的诱导表达

为了解异分支酸合酶1(ICS1,水杨酸合成的限速酶)在甘蓝型油菜抗病过程中的功能,以甘蓝型油菜耐菌核病品种宁RS-1为材料,在核盘菌侵染时,研究甘蓝型油菜ICS1基因和水杨酸信号通路相关基因的诱导表达。首先利用同源序列法克隆得到宁RS-1中ICS1基因的c DNA序列,命名为Bn ICS1。Bn ICS1序列全长1 719bp,编码572个氨基酸残基,含有1个分支酸结合域。表明油菜中也存在异分支酸途径。接种核盘菌前、后及不同时期荧光实时定量PCR结果发现Bn ICS1在核盘菌接种后6hpi(接种后6h)表达量升高,但是24hpi后降低;而MPK4基因的表达量在6hpi降低,24hpi后升高,说明SA合成先是被核盘菌诱导,但随后又被抑制。EDS5基因和PR1基因表达量从接种后6hpi持续升高,而PDF1.2基因的表达量不断降低,说明SA信号通路最终受核盘菌诱导形成病斑,而茉莉酸途径及其诱导的植物防御反应受到抑制。     

核盘菌Ss160的基因克隆与功能初探

由核盘菌（Sclerotinia sclerotiorum）引起的菌核病是油菜等十字花科作物的重要病害，对油菜的产量品质造成严重影响。本研究基于转录组数据筛选到一个核盘菌基因Ss160 (Sscle04g035160)，发现Ss160在接种油菜的核盘菌中高度表达。生物信息分析表明该基因具有信号肽，且序列在真菌界高度保守。亚细胞定位显示Ss160无特异性的定位，烟草叶片瞬时表达Ss160在核盘菌离体叶接种实验中病斑扩展显著小于表达空载体的和野生型烟草叶片，暗示异源表达Ss160能够提高植物的菌核病抗性。基于酵母系统的体外实验证明Ss160具有转录激活能力。该研究结果为后续Ss160在核盘菌-植物互作中功能机制的研究提供基础，也为油菜菌核病的研究提供借鉴和参考。     

大白菜叶片响应菌核病侵染的转录组分析

由核盘菌引起的大白菜菌核病是严重危害十字花科蔬菜品质和产量的病害之一。为深入研究菌核病抗病机制提供候选基因，从分子水平探索核盘菌侵染后大白菜的转录水平变化情况，以抗菌核病自交系H72和易感自交系Y26为材料，利用转录组测序技术分析抗感材料在接种核盘菌后不同时间的差异基因。结果表明，转录组测序共获得121.77 Gb的clean data，对原始测序数据进行过滤，各样品clean data均达6 Gb以上，Q₂₀介于97.21%～97.99%之间，平均值为97.61%,Q₃₀介于92.59%～93.98%之间，平均值为93.20%，表明测序质量较好，可以用于后续分析。接种的抗感材料在36、48 h的共同差异表达基因分别为13、11个，去除各接种点共同差异表达的基因，共获得18个差异表达基因。依据基因功能注释，筛选到11个防御反应相关基因，其中转录因子MYB34上调表达，乙烯响应因子ERF003下调表达，ERF003可能负向调控大白菜菌核病的侵染；生长素早期响应基因GH3.3、病程相关蛋白TLP1均上调表达；此外，F-box、氨基酸转运酶ANT1...     

向日葵谷胱甘肽-S-转移酶基因的克隆及抗病功能研究

为探讨谷胱甘肽-S-转移酶(GST)基因在向日葵抗病机制中的作用,在核盘菌诱导向日葵转录组文库的基础上从向日葵耐病品种龙食葵2号中克隆了1个GST的c DNA序列,并进行了表达和功能分析。结果表明:该基因开放阅读框为675bp,编码224个氨基酸残基,分子量为55.45k D,等电点为5.16,命名为Ha GSTU1(Gen Bank登录号为KR071872);Ha GSTU1蛋白属于GST的Tau家族,推测是一种无信号肽的细胞质蛋白,其N端结构域包含结合GSH的G位点,C端结构域包含特异结合底物的H位点;Ha GSTU1与一个橡胶树GST蛋白的亲缘关系最近,氨基酸序列的相似性为72%。实时荧光定量PCR结果显示,该基因在叶中表达量最高,其次是花、根、种子和茎,在盘中的表达量最低;干旱、盐、草酸、核盘菌及其代谢物均能诱导向日葵Ha GSTU1基因的表达量出现显著变化。利用农杆菌介导法将该基因导入烟草,提高了转基因烟草叶片对核盘菌的抗性。对抗性株系烟草GST和谷胱甘肽过氧化物酶(GPX)活性测定发现,转基因烟草叶片中GST和GPX酶活性较野生型提高约2倍,并随着接菌时间的延长,两种酶活性显著升高。初步推断Ha GSTU1具有抗核盘菌的功能。     

拟南芥AtTrx5增强植物菌核病的抗性研究

核盘菌是危害十字花科作物生产的重要病原菌。核盘菌诱导寄主产生过量活性氧（ROS），造成寄主细胞死亡，硫氧还蛋白（Trx）在寄主抗氧化过程中起重要作用。筛选并鉴定硫氧还蛋白（Trx），分析其与核盘菌抗性的关系，将为植物抗菌核病育种提供基因资源。本研究通过生物信息学及转录组数据分析，从拟南芥中筛选到一个关键Trx基因AtTrx5。AtTrx5与甘蓝型油菜BnaA08g04320D的亲缘关系最近，氨基酸相似性为85%。油菜同源基因Trx5表现出上调表达。AtTrx5超表达植株在接种核盘菌24 h后的菌斑面积相比野生型（WT）减小30%～39%，而AtTrx5基因T-DNA突变体的菌斑面积比WT增加39.2%。在侵染过程中超表达转基因拟南芥中AtTrx5的表达量均高于WT，而T-DNA突变体中AtTrx5的表达量则低于WT。DAB染色、H2O2含量、·O2-含量测定结果表明，侵染过程中拟南芥T-DNA突变体中积累的ROS高于WT，超表达转基因拟南芥中积累的ROS少于WT。     

人工microRNAs干扰At3A06基因增强了拟南芥对菌核病的敏感性

基于本研究室自主开发的油菜防御cDNA芯片分析结果,油菜基因Bn3A06受菌核病诱导后特异上调表达。序列比对发现,该基因与拟南芥基因At3A06高度同源,后者编码289个氨基酸,功能未知。本研究用花序浸染法将At3A06基因的人工微RNA(amiRNA)干扰载体(该载体包含一个除草剂草胺磷抗性基因)转化拟南芥。经草胺磷筛选获得3株T1代转基因植株,PCR检测均为阳性;荧光定量PCR检测表明,与野生型对照相比,3个转基因植株的At3A06基因的表达量均显著降低;对其T2代进行菌核病抗性鉴定,结果显示转基因株系对菌核病的敏感性均显著增强(P0.05)。推测At3A06基因可能参与了植物的防御反应,与植株对核盘菌抗性相关。     

甘蓝型油菜-核盘菌酵母双杂交cDNA文库构建及BnJar1互作蛋白筛选

油菜与核盘菌相互作用的过程中，JA（茉莉酸）合成相关基因表达量升高，但是JA信号传递却受到了抑制，推测核盘菌分泌的效应蛋白可能直接或间接作用于JAR1蛋白，使其活性降低，从而抑制依赖JA途径的油菜防御系统。前期通过转录组测序获得了差异表达基因BnJar1全长序列，为进一步揭示BnJar1基因参与油菜-核盘菌相互作用过程的机理，本研究对BnJAR1蛋白进行生物信息学分析和预测，构建了核盘菌-油菜互作表达基因酵母文库，并以BnJar1作为诱饵蛋白对文库进行酵母双杂交筛选，获得了5个来自油菜的互作蛋白：丙二烯氧化物环化酶2(BnAOC2)、COP9信号复合物（BnCOP9）、4a-羟基四氢生物蝶呤脱水酶（BnDcoH）、腈水解酶2(BnNIT2)和茎特异性蛋白（BnTSJT1）;2个来自核盘菌的互作蛋白：MFS结构域蛋白（SsMFS）和Rho3 GTP酶（SsRho3）。相关结果为研究油菜-核盘菌的相互作用，挖掘致病或抗病相关基因，进一步解析其机理奠定了基础。     

油菜F-box-LRR基因全基因组鉴定与核盘菌诱导应答分析

由核盘菌引起的菌核病是一种重要的真菌性病害,筛选菌核病抗病基因对抗病育种具有重要意义。F-box基因多参与植物抗逆反应,LRR作为抗病基因的重要结构域,在植物抗病防卫中起着重要的作用。本研究通过生物信息学方法在甘蓝型油菜基因组中对F-box-LRR基因进行了全基因组鉴定,基于已发表的中双11组织表达数据以及油菜不同品种中油821（抗病）和Westar（感病）接种核盘菌前后的转录组数据,对可能响应核盘菌诱导的BnF-box-LRR基因进行筛选,并结合荧光定量PCR进行验证。共鉴定到161个BnF-box-LRR基因,从系统进化树上可分为4个亚类（FBXLRR1,FBXLRR2,FBXLRR3和FBXLRR4）,其中第四亚类FBXLRR4在蛋白保守序列分布以及基因结构方面,与其它三个亚类具有较大差异,且与拟南芥参与植物抗逆的同源基因聚为一类,因此推测该分支可能主要参与植物胁迫响应。表达分析表明FBXLRR4家族基因在根和叶中有较高的表达水平,且在核盘菌诱导后具有明显的表达变化,暗示这些基因可能参与油菜菌核病抗性功能。     

利用CRISPR/Cas9系统定向改良水稻稻瘟病抗性

【目的】CRISPR/Cas9基因编辑技术是作物遗传改良的有效工具。本研究通过对水稻Pita、Pi21和ERF922稻瘟病相关基因进行定点编辑,以期获得能够稳定遗传的抗稻瘟病水稻材料。【方法】利用CRISPR/Cas9基因编辑技术,以Pita、Pi21和ERF922为靶基因,构建共编辑载体pC1300-2×35S::Cas9-g~(Pita)-g~(Pi21)-g~(ERF922),用农杆菌转化长粒粳稻恢复系L1014,筛选获得稳定遗传的纯合突变体用于稻瘟病抗性鉴定。【结果】在T_0代转基因株系中,Pita、Pi21和ERF922突变频率分别为75%、85%和65%,突变基因型多为双等位突变。筛选到的不含T-DNA成分的T_1代能够稳定遗传给T_2代,并从中获得Pi21单突变纯合株系及Pita、Pi21和ERF922的三突变纯合株系。稻瘟病抗性鉴定结果表明,与野生型相比,突变株系的抗性显著提高。同时,接种后纯合突变体株系内水杨酸、茉莉酸和乙烯等信号转导途径相关基因的表达量均上调。据此,我们推测纯合突变株系对稻瘟病的抗性增强可能与其对稻瘟病菌的响应被激活有关。【结论】利用CRISPR/Cas9技术获得了能够稳定遗传和具有较高稻瘟病抗性的纯合突变株系,为水稻稻瘟病抗性改良提供了良好的材料。     

油菜与核盘菌互作分子机理研究进展

菌核病是由核盘菌（Sclerotinia sclerotiorum (Lib.) de Bary）引起的真菌性病害,每年导致油菜（Brassica napus L.）产量损失10%-20%,是制约我国油菜生产最主要的病害。培育抗（耐）病油菜品种是防治油菜菌核病最为经济有效的途径。本文主要综述了近五年油菜-核盘菌互作分子机制的研究进展。研究表明：（1）核盘菌侵染寄主早期存在活体营养型阶段;（2）草酸提供的酸性pH,而非草酸本身,是核盘菌的必需致病因子;（3）核盘菌有效地利用效应蛋白抑制寄主的抗病反应或者诱导寄主细胞坏死以帮助其侵染;（4）油菜对菌核病的抗性具有中等遗传力,为数量抗性;（5）病原相关分子模式（pathogen-associated molecular pattern, PAMP）引发的免疫反应（PAMP-triggered immunity, PTI）是油菜对核盘菌产生数量抗性的主要根源;（6）功能基因组学研究表明抗（耐）病油菜材料防卫反应更加剧烈,能有效调控细胞内的氧化还原平衡状态,及时清除过量活性氧（reactive oxygen species,ROS）的积累,抑制细胞死亡。核盘菌-油菜互作分子机制的研究将有助于指导油菜抗菌核病育种。     

对甘蓝与大白菜种间杂交合成的甘蓝型油菜的研究

通过甘蓝与大白菜种间杂交获得了５０个甘蓝型油菜杂交组合。田间抗性鉴定结果：１７个组合抗寒、３８个组合耐热、４个组合抗病毒病、４２个组合抗霜霉病、３９个组合避开了菌核病。合成组合中正常可育的组合２４个,这些品系的自交不亲和性、生物学特性及抗逆性都与的它们的双亲尤其是母本甘蓝相似。正常可育的品系中１９个自交不亲和,与胞质不育则度的３个合成品系中没有找到恢复基因,但它们是理想保持系,其后代不育性彻底而稳     

甘蓝型油菜BnTLP1基因的菌核病抗性研究

前期发现甘蓝型油菜类甜蛋白基因BnTLP1在菌核病抗性品种中的表达丰度高,为探究和解析其作用机制,通过叶片接种核盘菌,对拟南芥BnTLP1过表达转基因株系、野生型对照和突变体tlp1-1之间的抗菌核病效果进行分析。结果表明：过表达BnTLP1拟南芥的病斑面积显著小于野生型对照,而tlp1-1病斑扩展大于对照,即BnTLP1正调控菌核病抗性。亚细胞定位表明BnTLP1定位于细胞膜和细胞核,暗示其不仅在细胞膜发挥抑菌功能,而且在核内行使其它功能。不同防御反应信号通路的标志基因表达分析表明,茉莉酸/乙烯途径可能在早期参与了BnTLP1介导的菌核病抗性。     

甘蓝型优质杂交油菜杂23的选育及鉴定

杂２３是利用雄性不育与单、双低优质油菜品种资源杂交、转育测交筛选和连续回交定向培育而成的甘蓝型三系杂交种，具有优质、高产、抗（耐）菌核病和适应性广等优良特性，２０００多ｈｍ２大田生产示范取得了显著的增产效果。     

油菜菌核病致病机理的研究 Ⅶ.抗(耐)病性的组织病理学

本文切片分析了油菜菌核病抗(耐)病性的组织病理学。结果表明:在不同感病程度的甘蓝型油莱品种(系)上菌核病菌的侵染和扩展特性包括附着胞类型、病菌在组织内的扩展以及寄主的能动反应诸方面均存在显著不同。     

甘蓝型油菜类甜蛋白激酶BnTLK1与真菌病害抗性相关

类甜蛋白（thaumatin-like protein，TLP）是病程相关蛋白第5家族蛋白，在部分物种中发现有的TLP蛋白C端融合了激酶结构域。为探讨该类融合基因在植物与病原菌互作中的作用，通过生物信息学方法在甘蓝型油菜中鉴定到一个N端具有TLP结构域，C端为富含丝氨酸苏氨酸受体类激酶结构域的基因（BnTLK1）并成功克隆该基因。序列分析表明BnTLK1第254至276个氨基酸具有典型的跨膜结构，三级结构形成两个明显独立的TLP和激酶结构域。转录组数据显示，该基因在多个组织中表达丰度较低，此外，相比于菌核病感病品种Westar，高抗品种ZY821中其表达丰度较高，且核盘菌诱导后表达明显上调，表明该基因可能参与油菜抗菌核病过程。为了验证BnTLK1对核盘菌等真菌的影响，通过原核表达系统成功表达BnTLK1蛋白，在0.4 mmol/L IPTG和17℃低温条件下诱导培养，最终获得BnTLK1可溶性蛋白，抑菌实验发现BnTLK1能够抑制核盘菌和灰霉菌丝的生长。     

甘蓝型油菜ＨＭＧ基因家族的生物信息学分析

为研究甘蓝型油菜HMG（high mobility group）基因家族的起源、进化和功能,利用生物信息学方法对甘蓝型油菜和其近缘物种HMG基因家族进行鉴定,并对其进化、基因结构、组织表达、直系旁系同源基因进行系统分析。在甘蓝型油菜中鉴定到45个HMG家族成员,并根据进化树和基因结构将其分成5组。染色体定位发现,19条染色体中有18条染色体有HMG基因,说明该家族基因分布较广泛。在甘蓝型油菜与甘蓝、白菜和拟南芥分别鉴定到47、45和26个直系同源基因对。在甘蓝型油菜中鉴定到28个旁系同源基因对,而在其它3个物种中则比较少,这可能与甘蓝型油菜的多次基因组加倍有关。对45个甘蓝型油菜BnHMG基因在根和叶中的表达模式进行分析,结果显示,大多数基因在根和叶中均有表达,且呈现出不同的表达模式。     

草酸脱羧酶的性质及应用

草酸脱羧酶（Oxalate decarboxylase,OXDC）是一种包含Mn2+的多聚酶,属于cupin超家族,能够在没有辅因子的条件下催化草酸分解为甲酸和CO2。该酶已在农业、工业和医学诊断中得到广泛的应用。本文综述近几年来OXDC在结构、功能和实际应用方面的研究,重点讨论了其在油菜抗菌核病方面的作用和优势,为油菜抗菌核病的研究提供参考。